當(dāng)歸四逆湯對(duì)balbc硬皮病小鼠皮膚組織及其cgf,gf-的影響

當(dāng)歸四逆湯對(duì)balbc硬皮病小鼠皮膚組織及其cgf,gf-的影響

系統(tǒng)硬化性（ssc）是一種多系統(tǒng)慢性疾病，具有低血管功能和結(jié)構(gòu)異常、皮膚和內(nèi)臟纖維。到目前為止，病因不明，治療困難。這是臨床上的難題。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,本病多由寒凝血瘀,痰瘀痹阻于皮膚肌肉,皮肉失養(yǎng)所致。當(dāng)歸四逆湯具有溫經(jīng)散寒,養(yǎng)血通脈的作用,我們臨床用其治療SSc效果理想。已知結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforminggrowthfactpr,TGF)β與SSc發(fā)病密切相關(guān)。為此我們建立動(dòng)物模型,以觀察該方對(duì)SSc小鼠皮膚CTGF,TGF-β含量的影響。1材料表面1.1動(dòng)物1.2組成采用博來霉素當(dāng)歸四逆湯(由當(dāng)歸9g,桂枝9g,白芍9g,細(xì)辛9g,甘草6g,通草6g,大棗4枚等組成)藥物購于仲景大藥房,經(jīng)我校藥學(xué)院檢驗(yàn)為合格產(chǎn)品。用涼水1000mL浸泡半小時(shí),大火煎開后改為小火,再煎煮半小時(shí)后過濾,而后加水再煎如上法,濃縮至用藥量。博來霉素(BLM,日本化藥株式會(huì)社,批號(hào)740130)。CTGF,TGF-β等試劑盒(均購于美國(guó)奧迪生物公司,批號(hào)201106)。1.3分析方法標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀(北京中世遠(yuǎn)達(dá)商貿(mào)有限公司),多功能彩色病理圖像分析系統(tǒng)(北京麥克奧迪圖像技術(shù)有限公司),細(xì)胞免疫組織化學(xué)定量分析系統(tǒng)(上海申騰信息技術(shù)有限公司醫(yī)療軟件分公司)。2方法2.1blm溶液的制備按照文獻(xiàn)方法,模型組和觀察組小鼠背部皮內(nèi)注射100μL(200mg·L-1)的BLM溶液,每天1次,連續(xù)3周。正常組小鼠用磷酸鹽緩沖液(PBS)0.1mL做背部皮內(nèi)注射。2.2給藥、造模及給藥量置于清潔級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室,20~24℃,SPF飼料和水飼養(yǎng),并用玉米芯墊料。實(shí)驗(yàn)前剃去小鼠背部中央?yún)^(qū)被毛,并隨機(jī)分為6組,每組12只,分別為正常對(duì)照組(正常組)、模型對(duì)照組(模型組)、當(dāng)歸四逆湯高劑量組(以下簡(jiǎn)稱高劑量組)、當(dāng)歸四逆湯中劑量組(以下簡(jiǎn)稱中劑量組)、當(dāng)歸四逆湯低劑量組(以下簡(jiǎn)稱低劑量組)。造模成功(21d)后ig給藥,容量20mL·kg-1。正常組和模型組給與等容量生理鹽水,每天1次,連續(xù)3周。給藥量以20g小鼠和70kg成人按照體表面積折算(系數(shù)0.0026),其中高、中、低劑量組分別是成人用量的5,3,1倍,即39,23.4,7.8g·kg-1。各組均飲用自來水,食用SPF飼料。2.3指標(biāo)檢測(cè)2.3.1病理觀察2.3.2加味he染色切取小鼠背部注射區(qū)皮膚,固定于10%甲醛液,石蠟包埋,制片(4μm),HE染色。并用彩色病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)定皮膚厚度(表皮+真皮),每只小鼠的切片隨機(jī)取5處測(cè)皮膚厚度后,求得該小鼠皮膚厚度的均值(x珋)。2.3.3黑色核的制備用Masson三色染色,計(jì)算纖維化指數(shù)。染色的結(jié)果判定:膠原纖維呈亮綠色,肌纖維呈紅色,細(xì)胞核呈黑色。用細(xì)胞免疫組織化學(xué)定量分析系統(tǒng)將Masson染色皮膚組織切片的圖像在40倍物鏡下采集至計(jì)算機(jī)中,每只小鼠的切片隨即取10個(gè)視野,每個(gè)視野26萬像素,以亮綠色(膠原纖維)為陽性,求得陽性面積,陽性強(qiáng)度均值,將兩者相乘得膠原纖維組織化學(xué)指數(shù),計(jì)算出每只小鼠指數(shù)的均值(x珋)。2.3.4elisa法測(cè)定ctgf,tgf-的含量實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死動(dòng)物,切取小鼠背部注射區(qū)6mm×6mm大小皮組織,剪碎后與生理鹽水研磨成2%組織漿,3000r·min-1,離心10min,取部分上清液,嚴(yán)格按照試劑盒要求的操作步驟進(jìn)行,用ELISA法分別測(cè)定皮膚中CTGF,TGF-β的含量。