基因工程制藥技術(shù) 基因工程操作流程

生化制藥工藝AcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplan項(xiàng)目五基因工程制藥1基因工程的概念2基因工程操作工具3基因工程操作流程目錄CONTENTS基因工程操作流程03Part2基因工程操作工具一、基因重組基本原理1、基本原理目的基因的獲取→→克隆載體的選擇和構(gòu)建→→外源基因與載體的連接→→DNA導(dǎo)入受體菌→→重組體的篩選→→克隆基因的表達(dá)Part2基因工程操作工具二、目的基因的獲取1、化學(xué)合成法已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列基因數(shù)據(jù)庫(kù)核酸合成儀Part2基因工程操作工具二、目的基因的獲取2、基因組文庫(kù)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合Part2基因工程操作工具二、目的基因的獲取3、cDNA文庫(kù)以mRNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補(bǔ)的DNA，再?gòu)?fù)制成雙鏈cDNA，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，即獲得cDNA文庫(kù)Part2基因工程操作工具二、目的基因的獲取4、PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）概念：PCR全稱(chēng)為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)原理：DNA復(fù)制條件：已知基因的核苷酸序列、四種脫氧核苷酸、一對(duì)引物、DNA聚合酶方式：以指數(shù)方式擴(kuò)增，即2n（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增Part2基因工程操作工具二、目的基因的獲取4、PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）過(guò)程DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板，在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈Part2基因工程操作工具三、目的基因與載體的連接1、連接工具T4噬菌體DNA連接酶、大腸桿菌DNA連接酶2、連接方式粘性末端連接（1）同一限制酶切位點(diǎn)連接Part2基因工程操作工具三、目的基因與載體的連接2、連接方式粘性末端連接（2）不同限制酶切位點(diǎn)連接Part2基因工程操作工具三、目的基因與載體的連接2、連接方式平末端連接適用于限制性?xún)?nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端Part2基因工程操作工具三、目的基因與載體的連接2、連接方式同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接Part2基因工程操作工具三、目的基因與載體的連接2、連接方式人工接頭（linker）連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠCCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠPart2基因工程操作工具四、重組DNA導(dǎo)入受體菌1、受體細(xì)胞是指能夠攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持、具有應(yīng)用價(jià)值和理論研究?jī)r(jià)值的細(xì)胞條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)（competent）種類(lèi)微生物受體細(xì)胞（原核、真核）植物受體細(xì)胞動(dòng)物受體細(xì)胞Part2基因工程操作工具四、重組DNA導(dǎo)入受體菌1、受體細(xì)胞原核生物受體細(xì)胞的特點(diǎn)沒(méi)有纖維素組成的細(xì)胞壁，便于外源DAN進(jìn)入細(xì)胞內(nèi) 基因組簡(jiǎn)單，便于進(jìn)行遺傳分析單細(xì)胞生物，易于獲得一致性受體細(xì)胞培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)快，實(shí)驗(yàn)周期短主要的原核受體細(xì)胞大腸桿菌枯草桿菌應(yīng)用構(gòu)建基因組文庫(kù)表達(dá)基因產(chǎn)物保存和擴(kuò)增目的基因Part2基因工程操作工具四、重組DNA導(dǎo)入受體菌1、受體細(xì)胞酵母受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、遺傳背景比較清楚。具有真核生物蛋白翻譯后加工和修飾系統(tǒng)。不含特異性病毒和毒素，對(duì)人類(lèi)安全。培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，可進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵。能將表達(dá)產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外應(yīng)用構(gòu)建基因組文庫(kù)表達(dá)外源基因Part2基因工程操作工具四、重組DNA導(dǎo)入受體菌1、受體細(xì)胞植物受體細(xì)胞具有體細(xì)胞全能性，一個(gè)分離的活細(xì)胞在合適的條件下可分化成植株具有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，可以纖維素酶處理獲得原生質(zhì)體應(yīng)用轉(zhuǎn)基因棉花水稻玉米馬鈴薯煙草Part2基因工程操作工具四、重組DNA導(dǎo)入受體菌1、受體細(xì)胞動(dòng)物受體細(xì)胞的特點(diǎn)體細(xì)胞一般無(wú)全能性，只能分化到細(xì)胞株生殖細(xì)胞、胚胎細(xì)胞等具有全能性，可分化、培養(yǎng)成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)用轉(zhuǎn)基因羊轉(zhuǎn)基因鼠轉(zhuǎn)基因兔轉(zhuǎn)基因豬轉(zhuǎn)基因牛等Part2基因工程操作工具四、重組DNA導(dǎo)入受體菌2、導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化（transformation）（1）鈣轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞在一定的生理狀態(tài)（感受態(tài)），或經(jīng)CaCl2處理，或制備成原生質(zhì)體的情況下，都可吸收外源DNA，利用這一特性可將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞中，用質(zhì)粒作載體的遺傳工程一般使用這種方法由于E.coli不會(huì)自發(fā)地產(chǎn)生感受態(tài)，因此E.coli的轉(zhuǎn)化一般采用鈣轉(zhuǎn)化法。該方法是將E.coli用冷CaCl2（0℃）

