自溶過程對啤酒酵母蛋白質(zhì)和核酸酶的影響

自溶過程對啤酒酵母蛋白質(zhì)和核酸酶的影響

自20世紀90年代以來，對母乳素可萃取物質(zhì)的研究在中國非常流行。研究方向主要集中在三種方法：分離苦法（以啤酒為原料）、自溶促進劑（食鹽等）、自溶條件（溫度、ph、變溫條件、時間）的選擇、蛋白質(zhì)分解作用等方面。目前，中國母乳素的產(chǎn)率約為35%57%。國外主要的提取方法是自我溶，其次是先對母細胞進行稀釋，然后添加酶分解。這兩種方法都有各自的優(yōu)缺點。在產(chǎn)率上，第一種高約為70%，第二種幾乎為90%。從成分上看，具有添加酶法的母乳素產(chǎn)品中的氨基酸含量很高，而自溶法產(chǎn)品中的5'-氨基酸含量很低。這是因為母細胞體本身含有超磷酸酶，因此可以將亞硝酸鹽轉化為3'-氨基酸。此外，通過添加酶法制備的工廠中的低分子糖和化合物含量較高，產(chǎn)品的味道更重。從這兩個點來看，添加酶法更有吸引力，但添加酶法相對復雜，自溶法相對簡單。目前,國內(nèi)酵母抽提物產(chǎn)品存在的主要問題是:酵母抽提物中呈味核苷酸的含量較低,酵母抽提物鮮度不夠.本論文采用自溶法工藝制備酵母抽提物,主要研究了麥芽根核酸酶在酵母抽提物中的應用,目的是提高酵母抽提物中5′-核苷酸的含量.有關麥芽根在酵母抽提物中的應用,國外在20世紀60年代開始即有報道,國內(nèi)自70年代起,也有關于利用綠麥芽根提高酵母抽提物中呈味核苷酸含量的報道.事實上,在現(xiàn)有文獻中,有關麥芽根提高酵母抽提物中呈味核苷酸含量的報道基本限于定性報道,而酵母自溶過程中關于核酸的降解及核苷酸的生成鮮有定量報道.論文通過測定酵母自溶過程中核酸、可溶性蛋白、總可溶性固形物含量隨自溶時間的變化來判斷自溶效果,以期通過控制多重指標包括可溶性蛋白質(zhì)、總可溶性固形物及呈味核苷酸的生成量等指標,得到高得率、高呈味核苷酸含量的酵母抽提物產(chǎn)品.1材料和方法1.1相對分子質(zhì)量測定啤酒廢酵母泥:太湖水啤酒廠提供;核酸酶:按文獻的方法從麥芽根制備;NaCl、NaHCO3、NaOH、HCl、鉬酸銨、高氯酸、NaCO3、CuSO4、硫酸鋰、液溴、酒石酸鉀、鎢酸鈉、鉬酸鈉:均為分析純;磷酸:優(yōu)級純;甲醇:色譜純;沉淀劑:0.25%鉬酸銨溶于25%高氯酸中;超濾膜:截留相對分子質(zhì)量分別為1萬和3千,天津紡院生產(chǎn);超濾器:天津紡院生產(chǎn);HPLC:Varian,5000型,C18柱;7520紫外分光光度儀:上海分析儀器廠生產(chǎn);722光柵分光光度儀:上海第三分析儀器廠制.1.2測量1.2.1可溶性蛋白質(zhì)1福林-酚法.1.2.2總可溶性固形物1直接干燥法.1.2.3原子能1紫外吸收法.1.2.4標準曲線及方法HPLC法.將濃縮4倍的酵母抽提物離心,取上清液,采用截留相對分子質(zhì)量為3000的膜超濾以除去大分子.所得透過液采用HPLC檢測其中的核苷酸含量.采用SIGMA公司的3′-AMP,5′-AMP,5′-GMP,5′-CMP,5′-UMP,3′-UMP和3′-CMP作為標樣.HPLC色譜條件為:體積積流量1.0mL/min,波長為265nm,采用梯度洗脫.0min時,30%的質(zhì)量濃度為0.05g/dL磷酸水溶液+70%水;5min時,30%的質(zhì)量濃度為0.05g/dL磷酸水溶液+70%水;15min時,50%的0.05g/dL磷酸水溶液+50%水;18min時,50%的質(zhì)量濃度為0.05g/dL磷酸水溶液+50%水;22min時,30%的質(zhì)量濃度為0.05%的磷酸水溶液+70%水.1.3測試方法1.3.1雜質(zhì)的提取將啤酒廢酵母離心,去除上清液后加2倍體積的無菌水,攪拌均勻,采用70目篩子篩分去除雜質(zhì),然后加2倍體積的0.5%的NaHCO3溶液,攪拌均勻,離心分離,去除上清液;再依次用2倍體積的無菌水和0.5%的NaHCO3溶液洗滌,最后用無菌水洗至中性后待用.1.3.2可溶性固形物、總核苷酸及單核苷酸含量測定在200g酵母中加2倍體積的無菌水和質(zhì)量分數(shù)為5%的NaCl,攪拌均勻后將料液升溫至55℃,保溫30h并保持不斷攪拌,期間每隔一定時間取樣.