高等植物硅轉運蛋白的吸收轉運機制

高等植物硅轉運蛋白的吸收轉運機制

0植物硅的分布及種類硅（si）是地殼中的第二個豐富元素。主要存在于sio2和硅酸鹽中，其中siso約占土壤的50%70%。在土壤溶液中,硅元素的濃度與K、Ca等營養(yǎng)元素濃度相近,約為0.1~0.6mmol/L,遠遠超過P的濃度。pH<9時,植物根系以單硅酸[Si(OH)4]的形式吸收Si,并以此形式隨蒸騰流運輸?shù)降厣喜糠帧Ｋ局泄璧闹饕嬖谛螒B(tài)為SiO2,占整株總硅量的90%~95%,木質部汁液中也主要以單硅酸形態(tài)存在。大量研究表明,硅元素在植物體內分布并不均勻,主要分布于根部表皮細胞、莖和葉鞘的外表皮、維管束和厚壁組織的細胞壁中。不同植物地上部分Si累積量不同,單子葉植物中禾本科硅含量最高,其中水稻中SiO2含量可占地上部分干重10%,燕麥、大麥和小麥約占2%~4%,通常雙子葉植物中SiO2含量都在1%以下。即使是同一種植物,由于基因型差異,地上部分硅積累量也存在差異。硅在植物生理pH下高度聚合而不溶解的特性決定了即使植物體內積累過多的硅也不會引起毒害作用。大量研究表明,硅對水稻、甘蔗、木賊等多種植物的生長都有促進作用。施硅使水稻植株有較強的直立特性,功能葉(旗葉)與莖干之間的夾角較小,因而可增強有效光截獲量,改善光合作用。施硅還有助植物克服多種生物和非生物脅迫。Ma等研究認為,Si在增強植物抗病性上的主要機制是:Si累積在表皮下面形成角質雙硅層,構成一道物理屏障,能有效阻止真菌入侵。同時,累積在葉片表皮的硅能有效減小蒸騰,從而增強植物對逆境的抗性。鑒于硅在植物體內并不參與新陳代謝,因此推測硅對植物的多種保護作用主要是通過硅在植物體不同部位累積來實現(xiàn)的,因而高效的硅吸收累積對逆境中的植物就顯得很有意義。近年來,多個Si轉運蛋白基因陸續(xù)在水稻、玉米、大麥及南瓜中鑒定出,Si吸收及轉運機制在不同植物間存在差異。以下綜述植物Si吸收特點并分析比較不同硅轉運蛋白的基因表達特點及其功能與作用機制,對進一步研究不同植物硅吸收機制有所裨益。1植物根系的硅吸收1.1根毛對地上部分的吸收磷Fohse等研究表明,當土壤中有效磷含量低時,根毛吸收的磷占根系吸收總磷量的90%,Gahoonia和Nielsen利用32P研究發(fā)現(xiàn)根毛對地上部分吸收磷總量的貢獻率越為63%。為了探明水稻根系硅吸收部位,Ma等選用水稻根毛缺陷型突變體RH2和側根缺陷型突變體RM109與野生型進行對比研究,結果表明側根是水稻吸收Si的關鍵部位,根毛卻沒有顯著貢獻。同時,Ma等采用多隔室根盒進一步證實了這一結論。1.2對土壤硅含量和轉運活性的影響在pH<9時,植物根系以不帶電的[Si(OH)4]分子形式吸收Si。研究表明,不同植物地上部分Si累積量不同,Takahashi等推測,不同植物地上部分硅積累量的差異是由于根系對Si的吸收能力不同所致。最早,Jones和Handreck觀察到Si在氣孔周圍大量沉積,認為Si是隨著蒸騰流被動運輸?shù)降厣喜糠帧aven對此表示懷疑,認為跨膜被動吸收不能解釋水稻地上部分硅含量如此高這一現(xiàn)象。