不同產(chǎn)地初加工杜仲葉hplc指紋圖譜研究

不同產(chǎn)地初加工杜仲葉hplc指紋圖譜研究

杜仲葉是杜仲科植物的杜仲葉。它對肝、腎、肌肉和骨骼都有很好的療效。這是一種具有兩種藥物作用的中藥。它含有綠原酸和其他苯丙素，如紫微酸、景尼平素酸、景尼平素酸、桃葉珊瑚酸、二棕櫚醇糖苷和黃酮類。但杜仲葉采摘鮮運困難,因此其產(chǎn)地初加工方式,直接影響到藥材的質(zhì)量及深度開發(fā),其初加工方式的選擇也成為GAP實踐中的關(guān)鍵問題之一?！吨袊幍洹?010年版一部中規(guī)定杜仲葉的產(chǎn)地初加工方式為曬干或低溫烘干。但其理論依據(jù)是什么,以上2種技術(shù)是否為最佳初加工方式,不同初加工方式對杜仲葉有效成分的影響究竟有多大,這些問題都亟待解決。鑒于此,本實驗以杜仲葉為研究對象,通過HPLC指紋圖譜的建立和綠原酸、京尼平苷酸成分量及醇浸出物量的測定,首次系統(tǒng)比較分析了不同初加工方式對杜仲葉品質(zhì)的影響,以期篩選出適于杜仲葉藥材的產(chǎn)地初加工技術(shù),為提高和控制杜仲葉的質(zhì)量奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。1試劑與儀器LC—10ATVP高效液相色譜儀(配備SPD—M10AVP光電二極管陣列檢測器和CLASS-VP色譜工作站,日本島津);AE240型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);KQ3200型超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司);SQ2119B型多功能食品粉碎機(上海帥佳電子科技有限公司);格蘭仕G8023YSL—V1型微波爐(佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司);DHG—9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實驗設(shè)備有限公司);SK2103電磁爐(美的集團)。對照品綠原酸(批號110753-200413,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)、京尼平苷(批號110749-200613,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)、咖啡酸(批號110885-200302,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)均購自中國藥品生物制品檢定所,桃葉珊瑚苷(批號MUST-11091601,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)、松脂醇二葡萄糖苷(批號MUST-12021001,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)、京尼平苷酸(批號MUST-11121502,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)、蘆丁(批號MUST-11040302,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)均購自成都曼思特生物科技有限公司。乙腈(色譜純,美國Tedia公司);磷酸(色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心);水為雙蒸水;其余試劑均為分析純。杜仲葉鮮品于2012年7月采自湖南省長沙市含浦鎮(zhèn),經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所謝昭明研究員鑒定為杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的新鮮葉。2方法2.1采用不同的加工方法對杜仲葉樣品進行制備通過參考文獻(xiàn)方法及預(yù)試驗篩選,本實驗采用了下述幾類初加工方式。2.1.1自然干燥和干燥取杜仲葉鮮品2份,每份50g,分別于室內(nèi)通風(fēng)處自然陰干、日光下曬干,備用。2.1.2杜仲葉的蒸制于直徑56cm不銹鋼鍋內(nèi)加1.5L蒸餾水,開始沸騰后5min,取杜仲葉鮮品3份,每份50g,平鋪于不銹鋼制篦子上分別蒸5、10、20min,取出擦干,再自然陰干備用。2.1.3制泡沫取杜仲葉鮮品5份,每份50g,分別于沸水中燙漂1、2.5、5、10、20min,取出擦干,再自然陰干備用。2.1.4不同溫度對制備嘴唇的影響取杜仲葉鮮品9份,每份50g,置于直徑為56cm的炒鍋內(nèi)在電磁爐上分別于100、130、160℃下炒制,每個溫度下各炒1、3、5min,取出,自然陰干備用。2.1.5加熱溫度對培養(yǎng)熱電鼓風(fēng)干燥設(shè)備的影響取杜仲葉鮮品9份,每份50g,分別平鋪于瓷托盤上,放入電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi),分別于80、100、120℃下加熱,每個溫度下各加熱10、20、30min,取出,自然陰干備用。2.1.6地位加熱的確定取杜仲葉鮮品9份,每份50g,分別平鋪于微波爐玻璃托盤上在低、中、高火力加熱,不同火力下各加熱1、2.5、5min,取出,自然陰干備用。將以上不同初加工方式制得的樣品及杜仲葉鮮品進行編號,具體見表1。