所取樣品立即置于100℃水浴中保溫20min,然后離心分離,取上清液,測定總可溶性固形物、總可溶性蛋白質(zhì)、總核酸及單核苷酸含量.1.3.3攪拌、均質(zhì)、保溫200g酵母加2倍體積無菌水和質(zhì)量分數(shù)為5%的NaCl,攪拌均勻后在40MPa壓力下均質(zhì)3次,然后升溫至55℃,保溫30h并不斷攪拌,期間每隔一定時間取樣.以下處理同1.3.2,對照不均質(zhì).1.3.4均質(zhì)、均質(zhì)、培養(yǎng)200g酵母加2倍體積的無菌水和質(zhì)量分數(shù)為5%的NaCl,再加質(zhì)量分數(shù)為1%的核酸酶,攪拌均勻,在400kg壓力下均質(zhì)3次,然后升溫至55℃,保溫30h并不斷攪拌,期間每隔一定時間取樣,以下處理同1.3.2,對照不加核酸酶.1.3.5處理u200g未均質(zhì)破壁組:200g酵母加2倍體積的無菌水和質(zhì)量分數(shù)為5%的NaCl后,攪拌均勻,用4mol/LNaOH將pH調(diào)至8,再加質(zhì)量分數(shù)為1%的核酸酶,然后升溫至55℃自溶,同時用4mol/LNaOH維持至pH8,2h后,用4mol/LHCl將pH調(diào)至5.自溶期間每隔一定時間取樣,以下處理同1.3.2,對照不調(diào)節(jié)pH.均質(zhì)破壁組:200g酵母加2倍體積無菌水和5%NaCl后,攪拌均勻,用4mol/LNaOH將pH調(diào)至8,再加質(zhì)量分數(shù)為1%的核酸酶,然后在40MPa壓力下均質(zhì)3次,再升溫至55℃自溶,同時用4mol/LNaOH將pH調(diào)至8,2h后,用4mol/LHCl將pH調(diào)至5.自溶期間每隔一定時間取樣,以下處理同1.3.2,對照不調(diào)節(jié)pH.1.3.61.比較出口產(chǎn)品和市售產(chǎn)品中5:5%的質(zhì)量采用HPLC分別測定自制產(chǎn)品、市售國產(chǎn)酵母抽提物及進口酵母抽提物中核苷酸的含量.所有樣品均配成25%溶液,離心分離后取上清液待用.2結果與討論2.1啤酒酵母中核酸酶的變化均質(zhì)破壁對于酵母自溶進程的影響見圖1,2.從圖1可以看出,均質(zhì)破壁不能顯著提高自溶產(chǎn)物的得率,但可以明顯加快自溶進程.均質(zhì)樣品自溶2h,其總可溶性固形物含量即達到非均質(zhì)樣品自溶15h的水平.均質(zhì)破壁能顯著提高自溶產(chǎn)物中可溶性蛋白質(zhì)的含量,圖1顯示均質(zhì)樣品自溶產(chǎn)物中的可溶性蛋白質(zhì)含量約為對照的2倍.同時,均質(zhì)破壁也能有效促進酵母中核酸的降解.從圖2可以看出,均質(zhì)樣品自溶產(chǎn)物中的核酸含量僅為對照的1/2左右,而核苷酸含量約為對照的3倍.啤酒酵母所含的核酸酶主要為3′-核苷酸生成酶.表1顯示,非均質(zhì)樣品的自溶產(chǎn)物中,基本不含5′-核苷酸,而均質(zhì)樣品則含有很少量的5′-核苷酸.從圖2還可以看出,在酵母自溶過程中,對照與均質(zhì)樣品中的核酸的變化趨勢很相似:核酸含量先呈上升趨勢,隨后逐漸下降,再略有回升,然后再次呈下降趨勢.表2表明,均質(zhì)樣品的變化趨勢更顯著一些.對于核酸的這種變化,可以認為是由于核酸溶出與降解速率的不平衡引起的.研究發(fā)現(xiàn),啤酒酵母中的核酸酶的最適作用溫度約在55℃左右,45℃以上開始不穩(wěn)定,55℃保溫2h后,酶活力損失約為80%.啤酒酵母中核酸酶的這種性質(zhì)造成了酵母自溶過程核酸含量的起伏.酵母自溶是在55℃下進行的.在開始階段,核酸逐漸溶出,此時核酸酶活力較高,核酸降解迅速,核苷酸也迅速生成,造成核酸含量的第一次起伏.