Mitani等采用水培對水稻、黃瓜和番茄3種不同實驗材料進行硅吸收研究,發(fā)現(xiàn)所有供試材料根系內質體溶液的Si濃度均高于培養(yǎng)液Si濃度,而用低溫處理或添加代謝抑制劑HgCl2,2,4-DNP(2,4-二硝基苯酚)后發(fā)現(xiàn),供試材料根系內質體中Si濃度與營養(yǎng)液Si濃度相當,表明上述三種植物根系對Si的吸收是通過轉運體的主動吸收和被動擴散2種吸收途徑共同完成的;與水稻木質部汁液中Si濃度高于營養(yǎng)液Si濃度不同,黃瓜和番茄的木質部汁液中Si濃度均低于培養(yǎng)液硅濃度,這可能與黃瓜和番茄中介導Si從外液到根系皮層細胞的轉運體豐度低及缺乏從皮層細胞到木質部的卸載轉運體有關。Mitani和Ma的動力學試驗結果為,上述3種植物Si吸收Km值均為0.15mmol/L,而Vmax值差異很大,并由此認為這3種植物根系中Si的徑向轉運是由同一類轉運蛋白介導的,而不同植物根系吸收速率差異是轉運蛋白的豐度所導致。而后來的實驗證明這一推測是錯誤的,這里測得的Km值是植株體多種硅轉運蛋白共同作用的結果(水稻根系中的Si轉運蛋白OsLsi1和OsLsi2協(xié)同作用,OsLsi1屬于水通道蛋白,OsLsi2卻不是)。2采用ge的生物計算硅是海洋硅藻的必需元素。Hildebrand等在硅藻(Cylindrothecafusiformis)中鑒定出了一個編碼硅運載體的基因家族,將其中一個基因導入煙草觀測到煙草Si吸收量沒有發(fā)生變化,表明高等植物中的Si轉運蛋白不同于硅藻。為了進一步探明高等植物根系Si吸收機制,有必要通過構建突變體從基因水平上進行研究。Si與Ge是同一主族元素,研究表明植物根系不能辨別Si與Ge,推測植物對Ge吸收方式與Si相同。與Si不同的是,Ge對植物具有毒害作用,植物吸收Ge后葉片出現(xiàn)褐色斑點。水稻是最有效的Si積累植物,其積累的硅量占到地上部分干重的10%。為了明確水稻根系吸收Si機理,硅吸收缺陷突變體的篩選是非常必要的。Ma等利用Ge的這一特點將經疊氮化鈉誘變處理過的水稻在含Ge的溶液中培養(yǎng),篩選獲得一株Ge吸收缺陷型水稻突變體GR1。吸收實驗表明,GR1對Si的吸收量無論在低硅(0.15mmol/L)還是高硅(1.5mmol/L)濃度中都明顯低于野生型(WT),而對其他營養(yǎng)元素的吸收卻與野生型無差異;外液Si濃度一定時(0.15mmol/L),WT木質部汁液中Si濃度遠遠高于GR1;代謝抑制劑NaN3、2,4-DNP明顯抑制WT吸收Si,對GR1卻無影響。以上事實證明,GR1具有的Si主動吸收途徑已被破壞。GR1成為第一個被用于硅轉運蛋白研究的重要材料。3si轉運蛋白到目前為止,已從水稻、大麥、玉米和南瓜中鑒定到多個Si轉運蛋白:水稻和玉米中分別鑒定出了3個Si轉運蛋白(OsLsi1/ZmLsi1、OsLsi2/ZmLsi2和OsLsi6/ZmLsi6),Chiba和Mitani在大麥中鑒定出了2個Si轉運蛋白(HvLsi1和HvLsi2),Namiki等在南瓜中鑒定出了一個內向轉運蛋白(CmLsi1)。3.1oslsi1在水稻葉片中的表達Ma等利用水稻硅吸收缺陷突變體lsi1(lowsiliconrice1)采用圖位克隆法在水稻第2條染色體上克隆出一個cDNA全長1409bp,含有4個內含子和5個外顯子的Si轉運蛋白基因,并命名為OsLsi1。Ma等推測其編碼的蛋白有298個氨基酸。