【熒光酶免疫在臨床中的應(yīng)用研究4100字】

熒光酶免疫在臨床中的應(yīng)用研究綜述報(bào)告目錄TOC\o"1-2"\h\u28376熒光酶免疫在臨床中的應(yīng)用研究綜述報(bào)告 1130741熒光酶免疫分析 1236232熒光酶免疫的臨床應(yīng)用 351652.1材料 3210822.2FEIA檢測(cè)方法 394432.3結(jié)果 325682.4討論 4308593酶免疫分析的局限及發(fā)展趨勢(shì) 530365參考文獻(xiàn)： 6摘要：酶免疫分析是標(biāo)記免疫分析中的一項(xiàng)重要技術(shù)，是以酶標(biāo)記的抗體作為主要試劑，將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶催化底物反應(yīng)的高效性和專一性結(jié)合起來(lái)的一種免疫檢測(cè)技術(shù)作為經(jīng)典的三大標(biāo)記技術(shù)之一。酶免疫技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中得到廣泛應(yīng)用并不斷得到更新，不斷和其他先進(jìn)技術(shù)如熒光、發(fā)光技術(shù)以及儀器自動(dòng)化相融合，在臨床中的的應(yīng)用也越來(lái)越頻繁。基于此本位以熒光酶免疫在臨床中的應(yīng)用為主題進(jìn)行了探討，對(duì)熒光酶免疫主題的內(nèi)容進(jìn)行了進(jìn)一步的深入思考。關(guān)鍵詞：熒光酶；臨床；免疫1熒光酶免疫分析熒光酶免疫分析即在普通的酶免疫分析的基礎(chǔ)上，用理想的酶熒光底物代替顯色底物，可提高檢測(cè)的靈敏度，擴(kuò)大檢測(cè)范圍，減少各種試劑和樣品。這一劑量已成為酶免疫測(cè)定的微敏感方法。熒光底物的理想條件是:(1)穩(wěn)定性:貯存期穩(wěn)定，在適當(dāng)條件下貯存時(shí)間長(zhǎng)，不超過(guò)酶解熒光產(chǎn)物。這種酶起作用快一些。(3)產(chǎn)品穩(wěn)定，具有較強(qiáng)的熒光性。(4)寬的Stokes位移，并傾向選用激發(fā)光波長(zhǎng)較長(zhǎng)者，因低能量的激發(fā)產(chǎn)生較低的熒光本底。目前對(duì)酶免疫分析常用的三種酶POase、APase及BGase都有相應(yīng)的熒光底物。下表中列出文獻(xiàn)報(bào)道的用不同底物酶免疫分析的靈敏度限值。由該表可見(jiàn)應(yīng)用三種酶的熒光酶免疫分析的靈敏度都明顯高于普通的酶免疫分析。表1表應(yīng)用不同底物酶免疫分析的靈敏度限值底物檢測(cè)體系檢測(cè)限值A(chǔ)Pase4-硝基酚磷酸酯(NPP)光度測(cè)定10000amol4-NPP光度測(cè)定50amol4-MUP熒光測(cè)定0.5amol4-MUP熒光測(cè)定lamol/lOOminPOase(HRPOase)鄰苯二胺(OPD)光度測(cè)定25amol/min4-羥基苯乙酸熒光測(cè)定2amol/min3-(4-羥基苯)丙酸熒光測(cè)定0.03amol/min熒光素(luciferin)發(fā)光測(cè)定0.125amolBGase2-硝基酚-P-D半乳糖甘光度測(cè)定lOOamol/min(ONPG)4-MUG熒光測(cè)定0.003amol/min注:amol,即atomol,為l0-18mo］早期熒光素酶免疫測(cè)定沒(méi)有專門的輔助儀器。反應(yīng)后，樣品需要移動(dòng)到一個(gè)測(cè)量杯，用熒光計(jì)測(cè)量。目前熒光免疫分析儀器中通用的測(cè)量?jī)x器較少，分析方法與儀器之間存在很強(qiáng)的依賴性。大多數(shù)放射免疫分析和普通酶免疫分析是通用的，儀器制造商通常不生產(chǎn)相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。目前，隨著96孔板中酶免疫分析方法的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，出現(xiàn)了多種通用酶免疫分析閱讀器(reader)，針對(duì)各種酶的常見(jiàn)底物的波長(zhǎng)濾光片也不斷出現(xiàn)。熒光素酶免疫分析法是在常規(guī)酶免疫分析法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。