紹興黃酒麥曲中可溶性總蛋白的分離

紹興黃酒麥曲中可溶性總蛋白的分離

小麥在黃酒的生產(chǎn)過(guò)程中起著非常重要的作用。被稱為“酒的骨架”。這不是黃酒的“一般酶劑”。此外，小麥草中積聚了多種微生物代謝產(chǎn)物，給黃酒帶來(lái)了獨(dú)特的味道。研究表明,麥曲中微生物胞外酶主要是來(lái)源于各種霉菌和細(xì)菌分泌的各類水解酶系,包括淀粉酶系、蛋白酶系、纖維素酶系、半纖維素酶系、脂肪酶系等等。這些復(fù)合酶系共同作用將麥曲中的各種大分子物質(zhì)(淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等)分解為小分子物質(zhì),以便微生物的生長(zhǎng)、繁殖、產(chǎn)酶、產(chǎn)酒。目前國(guó)內(nèi)直接針對(duì)黃酒麥曲中微生物胞外酶的研究開(kāi)展得較少,主要是利用色譜技術(shù)對(duì)麥曲中單一酶類進(jìn)行純化并開(kāi)展酶學(xué)性質(zhì)研究,如作者所在實(shí)驗(yàn)室就曾開(kāi)展紹興黃酒麥曲中α-淀粉酶的分離、純化及其酶學(xué)性質(zhì)的研究,通過(guò)現(xiàn)有的酶學(xué)研究方法,無(wú)法達(dá)到全面獲取麥曲中微生物胞外酶組成,確定其微生物來(lái)源的目的。宏蛋白質(zhì)組學(xué)(metaproteomics)是最近幾年被提出的新概念,其定義是指對(duì)某一特定環(huán)境中微生物群落的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模的分析和鑒定。宏蛋白質(zhì)組的研究策略與經(jīng)典的蛋白質(zhì)組研究策略相似,主要包括環(huán)境總蛋白的提取純化、蛋白質(zhì)分離以及質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)比對(duì)3個(gè)步驟。其中蛋白質(zhì)的分離步驟一般采取雙向電泳或液相色譜方法。本研究借助于宏蛋白質(zhì)組學(xué)的理論和思想,利用雙向電泳技術(shù)對(duì)從紹興黃酒成品麥曲中浸提出的所有可溶性蛋白(主要是各種微生物分泌的胞外酶蛋白,原料小麥的可溶性蛋白絕大部分已在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中被降解為小分子肽段)進(jìn)行高分辨率分離,為后續(xù)通過(guò)質(zhì)譜分析手段大規(guī)模鑒定麥曲中的微生物胞外酶,并進(jìn)一步弄清其微生物來(lái)源奠定基礎(chǔ)。由于雙向電泳實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、步驟繁瑣、操作性強(qiáng),實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各個(gè)環(huán)節(jié)均影響雙向電泳的分離效果,且直接關(guān)系到后期蛋白質(zhì)譜分析的準(zhǔn)確性和可靠性,對(duì)于不同來(lái)源的樣品,一般都需要摸索出專用的實(shí)驗(yàn)條件。因此,針對(duì)某一具體樣品的雙向電泳實(shí)驗(yàn)方法的建立是高通量分析蛋白質(zhì)混合物的先決條件。本研究的目標(biāo)就是通過(guò)優(yōu)化影響雙向電泳結(jié)果的關(guān)鍵條件,建立一套高分辨率、高穩(wěn)定性和高重復(fù)性的紹興黃酒成品麥曲微生物胞外酶雙向電泳技術(shù)體系。1材料和方法1.1材料表面1.1.1小麥的曲線紹興黃酒機(jī)制麥曲:由浙江古越龍山紹興酒股份有限公司提供。