通過BLAST搜索和ClustalW分析結果表明,OsLsi1編碼的氨基酸序列包含6個水通道蛋白高度保守的跨膜區(qū)域以及2個Asn-Pro-Ala(NPA)模體,由此Ma等推斷OsLsi1屬于NOD26-like主要內在蛋白(Nod26-likemajorintrinsicprotein,NIP)。OsLsi1主要在根中表達,與根基(距根尖>10mm)相比,在根尖0~10mm內OsLsi1表達量很低,而根尖硅吸收量也比根基低很多,表明根系硅吸收部位主要為成熟區(qū)。在轉基因水稻中,由OsLsi1啟動子驅動OsLsi1基因與綠色熒光蛋白(GFP)融合表達,結果只在主根和側根中觀察到綠色熒光,而根毛中則沒有,表明OsLsi1主要在主根和側根中表達。采用免疫顯色進行亞細胞定位,結果表明Lsi1主要定位于根系外皮層和內皮層凱氏帶細胞的外側質膜上。將OsLsi1的cDNA注射進爪蟾卵母細胞,發(fā)現(xiàn)OsLsi1既有Si輸入功能也有Si輸出功能,表明OsLsi1是雙向轉運體,而在水稻根系中卻只表現(xiàn)出Si輸入功能。在等摩爾尿素與硼酸存在條件下,OsLsi1的Si轉運活性幾乎不受影響,表明OsLsi1對Si的吸收和轉運具有高度專一性。OsLsi1活性受水通道蛋白抑制劑HgCl2抑制,但不受低溫的影響。連續(xù)3天供Si,OsLsi1的表達量降至25%,干旱脅迫和ABA處理也使其表達量下調。目前,在OsLsi1啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了ABA響應元件,但是ABA是如何調控的尚不清楚。Yamaji等研究發(fā)現(xiàn),與水通道蛋白相似,OsLsi1的表達也具有明顯的晝夜周期性,在12:00—24:00表達量較高,4:00—8:00表達量較低。通過觀測OsLsi1在不同生育期的表達,Ma等發(fā)現(xiàn)開花期OsLsi1表達量急劇增強。通過分析定位、轉運活性及表達特征等可以得出,OsLsi1是水稻根系Si內向轉運蛋白,主要負責將Si從外部溶液轉運入根系細胞。3.2si基因表達為了探明水稻根系中由OsLsi1從外部溶液轉運入根系細胞的Si如何在皮層中轉運,Ma等再次利用Ge進行誘變篩選,得到突變體Lsi2(Lowsiliconrice2),采用圖位克隆方法在第3條染色體上找到1個含2個外顯子和1個內含子的OsLsi2基因。Ma等推測OsLsi2編碼的蛋白質含有11個跨膜域,由472個氨基酸組成。根據(jù)BLAST搜索和ClustalW分析推測,OsLsi2屬于陰離子轉運蛋白,與Si內向轉運蛋白OsLsi1沒有任何相似性。免疫熒光顯色結果表明,OsLsi2定位于水稻根系內、外皮層凱氏帶細胞內側質膜,而OsLsi1則定位于相應細胞的外側細胞質膜上。通過注入爪蟾卵母細胞的異源性表達實驗證明,轉運蛋白OsLsi2只具有Si輸出功能,而且其輸出Si的活性隨介質酸性的增強而減弱。與OsLsi1不同的是,水培條件下,在營養(yǎng)液中添加2,4-二硝基苯酚(DNP)、氰化羰基-3-氯苯腙(CCCP)或三氟甲氧基苯腙羰基氰化物(FCCP)等質子載體抑制劑以及用低溫處理,水稻根系Si輸出活性均被顯著抑制,證明由OsLsi2介導的Si的轉運是在質子梯度驅動下的主動運輸過程。與OsLsi1相似,OsLsi2在在根系成熟區(qū)的轉錄水平高于根尖0~10mm區(qū)段。