2.2hplc-keyhook-keyphone特征的構(gòu)建2.2.1u3000梯度洗脫時間色譜柱為PromosilC18柱(250mm×4.6mm,5μm);流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液,梯度洗脫時間為75min:0~40min,6%~16%乙腈;40~75min,16%~28%乙腈;掃描波長200~400nm,檢測波長208nm,體積流量0.8mL/min,柱溫25℃,進樣量10μL。2.2.2對照品儲備液制備分別精密稱取桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、咖啡酸、松脂醇二葡萄糖苷和蘆丁對照品適量,制成對照品儲備液冷藏備用;再分別吸取一定量對照品儲備液,加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為桃葉珊瑚苷0.61mg/mL、京尼平苷酸0.62mg/mL、綠原酸0.62mg/mL、京尼平苷0.62mg/mL、咖啡酸0.49mg/mL、松脂醇二葡萄糖苷0.60mg/mL和蘆丁0.64mg/mL的混合對照品溶液。2.2.3超聲處理法參照文獻(xiàn)所述方法,分別取不同初加工方式制得的杜仲葉樣品適量,粉碎后過3號篩。取過篩粉末約1g,精密稱定,分別置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇25mL,稱定質(zhì)量,超聲處理40min,放冷。再稱定質(zhì)量,用50%甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,0.45μm濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得供試品溶液。新鮮杜仲葉取約4.1g(以干燥品計1g),直接剪碎后同法處理。2.2.4儀器精密度試驗精密吸取S31供試品溶液,按照“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次,記錄色譜圖,計算22個主要共有峰保留時間的RSD均小于0.37%,峰面積的RSD均小于2.65%,表明儀器精密度良好。2.2.5分析結(jié)果和分析精密稱取S31樣品6份,按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,按照“2.2.1”項下色譜條件進樣分析,記錄色譜圖,計算22個主要共有峰保留時間的RSD均小于0.55%,峰面積的RSD均小于3.15%,表明該實驗采取的分析方法和提取工藝具有可靠性和穩(wěn)定性。2.2.6溶液穩(wěn)定性試驗精密吸取S31供試品溶液,按照“2.2.1”項下色譜條件在0、2、4、8、12、24h進樣分析,記錄色譜圖,計算22個主要共有峰保留時間的RSD均小于0.46%,峰面積的RSD均小于2.82%,表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。2.3綠色原酸和圓形氨基酸的測定2.3.1鉻條件與“2.2.1”所述的鉻條件相同2.3.2高效液相色譜法分別精密量取“2.2.2”項下綠原酸、京尼平苷酸對照品儲備液適量,加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為京尼平苷酸0.62mg/mL、綠原酸0.62mg/mL的對照品溶液。分別精密吸取綠原酸對照品溶液2、4、8、12、16、20μL注入高效液相色譜儀,測定。分別精密吸取京尼平苷酸對照品溶液2、4、8、12、16、20μL注入高效液相色譜儀,測定。以對照品進樣量為橫坐標(biāo)(X),相應(yīng)色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進行線性回歸,得回歸方程:綠原酸Y=2×106X+854174,r=0.9995;京尼平苷酸Y=600050X+267178,r=0.9993,表明綠原酸和京尼平苷酸均在1.24~12.4μg與峰面積成良好的線性關(guān)系。2.3.3儀器精密度試驗精密吸取S31供試品溶液,按照“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次,記錄峰面積,計算綠原酸、京尼平苷酸峰面積的RSD分別為1.05%、1.32%,表明儀器精密度良好。2.3.4重復(fù)性試驗精密稱取S31樣品6份,按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,按照“2.2.1”項下色譜條件進樣分析,記錄峰面積,計算綠原酸、京尼平苷酸峰面積的RSD分別為1.25%、1.87%,表明該方法重復(fù)性良好。2.3.5供試品溶液穩(wěn)定性精密吸取S31供試品溶液,按照“2.2.1”項下色譜條件在0、2、4、8、12、24h進樣分析,記錄峰面積,計算綠原酸、京尼平苷酸峰面積的RSD分別為1.12%、1.46%,表明表明供試品溶液中綠原酸、京尼平苷酸在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。2.3.6加樣回收率試驗精密稱取已測定的S31樣品6份,每份0.8g,分別精密加入綠原酸對照品6.0mg和京尼平苷酸對照品5.2mg,按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,依法測定,結(jié)果綠原酸、京尼平苷酸的平均回收率分別為98.2%、102.3%,RSD分別為1.17%、1.04%。2.3.7樣品測定分別精密吸取各批杜仲葉的供試品溶液10μL,按照“2.2.1”項下色譜條件進行測定,計算樣品中綠原酸和京尼平苷酸的量。