1.1.2抑制劑及混合片的制備瓊脂糖、溴酚藍(lán)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰銨(IAA)、固相IPG干膠條(非線性,pH值為3～10,7cm)、IPGBuffer(pH值為3～10)、IPG覆蓋液均為GE公司產(chǎn)品;CHAPS、脲為Amersham公司產(chǎn)品;Complete蛋白酶抑制劑混合片為Roche公司產(chǎn)品;丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉(SDS)、Tris堿、過(guò)硫酸銨、甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、考馬斯亮藍(lán)R-250為純化級(jí)產(chǎn)品;甲醇、正丁醇、甘油、冰醋酸、磷酸、三氯乙酸(TCA)、丙酮、乙酸鈉、牛血清白蛋白均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。1.1.3材料、設(shè)備和分析方法等電聚焦電泳儀EttanIPGphor3:GE公司產(chǎn)品;高電流電泳儀:BIO-RAD公司產(chǎn)品;小型垂直電泳槽:BIO-RAD公司產(chǎn)品;TY-80S/80B脫色搖床:生興生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;JD-801凝膠電泳圖像分析系統(tǒng):江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品;CR22G型高速冷凍離心機(jī):日本日立公司產(chǎn)品;Pico&Fresco17微量離心機(jī):Thermo公司產(chǎn)品;UV-2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):尼龍柯儀器有限公司產(chǎn)品。1.1.4dtildj樣品裂解液:脲4.8g,CHAPS0.4g,IPG緩沖液50μL,加入雙蒸水至總體積為10mL(使用前加入20mmol/LDTT)。平衡液I:脲72.07g、SDS4.0g、1.5mol/LTris-HCl6.7mL(pH8.8)、甘油69mL、1g/dL溴酚藍(lán)貯存液400μL,加入雙蒸水至200mL,使用前每10mL加入DTT100mg。平衡液II:脲72.07g、SDS4.0g、1.5mol/LTris-HCl6.7mL(pH8.8)、甘油69mL、1g/dL溴酚藍(lán)貯存液400μL,加入雙蒸水至200mL,使用前每10mL加入IAA250mg。1.2方法1.2.1樣品制備1粗酶提取液的制備秤取25g麥曲,加入50mL0.09mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液和一片Complete蛋白酶抑制劑混合片,在4℃條件下浸提過(guò)夜。然后依次用4層紗布、濾紙過(guò)濾,濾液在10000r/min,4℃條件下離心30min,上清液即為粗酶提取液。Bradford法測(cè)定蛋白含量。2檢測(cè)蛋白的提取取一定量粗酶提取液,加入4倍體積的預(yù)冷丙酮溶液Ⅰ(含20mmol/LDTT,10g/dLTCA),搖勻,-20℃放置1h沉淀蛋白,之后4℃下12000r/min離心30min。棄上清,收集沉淀。加入2mL預(yù)冷的丙酮溶液Ⅱ(含20mmol/LDTT),-20℃放置1h,清洗沉淀,4℃12000r/min離心15min。重復(fù)清洗一次。棄上清,收集沉淀,然后置于-20℃冰箱中,使丙酮完全揮發(fā)。3麥曲宏蛋白質(zhì)組的檢測(cè)將干燥好的蛋白質(zhì)沉淀加入適量的樣品裂解液,室溫下充分溶解,然后12000r/min離心10min,上清液即為麥曲宏蛋白質(zhì)組樣品。Bradford法測(cè)定蛋白含量。1.2.2聚丙稀酰胺凝膠的等電聚合按照GE公司《雙向電泳操作手冊(cè)》進(jìn)行水化上樣和等電聚焦。在Immobiline干膠條再泡脹盤(pán)中加入適量麥曲宏蛋白質(zhì)組樣品,將IPG干膠條水平放入其中,加入少量IPG覆蓋液,水化過(guò)夜。水化過(guò)夜后的膠條轉(zhuǎn)移到EttanIPGphor膠條槽中,設(shè)置等電聚焦程序進(jìn)行等電聚焦。等電聚焦結(jié)束后,立即進(jìn)行平衡。采用兩步平衡法,將IPG膠條先后在平衡液I和平衡液II中平衡15min。平衡后進(jìn)行第二向SDS電泳,分離膠質(zhì)量濃度為12.5g/dL(10cm×7cm×1mm)。將平衡后的IPG膠條轉(zhuǎn)移到已聚合的聚丙稀酰胺凝膠膠面頂端,用0.5g/dL的瓊脂糖封閉,排除膠條與膠面之間的氣泡。