而且Ma等發(fā)現(xiàn)連續(xù)3天供Si,OsLsi2的表達量降低25%,ABA處理亦能下調其表達量。與OsLsi1相似,OsLsi2在水稻抽穗期的表達水平也會暫時性升高,其中從圓錐花序期到抽穗期根系吸收的Si量占整個生育期總量的67%,表明OsLsi1/OsLsi2的表達量上升與水稻生殖生長期高Si吸收量相一致。鑒于OsLsi1與OsLsi2在水稻根細胞中的定位及轉運特性不同,缺失其中任何基因都會導致水稻Si吸收量急劇下降,由此推測二者在水稻Si吸收過程中具有協(xié)同作用,而這種協(xié)同作用是水稻累積Si量顯著高于其他禾本科植物的一個重要原因。3.3oslsi6在根中的表達Yamaji等通過同源性研究在水稻基因組中發(fā)現(xiàn)1個與OsLsi1相似性為77%的同源基因OsLsi6。OsLsi6含有4個內含子和5個外顯子,開放閱讀框(Openreadframe)長894bp,編碼的蛋白質有298個氨基酸。OsLsi6也屬于NIPⅢ水通道蛋白亞族,具有Si內向轉運活性。與OsLsi1不同,OsLsi6主要在葉鞘和葉片中表達,具有明顯的極性分布特征,主要分布在靠近導管一側的木質部薄壁細胞中。免疫熒光染色進一步表明OsLsi6主要定位于靠近導管一側的木質部薄壁細胞質膜上。細胞定位特征表明,Si從木質部到葉鞘和葉片組織的卸載過程中OsLsi6起著重要作用。而在地下部分,OsLsi6主要分布于根尖細胞質膜上,具有與OsLsi1相似的極性分布特征,而在成熟區(qū)(距根尖30mm)其表達急劇下降。OsLsi6雖在根尖(0~10mm)有表達,但具有Si輸出功能的OsLsi2在根尖無分布,所以OsLsi6對Si吸收并無大的貢獻,Yamaji等推測根尖表達的OsLsi6的主要功能是留在根尖區(qū)以提高根對多種脅迫的抗性,而不是將吸收的Si轉運到地上部,但OsLsi6在根中的確切作用還有待于研究。為了探明OsLsi6的功能,Yamaji等采用T-DNA插入、RNAi基因敲除等方法抑制OsLsi6表達發(fā)現(xiàn),突變體木質部汁液中的Si濃度與之前(突變前)基本沒有變化,而吐水中Si濃度顯著升高(高出之前3倍),表明抑制OsLsi6的表達不會對根系吸收Si產生影響,而是改變了木質部汁液中的Si進入葉片的途徑。水稻葉片中有2種硅化細胞:啞鈴型的硅細胞和硅化運動細胞。Yamaji等通過石炭酸-番紅染色比較了野生型和T-DNA系葉片中硅化細胞類型。野生型葉片中,啞鈴型硅細胞和硅化的運動細胞平行于葉脈整齊有序地排列;在T-DNA系中,除了啞鈴型硅細胞和硅化的運動細胞外,在葉片和葉鞘中一部分遠軸的表皮細胞也發(fā)生硅化,這在野生型葉片中不常見。掃描電子顯微鏡/X-射線能譜儀(SEM/EDX)觀察得到相同結果。這些事實表明,抑制OsLsi6的表達就改變了木質部汁液中Si向葉片特異細胞的轉運路徑,證明在地上部分OsLsi6的主要功能是負責木質部汁液中Si向葉肉組織的分配。3.4si輸入活性檢測禾本科植物都表現(xiàn)出高硅積累,盡管不同物種間硅積累量存在差異。Chiba和Mitani等利用大麥EST克隆得到與OsLsi1相似性高達81.8%的Si轉運蛋白基因HvLsi1部分序列。利用cDNA末端快速擴增(RACE)方法,從大麥根系總RNA中分離得到Hvlsi1的cDNA,其全長1344bp,編碼295個氨基酸。