隨著96孔板的廣泛應(yīng)用，有必要建立一種通用的96孔板熒光素酶免疫分析方法。實(shí)際上，已有該類儀器生產(chǎn)，如TecnosumaInternational生產(chǎn)的雙用的PR-52196孔板測(cè)量?jī)x(dualplatereader,pho-tometerandfluorometer),就備有兩套光源，既可用于酶免疫分析又可用于熒光酶免疫分析。后者使用的96孔板是一種白色不透明塑料板，有助于反射和收集發(fā)射的光。為了減少熒光背景，黑色不透明塑料板也可以用來(lái)反射和收集發(fā)射的光。黑色不透明塑料片也可以用來(lái)減少熒光背景。綜上所述，熒光素酶免疫分析是一種靈敏度高、測(cè)量范圍寬的分析技術(shù)，但應(yīng)特別注意避免熒光分析中最常見(jiàn)的問(wèn)題，即熒光背景增強(qiáng)。因此，除設(shè)計(jì)熒光測(cè)量?jī)x本身外，還應(yīng)特別注意分析:各種試劑的純度和清潔度，熒光底物的純度和保存度，熒光底物加入后的適當(dāng)孵育時(shí)間的確定，以及避免外部來(lái)源。熒光材料的污染和清洗的徹底性。2熒光酶免疫的臨床應(yīng)用2.1材料（1）正常血標(biāo)本∶取自北京地區(qū)出生后72h的正常新生兒足跟血，吸于特制的濾紙上，呈直徑10mm血斑，自然干燥后備用，共1794份。（2）質(zhì)控品∶美國(guó)疾病控制中心（CDC）提供的篩查用TSH濾紙干血片質(zhì)控品。（3）試劑及設(shè)備;芬蘭Labsystems公司提供FEIA法篩查用TSH試劑及熒光讀數(shù)儀等設(shè)備。ELISA及IRMA法試劑分別由美國(guó)GBI及DPC公司提供。2.2FEIA檢測(cè)方法用直徑3mm打孔鉗，在濾紙干血片上（包括標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、及被測(cè)樣品）打2個(gè)血片，分別置包被板孔中，加入酶標(biāo)記抗體（1∶100稀釋），900次/min振蕩2h后，棄掉孔中紙片及液體，用1∶10沖洗液沖洗4次，再加入200ml熒光底物;室溫振蕩lh后，加入100ml終止液，在320nm/405nm波長(zhǎng)下進(jìn)行熒光比色，以機(jī)載軟件處理TSH含量檢測(cè)結(jié)果。2.3結(jié)果2.3.1精確性;（1）批內(nèi)變異系數(shù)（CV）∶以該試劑盒提供的B、D、F3個(gè)TSH標(biāo)準(zhǔn)品作為TSH低、中、高含量的被測(cè)物，批內(nèi)重復(fù)測(cè)定16次，其均值十標(biāo)準(zhǔn)差和批內(nèi)變異系數(shù)如下∶標(biāo)準(zhǔn)品B為491＋35，CV0.072;標(biāo)準(zhǔn)品D為1889＋180，CV0.095;標(biāo)準(zhǔn)品F為3735＋273，CV0.073。批內(nèi)平均CV為0.080。（2）批間CV∶取本試劑盒提供的TSH低值和高值質(zhì)控品，于不同試驗(yàn)批次內(nèi)測(cè)定8次，統(tǒng)計(jì)CV值，低、高質(zhì)控CV值為0.120和0.092，平均CV為0.110。2.3.2準(zhǔn)確性∶取CDC提供的高、中、低3個(gè)TSH含量質(zhì)控品，每濃度重復(fù)3次，其重現(xiàn)率見(jiàn)表1。表23種方法檢測(cè)TSH質(zhì)控品的重現(xiàn)率樣品TSH含量次數(shù)理論值測(cè)定值（mIU/L）重現(xiàn)率（%）FEIAELISAIRMAFEIAELISAIRMA低32525.423.929.9101.695.9119.6中34038.641.242.796.5102.9106.7高38072.980.783.591.1100.9104.42.3.3靈敏度：以該試劑盒的A、B2個(gè)TSH標(biāo)準(zhǔn)品分別檢測(cè)3次，按傳統(tǒng)靈敏度檢測(cè)方法，依吸光度值（A）的x±3s統(tǒng)計(jì)最低檢測(cè)限為4.14mIU/L。2.3.4FEIA、ELISA、IRMA方法的相關(guān)性∶用3種方法檢測(cè)同一組72份新生兒血標(biāo)本TSH含量，試驗(yàn)結(jié)果做統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性處理，F(xiàn)EIA方法與EISA和IRMA方法相關(guān)系數(shù)r分別為0.9698和0.9756（P<0.001)。