2.4醇溶解浸出物溶液ros取各批杜仲葉樣品,粉碎,過3號篩,精密稱定供試品約2g(杜仲葉鮮品取約8g,直接剪碎),置250mL錐形瓶中,精密加水100mL,按《中國藥典》2010年版一部附錄XA醇溶性浸出物測定法(熱浸法)測定,用稀乙醇作溶劑,以干燥品計算樣品中醇溶性浸出物量。3結(jié)果3.1指紋圖譜的相似度分析取38批杜仲葉樣品,按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,按照“2.2.1”項下色譜條件進樣分析,記錄色譜圖,得到的HPLC圖譜以AIA格式依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A)版》軟件,以S1號樣品圖譜作為參照,進行圖譜匹配,對各樣品色譜圖的原始數(shù)據(jù)文件進行分析,確定了22個主要共有色譜峰,并進行了相似度計算,38批杜仲葉樣品的色譜圖見圖1?；旌蠈φ掌泛投胖偃~樣品的共有模式的HPLC色譜圖見圖2-A、B。指認(rèn)其中7個共有峰,分別為桃葉珊瑚苷(1號峰)、京尼平苷酸(2號峰)、綠原酸(7號峰)、京尼平苷(10號峰)、咖啡酸(11號峰)、松脂醇二葡萄糖苷(14號峰)和蘆丁(17號峰)。3.2杜仲葉的聚類分析利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A)版》軟件將得到的38批杜仲葉樣品的22主要共有色譜峰的峰面積導(dǎo)入SPSS16.0軟件,然后采用層次聚類分析方法中的Q型聚類法,可將樣品劃分為3大類(圖3),即S38為1類,S9、S10、S20、S21、S22為1類,余下的其他樣品為1類。3.3不同初始加工方式對杜仲葉生物量分配的影響取38批杜仲葉樣品,按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,按照“2.2.1”項下色譜條件進樣分析,計算綠原酸和京尼平苷酸的量;按照“2.4”項下方法對各批樣品中醇溶性浸出物的量進行測定。為便于對數(shù)據(jù)進行分析,根據(jù)3組數(shù)據(jù)指標(biāo)的重要性給出指標(biāo)的權(quán)重系數(shù),綜合評分后再比較。依據(jù)3指標(biāo)的相對重要性構(gòu)成的兩兩比較判斷優(yōu)先矩陣見表2。對比打分“1”代表同等重要(即兩者對綜合評分貢獻(xiàn)相同);“2”代表同等重要與略為重要程度的中間值;“3”代表略為重要(即其中1個比另1個對綜合評分貢獻(xiàn)稍大)。權(quán)重系數(shù)計算公式如下:aim為兩兩比較矩陣第i行第m列的元素值,m為指標(biāo)數(shù)目,此處m=3;w′為初始權(quán)重系數(shù),w為歸一化權(quán)重系數(shù);λmax為矩陣的最大特征根;aij為兩兩比較矩陣第i行第j列的元素值;CR為隨機一致性比例,CI為一致性指標(biāo),RI為平均隨機一致性指標(biāo),此處RI為0.58確定的權(quán)重系數(shù)分別為綠原酸0.5396、京尼平苷酸0.2970、醇浸出物0.1634。經(jīng)一致性檢驗,判別矩陣的一致性比例CR=0.008<0.10,表明權(quán)重系數(shù)的確定合理。綜合評分=100×[(樣品綠原酸量/綠原酸最大值)×0.5396+(樣品京尼平苷酸量/京尼平苷酸最大值)×0.2970+(樣品浸出物量/浸出物量最大值)×0.1634]。綜合評分結(jié)果見表3。綜合評分較高的,說明樣品質(zhì)量較好,反之則較差。通過表3顯示結(jié)果可以看出,80℃烘10min(S20)、20min(S21)、30min(S22)及燙10min(S9)、20min(S10)的綜合評分均較低,尤其是綠原酸的量普遍較低,說明這幾種初加工方式處理的杜仲葉樣品質(zhì)量較差,圖2聚類分析結(jié)果也顯示歸為1類。而蒸制效果普遍較好;烘制方式中,100、120℃較好,炒制和微波制方法的綜合評分均較高。4杜仲葉的初加工方式及質(zhì)量檢測本實驗在首次系統(tǒng)全面考察杜仲葉不同產(chǎn)地初加工方式的基礎(chǔ)上,建立了可同時用于構(gòu)建HPLC指紋圖譜和定量檢測的高效液相色譜分析方法,對不同初加工方式的優(yōu)劣進行了比較。實驗結(jié)果表明,所建立的方法重復(fù)性好、可操作性強,比較全面、直觀地反映了不同初加工方式處理的杜仲葉質(zhì)量差異,可用于對杜仲葉藥材的定性鑒別和定量研究。實驗分別比較了甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇等提取溶劑,超聲、回流等不同提取方法,甲醇-0.1%乙酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液等不同流動相,以及DADUV200~400nm下各波長的掃描結(jié)果,表明50%甲醇超聲提取率高,且以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相,在208nm波長下檢測,圖譜基線平穩(wěn)、色譜峰較多、各個色譜峰的分離效果較好、操作簡便等特點,能夠反映出杜仲葉組分的全貌。通過比較38批不同初加工方式的杜仲葉樣品及鮮品HPLC圖譜發(fā)現(xiàn),在產(chǎn)地、品種、采收時間等因素都相同的情況下,采取不同的初加工方式制得的杜仲葉樣品成分之間既有相似性又有不同點,其中所含化學(xué)成分類別大致相同,但各種化學(xué)成分的色譜峰面積卻相差較大,整體峰面積及綠原酸、京尼平苷酸