將HvLsi1基因導入水稻Si吸收缺陷型突變體Lsi1中,結果該突變體的Si吸收量大幅提高,說明與OsLsi1相同,HvLsi1也具有Si輸入活性。將GFP-HvLsi1融合基因轉入洋蔥表皮細胞中,結果只在細胞膜上觀察到了綠色熒光,表明HvLsi1是細胞膜定位蛋白。Mitani等通過研究玉米基因組和基因數(shù)據(jù)庫,利用PCR技術從玉米根系cDNA中分離出ZmLsi1,推導其編碼的蛋白由295個氨基酸組成,并發(fā)現(xiàn)ZmLsi1與OsLsi1相似性為83%。與水稻根系組織結構不同,玉米和大麥根系中只有一層凱氏帶,位于內皮層。雖然HvLsi1和ZmLsi1在結構和功能上與OsLsi1相似,但三者在根部的定位和表達模式差異很大。OsLsi1主要定位于水稻根系中的胚根、側根和冠根等的外皮層和內皮層凱氏帶細胞的外側,HvLsi1主要定位于大麥胚根表皮和皮層細胞以及側根的下皮細胞外側,而ZmLsi1則主要定位于玉米胚根和冠根的表皮和下皮細胞及側根的表皮和皮層細胞外側。連續(xù)3天施Si,水稻OsLsi1表達水平顯著降低(降至25%),而連續(xù)7天施Si,HvLsi1/ZmLsi1的表達水平變化不明顯,即表達不受Si供應的影響,表明其啟動子區(qū)域具有與水稻不同的調控元件。3.5hvlsi2和zmlsi2基酸水平Mitani等利用玉米基因組和基因數(shù)據(jù)庫比較搜索到與OsLsi2同源性最高的ZmLsi2,并根據(jù)OsLsi2和ZmLsi2的保守序列設計引物通過基因組-PCR得到大麥Si轉運蛋白基因HvLsi2。在氨基酸水平上,HvLsi2和ZmLsi2與OsLsi2都具有86%的相似性。RT-PCR結果表明,HvLsi2/ZmLsi2均只在根中表達,而且在根基的表達水平顯著高于根尖。進一步的免疫顯色表明,HvLsi2/ZmLsi2均無極性地定位于胚根和側根基部的內皮層凱氏帶細胞中。通過分析8個大麥品種的根系Si吸收特性,表明HvLsi2的表達水平與根系Si吸收量呈顯著正相關,是大麥中關鍵的Si吸收轉運體。與水稻中OsLsi1和OsLsi2的協(xié)同作用相似,持續(xù)供Si條件下,HvLsi2/ZmLsi2的表達水平均明顯下降,而HvLsi1/ZmLsi1的表達則不受影響,表明大麥和玉米Si吸收調節(jié)機制與水稻不同。3.6zmosi6sivir-i9Mitani等利用玉米基因組和遺傳學數(shù)據(jù)庫進行同源物搜索,在玉米中獲得了與水稻Si內向轉運體OsLsi1同源的ZmNIP2-2,命名為ZmLsi6,并通過PCR從玉米根系cDNA中獲得此基因。ZmLsi6的開放閱讀框長885bp,編碼294個氨基酸。在氨基酸水平上,ZmLsi6與OsLsi6具有89%的相似性。ZmLsi6包含2個保守NPAs和4個氨基酸殘基(G、S、G和R),由此推斷ZmLsi6屬于NIPIII亞族;注入爪蟾卵母細胞中的異源表達試驗證明,ZmLsi6只具有Si內向轉運功能。免疫熒光染色結果表明,ZmLsi6在胚根中幾乎無表達,主要在側根和冠根中表達,而且無極性特征;地上部分,ZmLsi6主要極性分布于葉鞘和葉片木質部薄壁細胞靠近導管一側的細胞質膜上。與OsLsi1不同的是,連續(xù)7天供Si,Zmsi6在胚根、冠根和葉鞘的表達均不受影響。