2.3.5新生兒篩查中TSH切值的選擇∶對(duì)1794份新生兒血標(biāo)本中的TSH使用FEIA法進(jìn)行檢測(cè)，其頻數(shù)分布情況見(jiàn)表2。表31794例新生兒TSH含量頻數(shù)分布狀況分組(mIU/L)頻數(shù)(n)人群百分率（%）分組(mIU/L)頻數(shù)(n)人群百分率（%）0?26814.9412?30.171?35619.8413?10.062?41523.1314?30.173?27615.3815?00.004?18010.0316?00.005?1065.9117?00.006?754.1818?00.007?502.8719?00.008?241.3420?10.069?191.0621?00.0010?60.3322?00.0011?100.5623?2410.06經(jīng)統(tǒng)計(jì)正常新生兒人群TSH含量呈偏態(tài)分布。中位數(shù)為2.67mIU/L，高值端99%可信限為11.05mU/L，建議此方法甲低篩查切值（cutoff值）定為12mIU/L。超出者為可疑甲低患兒，需追蹤復(fù)查。2.4討論新生兒篩查是提高人口素質(zhì)的重大舉措之一，我國(guó)已開(kāi)展了甲低及苯丙酮尿癥(PU)的篩查。篩選方法包括免疫放射測(cè)定法、酶聯(lián)免疫測(cè)定法、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定法和熒光素酶免疫測(cè)定法。20世紀(jì)90年代初，Tuminen等報(bào)道了用3-o-羥基苯基二乙基酮酸作為底物，通過(guò)氧化酶的作用產(chǎn)生高靈敏度的熒光，然后在酶標(biāo)記的基礎(chǔ)上替換原來(lái)的熒光底物。顯色底物作為熒光強(qiáng)度測(cè)定的定量基礎(chǔ)。作者認(rèn)為，這種新型襯底具有較高的靈敏度，為FEIA法的快速發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。作者報(bào)告使用該方法篩查新生兒甲狀腺功能減退癥在同一年。該方法與苯丙酮尿癥化學(xué)篩查中的熒光強(qiáng)度測(cè)定相同，可用于甲狀腺功能減退癥和苯丙酮尿癥的篩查。北京市新生兒TSH水平的99%置信限為11.05mlU/l。甲狀腺功能減退患兒TSH升高。建議甲狀腺功能減退篩查的臨界值為12mlu/l。我們實(shí)驗(yàn)室過(guò)去用美國(guó)產(chǎn)品對(duì)同一區(qū)域的人進(jìn)行甲狀腺功能減退篩查，閾值一般設(shè)定在20mlu/l左右，因?yàn)閮煞N標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品的含量表達(dá)不同。實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品使用全血值進(jìn)行校準(zhǔn)。結(jié)果表明，該指標(biāo)低于用血清值校準(zhǔn)的美國(guó)產(chǎn)品的測(cè)定值。此外，我們發(fā)現(xiàn)，即使采用相同的技術(shù)，不同地區(qū)新生兒正常TSH水平也存在差異。如果報(bào)道，使用FEIA方法，正常新生兒TSH水平的99.9%的置信限為8.4mIU/L，導(dǎo)致較低的結(jié)果。此外，種群中TSH水平分布曲線的峰值低于本組，這可能與種群的區(qū)域差異有關(guān)。為此，建議根據(jù)所選儀器和試劑確定該領(lǐng)域的篩選閾值，以確保篩選開(kāi)始前的篩選質(zhì)量。3酶免疫分析的局限及發(fā)展趨勢(shì)(1)酶免疫分析檢測(cè)的特異性實(shí)際上是由單克隆抗體所指向的抗原簇決定的，因此受試劑所使用的抗原和抗體的純度、特異性、穩(wěn)定性、特異性和純度的影響。當(dāng)然，其他標(biāo)記免疫方法也有問(wèn)題，但要注意EIA試劑盒供應(yīng)商的數(shù)量。(2)在酶免疫分析測(cè)定結(jié)果中目前所測(cè)的胰島素或C肽，近年發(fā)現(xiàn)是該物質(zhì)及其前體的混合物就是受抗體局限的明顯例子，是山于有交叉的抗原性而難以分開(kāi)，因此通帶檢測(cè)的只能稱為“免狡反應(yīng)性膿的素或Ｃ肽，這使行我們需亞新評(píng)價(jià)過(guò)去對(duì)所測(cè)的膿的素或Ｃ肽的認(rèn)識(shí)，非致力于“真”或“純膿的蔡Ｃ的測(cè)定，類似的情況可能還會(huì)發(fā)現(xiàn)。