致敏，而后在高溫（42℃）下熱休克，這樣可使外原DNA進(jìn)入受體細(xì)胞Part2基因工程操作工具四、重組DNA導(dǎo)入受體菌2、導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化（transformation）（1）電穿孔轉(zhuǎn)化在高壓電場(chǎng)下使細(xì)胞產(chǎn)生瞬間的穿孔，這個(gè)穿孔足夠大并可維持足夠的時(shí)間，使外原DNA進(jìn)入受體細(xì)胞。電穿孔法的轉(zhuǎn)化效率比鈣轉(zhuǎn)化法高2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。這種方法也可用于真核生物的轉(zhuǎn)染Part2基因工程操作工具四、重組DNA導(dǎo)入受體菌2、導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)染（transfection）轉(zhuǎn)化感染（Transfection來(lái)自于transfomation與infection）凡是以噬菌體（如M13）或病毒為載體，以轉(zhuǎn)化的方法將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法均稱(chēng)為轉(zhuǎn)染。因此轉(zhuǎn)染就方法來(lái)說(shuō)與轉(zhuǎn)化是一樣的Part2基因工程操作工具四、重組DNA導(dǎo)入受體菌2、導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）通過(guò)病毒將一個(gè)宿主的DNA轉(zhuǎn)移到另一個(gè)宿主的細(xì)胞中而引起的基因重組現(xiàn)象Part2基因工程操作工具四、重組DNA導(dǎo)入受體菌2、導(dǎo)入方式顯微注射通過(guò)微量注射器將重組DNA直接注入受體細(xì)胞中基因槍基因槍顯微注射Part2基因工程操作工具四、重組DNA導(dǎo)入受體菌2、導(dǎo)入方式脂質(zhì)體介導(dǎo)法將重組DNA包裹在人工構(gòu)建的磷脂雙分子層脂質(zhì)體中，通過(guò)原生質(zhì)體與脂質(zhì)體的融合或原生質(zhì)體的吞噬作用而將DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)Part2基因工程操作工具五、重組體的篩選1、直接選擇法抗藥性標(biāo)記選擇利用載體DNA分子上的抗藥性篩選標(biāo)記進(jìn)行篩選的方法。主要用于重組質(zhì)粒DNA分子的轉(zhuǎn)化子篩選。重組質(zhì)粒DNA分子攜帶特定的抗藥性選擇標(biāo)記基因，在含有相應(yīng)選擇藥物的選擇培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)Part2基因工程操作工具五、重組體的篩選1、直接選擇法標(biāo)志補(bǔ)救（markerrescue）若克隆的基因能夠在宿主菌表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物與宿主菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)，那么就可以利用營(yíng)養(yǎng)突變菌株進(jìn)行篩選Part2基因工程操作工具五、重組體的篩選1、直接選擇法利用報(bào)告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞在植物轉(zhuǎn)基因研究中，載體攜帶的選擇標(biāo)記基因（selectivegene）經(jīng)常稱(chēng)為報(bào)告基因（reportorgene），常用的報(bào)告基因有抗生素抗性基因以及編碼某些酶類(lèi)或其他特殊產(chǎn)物的基因等Part2基因工程操作工具五、重組體的篩選1、直接選擇法分子雜交法原位雜交Southern印跡形成噬菌斑篩選法外源DNA插入

噬菌體載體后，導(dǎo)入受菌體后，轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)基平板上被裂解形成噬菌斑，而非轉(zhuǎn)化子能正常生長(zhǎng)，兩者很容易區(qū)分2、免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等Part2基因工程操作工具六、克隆基因的表達(dá)1、原核表達(dá)系統(tǒng)E.coli表達(dá)體系最為常用不宜表達(dá)真核基因組DNA不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusionbody)很難表達(dá)大量可溶性蛋白2、真核表達(dá)系統(tǒng)酵母、昆蟲(chóng)、