到目前為止,尚無法獲得ZmLsi6敲除突變體,因而不能直接證明ZmLsi6的功能,但Mitani等根據(jù)細胞定位和轉運活性推測,ZmLsi6可能擁有和OsLsi6相似的功能。3.7si含銅氨酸鈉轉運體的si底物相對比Mitani等發(fā)現(xiàn)南瓜具有典型的硅主動吸收特征,并根據(jù)水稻硅內向轉運蛋白基因OsLsi1克隆出了南瓜硅內向轉運蛋白基因CmLsi1(B+、B-),CmLsi1與OsLsi1的相似性為58%。CmLsi1(B+)和CmLsi1(B-)分別來自于在硅積累上截然相反的2種南瓜(瓠果有霜型和瓠果光滑型)的初生根中。在爪蟾卵母細胞核水稻硅吸收缺陷突變體中的異源性表達均顯示,有霜型南瓜中的內向轉運體CmLsi1(B+)能夠轉運硅,而光滑型南瓜初生根中的CmLsi1(B-)卻不能。定點突變分析表明,CmLsi1(B+)和CmLsi1(B-)的氨基酸殘基差異在于242位上脯氨酸突變成了亮氨酸,隨后在所有光滑型南瓜品種的初生根中均檢測到這一突變,推測正是這一突變導致了Si轉運活性喪失。組織定位發(fā)現(xiàn),這一轉運體分布于根系的所有細胞中。利用不同的亞細胞定位方法結果均表明,有霜型南瓜初生根中的Si內向轉運體CmLsi1(B+)定位于細胞質膜上,而光滑型南瓜初生根中的CmLsi1(B-)則定位于內質網。綜上所述,2種南瓜Si吸收的差異很可能是Si內向轉運蛋白中一個氨基酸殘基的等位基因突變所導致的,進而影響了亞細胞定位及轉運活性。4si橫向轉運活性到目前為止,水稻是硅轉運蛋白研究最為深入的植物,已有3個Si轉運蛋白基因(OsLsi1、OsLsi2、OsLsi6)被鑒定。水稻根系內、外皮層均存在凱氏帶,內、外皮層之間有通氣組織,這種特殊的結構決定了離子從外液進入根中柱的徑向運輸需要借助載體多次交替經過共質體途徑和質外體途徑來實現(xiàn)。OsLsi1是Ma等利用水稻Si吸收缺陷型突變體(lsi1)克隆出的首個高等植物Si吸收轉運蛋白,其主要定位于水稻根系內、外皮層凱氏帶細胞的外側質膜上,具有Si內向轉運活性;與OsLsi1相似,OsLsi2主要定位于相應的內、外皮層凱氏帶細胞內側質膜上,具有Si外向轉運活性;OsLsi6主要定位于葉片和葉鞘靠近維管束的薄壁細胞內側質膜,負責卸載和分配隨蒸騰流運輸?shù)降厣喜糠值腟i。突變體及敲除實驗表明,失去OsLsi1或OsLsi2都會導致根系Si吸收顯著降低,而失去OsLsi6不會影響Si吸收,卻導致地上部分Si的無序分布。由此推斷,水稻Si的吸收和轉運過程包括4個步驟:(1)外部溶液中的Si在外皮層質外體中被凱氏帶細胞膜上的內向轉運載體OsLsi1轉運進入凱氏帶細胞中,在同一細胞的近軸端Si被外向轉運載體OsLsi2釋放到通氣組織質外體中;(2)質外體溶液中的Si經內皮層遠軸端凱氏帶膜上的OsLsi1轉運進入內皮層細胞,再由OsLsi2將Si轉運到中柱中;(3)木質部導管中,Si以非聚合態(tài)單硅酸形式隨蒸騰流運輸?shù)降厣喜糠?(4)分布于近導管一側木質部薄壁細胞中的OsLsi6則負責將木質部上的Si卸載和分配到葉片和葉鞘中,并輔助非聚合態(tài)單硅酸形式的Si在蒸騰作用下失水聚合形成硅膠(SiO2·nH2O),使沉積于地上部不同組織的細胞壁和細胞間隙中。與水稻根系結構不同,大麥和玉米根系中凱氏帶只分布于內皮層,這種結