以恒流方式進(jìn)行電泳:10mA,10min,然后電流調(diào)至20mA。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移到凝膠底部時(shí),關(guān)閉電源,結(jié)束電泳。采用考馬斯亮藍(lán)染色法對(duì)凝膠進(jìn)行染色。1.2.3二維硬膠電泳分析脫色后的雙向電泳凝膠用捷達(dá)JD-801凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行掃描分析。2結(jié)果與討論2.1確定等電聚焦程序等電聚焦時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致電內(nèi)滲和蛋白移動(dòng),從而產(chǎn)生水平拖尾;而聚焦時(shí)間過(guò)短,會(huì)導(dǎo)致蛋白壓縮不夠緊密,形成橫向糊狀拖尾。為研究等電聚焦的關(guān)鍵條件對(duì)本研究樣品雙向電泳效果的影響,首先進(jìn)行了等電聚焦條件的摸索。根據(jù)固相IPG干膠條(非線性,pH3～10,7cm)使用說(shuō)明書(shū)建議,設(shè)定不同的等電聚焦總伏特小時(shí)數(shù)(Vh)進(jìn)行試驗(yàn)。研究結(jié)果表明,當(dāng)總伏特小時(shí)數(shù)設(shè)定值為不低于7500V·h時(shí),樣品的聚焦效果較好,雙向電泳圖譜的分辨率較高。因此,最終確定等電聚焦程序?yàn)?①Step,300V×2h;②Gradient,1000V×0.5h;③Gradient,5000V×1.5h;④Step,5000V,2000Vh。2.2電泳圖譜的分析黃酒大罐發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵醪液的pH值范圍為3.5～5.0左右,故本實(shí)驗(yàn)分別選取pH值為4.2、4.4、5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液浸提麥曲,制備麥曲的可溶性總蛋白樣品。在上樣量基本一致的條件下(約100μg)進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn),得到電泳圖譜如圖1所示。通過(guò)分析比較可以看出,每張雙向電泳圖譜上可獲得40～60個(gè)可分辨的蛋白斑點(diǎn),且主要蛋白斑點(diǎn)在凝膠上的分布狀況大體一致。在相對(duì)低分子質(zhì)量區(qū)域的偏堿性范圍內(nèi),都出現(xiàn)了若干分布較為集中的蛋白斑點(diǎn),而在低分子質(zhì)量區(qū)域的偏酸性區(qū)域,分布的蛋白斑點(diǎn)則少得多,說(shuō)明大部分分子質(zhì)量較小的微生物胞外酶以堿性蛋白質(zhì)為主。在凝膠的高分子質(zhì)量區(qū)域,當(dāng)以pH值為4.2的乙酸-乙酸鈉浸提緩沖液制備樣品時(shí),可分辨的蛋白斑點(diǎn)相對(duì)較少;而當(dāng)緩沖液為pH值為4.4和pH值為5.0時(shí),有更多的蛋白斑點(diǎn)被分離出來(lái),說(shuō)明浸提緩沖液pH值的不同會(huì)影響所制備樣品的組成?？傮w說(shuō)來(lái),當(dāng)麥曲的浸提緩沖液pH值為5.0時(shí),由雙向電泳分離出來(lái)的蛋白斑點(diǎn)最多;就分辨率而言,3種pH條件下的分離效果相差不大。2.3上樣量對(duì)視網(wǎng)膜蛋白斑馬魚(yú)斑的影響蛋白質(zhì)上樣量的多少也直接影響雙向電泳圖譜的分辨率。圖2表示的是用pH值為5.0的浸提緩沖液制備樣品后,進(jìn)行不同上樣量的雙向電泳圖譜?？梢钥吹?當(dāng)上樣量為56μg時(shí),圖譜上肉眼可見(jiàn)的蛋白斑點(diǎn)非常少,低豐度蛋白質(zhì)無(wú)法顯示,且蛋白斑點(diǎn)模糊不清,表明此時(shí)上樣量偏低(圖2a);而當(dāng)上樣量為142μg時(shí),部分蛋白斑點(diǎn)出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,表明此時(shí)上樣量偏高(圖2b)。