（3）酶免疫分析以固相反應(yīng)為主，在實(shí)驗(yàn)中，該聚合物能夠填充四相包被抗原的不同部位(抗體不一致引起的農(nóng)業(yè)表面效應(yīng)，聚合溫度和時(shí)間避免了側(cè)孔和中心孔反應(yīng)帶的不一致)。一步法比兩步法更容易產(chǎn)生鉤效應(yīng)?？乖c抗體比值不匹配引起的邊緣效應(yīng)和鉤效應(yīng)應(yīng)引起重視。（4）固相材料存在非特異性吸附，標(biāo)本諧血或冰箱貯存可釋放過(guò)氧化物酶，冰存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可導(dǎo)致血消聚合甚到嚴(yán)重干擾測(cè)定。當(dāng)然，隨著技術(shù)的進(jìn)步和儀器自動(dòng)化程度的提高，這些缺陷在自動(dòng)化程度相對(duì)較低的儀器和工作量較大的實(shí)驗(yàn)室中并不明顯，而在半自動(dòng)儀器和少量樣品中則需要放在冰箱中保存，這些不足仍然是明顯的?？傊S著科學(xué)發(fā)展和技術(shù)創(chuàng)新，酶免疫分析技術(shù)必將越來(lái)越完善，自動(dòng)化程度越來(lái)越高，準(zhǔn)確度和精密度越來(lái)越好，定將為人類的健康事業(yè)作出更大的貢獻(xiàn)參考文獻(xiàn)：[1]ShelverWL,KimHJ,LiQX.Developmentofamonoclonalanti-body-basedenzyme-inkedimmuosorbentassayforthebeta-4-drenergicagonistilpaterol[J].JAgricFoodChem,2005,53(9):3273-3280[2]WuFB,HeYF,HanSQ.Matrixinterferenceinserumtotalthy-roxin(T4)time-resolvedfuorescenceimmunoassayanditseliminationwiththeuseofstreptavidin-biotinseprationtechnique[J].ClinChimActa,2015,308(F2):117-126.[3]張瑩，徐文弟.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法在醫(yī)學(xué)研究中的新進(jìn)展[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，344）∶306-308.[4]郭積燕.免疫學(xué)檢驗(yàn)中的酶免疫技術(shù)[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2020,28(2):221-224.[5]ZhaoQR,LiMJLiuJetal.Enzyme-amplifiedtime-resolvedfluo-rescencedetectionfornucleicacidhybridizationassays[J].Zhong-guoYXueKeXueYuanXueBao,2002.24(1):84-88[6]YonezawaS.CowalentcouplingofsteroidtomicrowellplatesforuseinCompetitiveenzyme-linkedimmuosorbentassay[J].JIm-munolMethods,2019,166(1):55-61.[7]李振甲.酶免疫分析技術(shù)研究進(jìn)展[J].標(biāo)記免疫分析與臨床，2019,4(5):215-219.[8]王蘭蘭.免疫學(xué)和免疫檢驗(yàn)[M].北京∶人民衛(wèi)生出版社，201567-108,236-252[9]GomanEG,ArentzenR,BedzykW,etal.Anoverviewofim-munoassayautomationIhPriceCP,NewmanDJeds.Pinciplesandpracticeofimmunoassay[M]2nded.U.K.:MacmillanRef-erenceLtd,2018300-323.[10]ChanDW.Automationofimmu