受體（基因工程課件）

受體CONTENTS目錄01載體的概念、種類02載體的條件、功能03質粒受體概念作為受體細胞的條件常用的基因工程表達系統(tǒng)受體概念在轉化或轉染過程中接受外源基因的宿主細胞作為受體細胞的條件限制缺陷型：外切酶和內切酶活性缺陷重組整合缺陷型：便于基因擴增或高效表達外源DNA轉化效率高與載體選擇標記互補感染寄生缺陷型：防止重組菌污染自然環(huán)境受體細胞的選擇易于培養(yǎng)安全、沒有致病性遺傳背景清楚密碼子無顯著偏愛性篩選鑒定方便產物表達水平高、穩(wěn)定、活性高表達產物易于分離純化原核細胞表達系統(tǒng)特點優(yōu)點結構簡單、遺傳背景相對清楚，便于遺傳操作；代謝和調控機制相對清楚，便于基因表達調控生長迅速，易于培養(yǎng)。缺點只能表達真核生物基因的cDNA,不能識別和剪切內含子；缺乏真核生物蛋白質的加工修飾系統(tǒng)；表達的真核生物蛋白不能正確折疊。大腸桿菌作為受體菌的特點優(yōu)點

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遺傳背景清楚，載體系統(tǒng)完備，生長迅速（17min），培養(yǎng)簡單。=〉適用于外源DNA的擴增和克隆、原核生物基因的高效表達（總蛋白的5%-30%）、基因文庫的構建，是基因工程實驗的主要受體菌。缺點產結構復雜、種類繁多的內毒素。表達：多數(shù)以無活性的包涵體形式胞內表達，分泌產物大多只能分泌至細胞周質，少數(shù)分泌表達至胞外。胞內表達的蛋白質N端多一個甲硫氨酸（ATG）。缺乏基因產物表達的后加工機制常用的大腸桿菌受體菌接受質粒DH5a用于質?？寺〉木辍？捎糜谒{白班篩選（質粒（a亞基）-菌株（β亞基）JM109部分抗性基因缺陷—抗生素抗性篩選藍白班篩選測序分子克隆、質粒提取BL21用于非毒性蛋白的表達C600;W3110;HB101;JM83;JM101接受λ-DNALE392;ED8654芽孢桿菌作為受體菌的特點優(yōu)點

=〉遺傳背景清楚，蛋白質分泌機制健全，分泌到培養(yǎng)基，表達的真核蛋白具有天然構象和生物活性；

=〉生長迅速，培養(yǎng)簡單，不產內毒素。=〉適用于原核生物基因的克隆、表達以及重組蛋白多肽的有效分泌。缺點=〉遺傳欠穩(wěn)定。=〉載體系統(tǒng)欠完善=〉常規(guī)方法不易轉化=〉分泌大量蛋白酶，影響表達產物的穩(wěn)定性常用的芽孢桿菌受體枯草芽孢桿菌蛋白質分泌能力強，至少同時分泌6種蛋白酶。短小芽孢桿菌蛋白分泌能力與枯草芽孢桿菌接近，但胞外分泌的蛋白酶活性低于枯草芽孢桿菌。芽孢桿菌常用的表達載體pNU210;PYQL;pUB18芽孢桿菌的應用白介素-2白介素-3表皮生長因子人β-干擾素乙肝病毒抗原鏈霉菌作為受體菌的特點=〉用于生產抗生素，遺傳操作簡便，不產內毒素。=〉主要用于抗生素生產菌株的改良=〉遺傳不穩(wěn)定，生長相對緩慢。酵母菌作為受體菌的特點=〉具有真核生物的特征，遺傳背景清楚，生長迅速，培養(yǎng)簡單，外源基因表達系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定。=〉內源性蛋白產物種類繁多且含量高，不利于目的蛋白純化。優(yōu)點有蛋白質翻譯后的加工修飾系統(tǒng)（糖基化磷酸化、正確折疊）不產生毒素，分泌性表達。易于培養(yǎng)、生長迅速（2h倍增）缺點生長較細菌慢有些活性蛋白無法表達或正確修飾（超糖基化）重要的酵母受體菌釀酒酵母---面包酵母---第一個用于基因工程單細胞真核微生物

真核生物的“大腸桿菌”；背景清除，基因組已測序，容易進行遺傳操作；工藝簡單，易于大規(guī)模生產；不產生毒素，安全可靠；適合表達真核生物基因；外源基因分泌表達。釀酒酵母應用1981年釀酒酵母表達第一個外源基因-干擾素；FDA批準的第一個基因工程疫苗-釀酒酵母表達的乙肝疫苗（默克公司）上市產品：人胰島素；人粒細胞集落刺激因子釀酒酵母受體細胞缺陷外源基因表達水平不高密碼子偏愛性；乙醇發(fā)酵途徑活躍，使生物大分子合成受抑制；質粒不穩(wěn)定外源蛋白超糖基化修飾畢赤酵母（甲醇酵母）近幾年被廣泛應用含有醇氧化酶基因啟動子，可用甲醇調控基因表達。表達質?？烧显诨蚪M的特定位點；糖基化修飾接近哺乳動物細胞，可分泌表達；缺點：發(fā)酵周期長，需添加甲醇，遺傳背景不很清楚。畢赤酵母應用最有效的酵母表達系統(tǒng)表達了300多種外源蛋白20多種藥物蛋白白介素-2，人血清白蛋白；表皮生長因子；腫瘤壞死因子；破傷風毒素C片段等等。乳酸克魯維酵母外源基因表達水平比釀酒酵母高，高達80-100倍。多型漢遜酵母蛋白質糖基化作用接近哺乳動物細胞。哺乳動物細胞受體特點重組、表達系統(tǒng)全，分泌表達；糖基化、磷酸化修飾系統(tǒng)適宜，表達的蛋白質高級結構正確。主要哺乳動物和人基因受體?？杀磉_cDNA又可表達基因組DNA，適用于基因表達調控研究、基因藥物的生產。細胞培養(yǎng)條件苛刻，生長緩慢CHO細胞特點上皮型細胞，貼壁生長；外源蛋白分泌表達，內源蛋白分泌很少；蛋白質翻譯后修飾準確；外源基因整合后穩(wěn)定。應用培養(yǎng)基添加脯氨酸；氨甲酰喋呤存在，外源基因表達水平提高。BHK細胞幼倉鼠腎臟細胞，成纖維型細胞；制備病毒疫苗和重組蛋白。C127細胞小鼠乳腺腫瘤細胞，上皮型貼壁生長。Vero細胞成年非洲綠猴腎細胞，成纖維型貼壁生長。生產疫苗，脊髓灰質炎，狂犬病毒，乙腦病毒病毒檢測蛋白質藥物昆蟲細胞（家蠶）具有真核生物的特征，遺傳穩(wěn)定，外源基因表達量高，繁殖快，培養(yǎng)成本低。適用于真核生物基因