2.4結(jié)果xs所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SPSS18.0軟件完成,所得結(jié)果以x珋±s表示。各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。方差分析前進(jìn)行齊性檢驗(yàn),采用LSD進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1各組大鼠皮質(zhì)的變化,對(duì)于正外皮層、組織BLM注射后,模型組小鼠注射部位皮膚增厚變硬,彈性差,皮毛未見生長(zhǎng);組織病理可見表皮棘層肥厚,皮下出現(xiàn)大量無定形物質(zhì),真皮層明顯增厚,膠原纖維明顯增粗、膨大,數(shù)量增多,排列緊密,均質(zhì)化等改變;真皮下層血管增粗,血管壁明顯增厚,甚至血管閉塞,毛囊顯著減少;脂肪層變薄、消失,伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。正常組未出現(xiàn)上述改變。當(dāng)歸四逆湯各組的改變較模型組為輕,膠原纖維排列較疏松,真皮層變薄,血管壁較薄,毛囊增加,脂肪層出現(xiàn),炎性細(xì)胞明顯減少,且呈一定的劑量依賴性。見圖1。3.2皮膚厚度和纖維化指數(shù)模型組的皮膚厚度和纖維化指數(shù)均明顯高于正常組(P<0.01),當(dāng)歸四逆湯高、中、低劑量組皮膚厚度和纖維化指數(shù)均顯著低于模型組,P<0.01或P<0.05。見表1。3.3對(duì)比兩組正常組與正常組兩組的血壓指標(biāo)模型組皮膚的CTGF,TGF-β含量明顯高于正常組;當(dāng)歸四逆湯高、中劑量組與模型組相比CTGF,TGF-β含量顯著降低(P<0.01)。見表2。4逆湯治療硬皮病的臨床療效中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,硬皮病屬于“皮痹”范疇,虛寒和血瘀是硬皮病過程中不可分割的兩大因素,互為因果,交織出現(xiàn);“虛寒”是致病的始因,“血瘀”是繼發(fā)病理改變;臨床上的不同證型只是“虛寒”、“血瘀”二者側(cè)重點(diǎn)不同而已。因陽氣虛衰,失于溫煦,血流澀滯不暢,氣血不能溫養(yǎng)肌膚,以致寒凝于肌膚,血阻于經(jīng)絡(luò),營(yíng)衛(wèi)周流失常而發(fā)皮痹,出現(xiàn)膚色黯褐,指(趾)端青紫,皮膚腫脹、硬化等現(xiàn)象。其本在于虛寒,其標(biāo)則為血瘀留滯。所以“溫經(jīng)散寒,通行血脈”應(yīng)該是SSc主要的治療方法。當(dāng)歸四逆湯出自《傷寒論》,具有養(yǎng)血散寒、溫經(jīng)通脈的作用。其中當(dāng)歸、白芍、大棗養(yǎng)血和營(yíng);桂枝、細(xì)辛溫經(jīng)通陽散寒;通草通利血脈。諸藥合用則可使陽氣復(fù),寒邪除,凝滯去,經(jīng)絡(luò)通暢,非常切合硬皮病之上述病機(jī)。而且有報(bào)道當(dāng)歸四逆湯對(duì)硬皮病有效率可達(dá)90%,表明本方對(duì)SSc有確切的臨床療效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,SSc典型的臨床表現(xiàn)是皮膚的增厚和纖維化。在SSc纖維化皮損中CTGFmRNA表達(dá)顯著增高。TGF-β作為重要的促纖維化細(xì)胞因子,可直接促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、膠原基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。有學(xué)者也發(fā)現(xiàn),SSc患者的成纖維細(xì)胞處于一種永久激活狀態(tài),部分是受自分泌和旁分泌的CTGF和TGF-β的影響。因此,拮抗CTGF和TGF-β可以防治纖維化而對(duì)SSc發(fā)揮治療作用。我們的實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)歸四逆湯可以降低BALB/C硬皮病小鼠皮膚組織中CTGF與TGF-β的含量,從而發(fā)揮防治皮膚纖維化的作用。實(shí)驗(yàn)還顯示,本方能減輕硬皮病模型小鼠的真皮厚度,降低硬皮病小鼠皮膚纖維化指數(shù),提示本方對(duì)硬皮病模型小鼠皮膚有軟化作用。這可能與其能降低皮膚組織中CTGF與TGF-β的含量有關(guān)。至于本方