當(dāng)上樣量為100μg左右時(shí),蛋白斑點(diǎn)不僅較多,而且雙向電泳圖譜的分離分辨率較高,蛋白斑點(diǎn)清晰(圖1c),表明此時(shí)上樣量較為合適。3雙向電泳圖譜的制備雙向電泳技術(shù)是宏蛋白質(zhì)組學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)之一。應(yīng)用雙向電泳技術(shù)對(duì)黃酒麥曲中各種微生物胞外酶的可溶性宏蛋白質(zhì)組進(jìn)行分離,目前未見(jiàn)任何相關(guān)報(bào)道。本文通過(guò)一系列試驗(yàn),對(duì)影響雙向電泳結(jié)果的關(guān)鍵條件進(jìn)行了研究,初步建立了適合于目標(biāo)樣品的雙向電泳技術(shù)體系。影響雙向電泳結(jié)果的因素很多,包括材料的選擇,樣品的制備方法,樣品上樣量,等電聚焦程序,實(shí)驗(yàn)技術(shù)的熟練程度,試劑的純度等等。高效的樣品制備方法是雙向電泳成功的關(guān)鍵,制備方法若選擇不當(dāng),會(huì)造成大量鹽離子和其它干擾物質(zhì)殘留,嚴(yán)重影響等電聚焦,從而影響雙向電泳的結(jié)果。如過(guò)高鹽離子濃度可能會(huì)導(dǎo)致IEF停止,而多糖類(尤其是帶電荷的多糖)會(huì)導(dǎo)致雙向電泳圖譜中出現(xiàn)橫條紋。本研究采用TCA-丙酮法沉淀蛋白質(zhì),可以有效地去除鹽離子、酚、多糖等干擾電泳效果的物質(zhì)。同時(shí),通過(guò)增加丙酮清洗的次數(shù),能夠更徹底地去除上述雜質(zhì)。但用TCA-丙酮沉淀法制備樣品,在IEF前必須將樣品充分解聚,并使之完全溶解,以免產(chǎn)生水平條紋。本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象是麥曲微生物群落分泌的所有胞外酶,為防止蛋白水解酶對(duì)蛋白質(zhì)的降解作用,在樣品制備過(guò)程中加入了蛋白酶復(fù)合抑制劑,同時(shí)確保樣品制備過(guò)程盡量保持在低溫條件下。在黃酒生產(chǎn)過(guò)程中,酵母接入發(fā)酵醪后,酒醪的pH值會(huì)逐步下降,由開(kāi)始的pH值5.4左右,最后穩(wěn)定在pH值4.0～4.3之間。本研究分別采用了pH值為4.2、4.4、5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液浸提麥曲用以制備樣品進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn)。由所得的雙向電泳圖譜可以看出,麥曲中微生物分泌的胞外酶具有各不相同的等電點(diǎn),但不同制備條件下蛋白斑點(diǎn)在凝膠上的分布情況基本一致;當(dāng)浸提緩沖液pH值為5.0時(shí),分離得到的蛋白斑點(diǎn)最多。就分離分辨率來(lái)看,使用3種不同pH值的樣品制備緩沖液進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn),分辨率都較高。等電聚焦時(shí)間過(guò)短會(huì)影響雙向電泳結(jié)果的分辨率,時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)引起陰極漂移并丟失堿性蛋白。另外,等電聚焦時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)都會(huì)引起水平拖尾。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)?shù)赛c(diǎn)聚焦總伏特小時(shí)數(shù)設(shè)定為7500Vh時(shí),效果較好。樣品上樣量的選擇也是能否獲得高質(zhì)量雙向電泳圖譜的關(guān)鍵因素之一,上樣量的大小選擇取決于膠條的長(zhǎng)度、pH值范圍以及染色方法等。一般說(shuō)來(lái),低上樣量有利于分離高豐度蛋白,高上樣量有利于分離低豐度蛋白。但過(guò)高的上樣量會(huì)造成蛋白質(zhì)聚集或沉淀,引起蛋白斑點(diǎn)