隨著核酸酶活力的下降,核苷酸生成速率漸緩,而核酸溶出依然保持一定的速率,直至完全溶出,導致了核酸含量的第二次起伏.2.2最適條件和用量從圖3,4和表1,3的結果來看,麥芽根核酸酶的加入可以顯著提高酵母抽提物中呈味核苷酸的含量,顯著降低3′-核苷酸的含量,但對可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量沒有明顯影響.有研究表明,麥芽根中的核酸酶主要為5′-核苷酸生成酶,其最適作用溫度在55℃左右,最適pH有兩個,分別在pH5和pH8左右;該酶在pH>2.5,溫度小于50℃環(huán)境下很穩(wěn)定.在pH6、55℃條件下保溫2h后,其活力損失約為40%.而啤酒酵母核酸酶的最適作用溫度為55℃左右,但在45℃以上開始不穩(wěn)定,55℃時保溫2h,酶活力損失約80%.因此推斷,在破壁酵母中直接加入麥芽根核酸酶可以競爭底物RNA,從而有效地提高酵母自溶產(chǎn)物中呈味核苷酸的含量.表3所示結果證實了這一點.在加酶自溶30h的樣品中,5′-GMP的含量高達6.37mg/g,約為市售國產(chǎn)酵母抽提物的3倍.2.3u3000酸酶系統(tǒng)的穩(wěn)定性試驗pH對酵母自溶總的得率影響不大,但對于自溶產(chǎn)物的組成成分有顯著影響.從圖5,6的結果可以看出,在pH8自溶的產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量顯著低于對照,而核酸的含量則遠高于對照,核苷酸的含量又明顯低于對照,這種趨勢在均質(zhì)破壁樣品更明顯.從表4～6的核苷酸生成進程表來看,非均質(zhì)破壁的條件下,在pH8自溶的產(chǎn)物中5′-核苷酸的量與在pH5自溶的產(chǎn)物中的量相當,而3′-核苷酸的量則顯著低于在pH5自溶的產(chǎn)物中的量;在均質(zhì)破壁條件下,在pH8自溶的產(chǎn)物中兩種核苷酸的量均顯著低于在pH5自溶的產(chǎn)物中的量.在pH8自溶的產(chǎn)物中3′-核苷酸的量顯著低于在pH5自溶的產(chǎn)物中的量,說明pH8可以有效抑制酵母中產(chǎn)3′-核苷酸的核酸酶的活力.而在pH8自溶的產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量顯著低于對照,則說明pH8對于酵母中的蛋白酶也有抑制作用.酵母中的蛋白酶主要有4種,其最適pH和最適溫度見表7.這些蛋白酶的溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性均比較差.從試驗結果看,雖然試樣在pH8的條件下保溫2h后,隨即將pH調(diào)回5.0,仍然對蛋白酶造成了很明顯的抑制作用.另外,由于外加的麥芽根核酸酶的pH穩(wěn)定性較好,理論上講,在pH8加酶的自溶過程中,核酸的降解應該比較迅速并能生成較大量的呈味核苷酸.但試驗未達到預想結果.這可能有以下原因?qū)е碌?第一,由于在pH8的條件下,阻礙蛋白質(zhì)降解,也阻礙了細胞器中核酸的溶出,導致在核酸酶失活前生成的核苷酸總量下降.比較圖6中的a和b可以看出,均質(zhì)破壁的酵母在自溶前期,產(chǎn)物中的核酸含量明顯高于未破壁的,同時核苷酸含量也大了將近一倍.雖然pH8阻礙了蛋白質(zhì)的降解,然而均質(zhì)能有效破壞細胞膜結構,因此破壁酵母的自溶產(chǎn)物中的核苷酸含量要高得多.這可以部分說明在pH8外加核酸酶未能有效生成呈味核苷酸可能是由于細胞膜或細胞器膜未能被有效破壞所導致的.第二,對照表5和表3的結果可以看出,在pH8自溶的產(chǎn)物中,5′-CMP和5′-UMP生成量較在pH5時大,而5′-AMP和5′-GMP的生成量較在pH5小.因此,有理由相信,pH會影響麥芽根核酸酶系的水解作用,導致產(chǎn)物不同.2.4麥芽根核酸酶能有效地提高酵母抽提物中5-核苷酸含量HPLC測定自制樣品中5′-GMP的含量約6.37mg/g,國產(chǎn)樣品約1.58mg/g,進口樣品約2.09mg/g.這個結果說明了采用麥芽根核酸酶能有效地提高酵母抽提物中5′-核苷酸含量.3強化酵母抽提物中5-核苷酸含量主要研究了機械破壁、pH以及麥芽根核酸酶的作用對酵母自溶過程的影響.均質(zhì)破壁能顯