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文檔簡介
干細胞聯(lián)合番茄紅素對d-半乳糖衰老模型小鼠的抗衰老作用
治療小細胞老老過程中,建議把聯(lián)合抗衰老結(jié)合起來,把帶共體干部的輸注后于細胞治療的背景中檢查出背景細胞內(nèi)的細胞a1.樹干和番茄紅素的抗衰老已成為醫(yī)學(xué)研究的熱點。根據(jù)之前兩種方法,試驗將異體源酪氨酸基因移植到異體酪氨酸酶誘導(dǎo)的老鼠體內(nèi)。同時,對于相關(guān)的老化指標進行了檢測,并將其與單獨的樹干和番茄紅素治療進行了比較。觀察移植細胞的分布和安全性。旨在探討干細胞、番茄紅素二者聯(lián)合抗衰老的作用,為抗衰老研究提供一種新的模式-聯(lián)合抗衰老。2對于干細胞、番茄紅素二者聯(lián)合抗衰老的研究,國內(nèi)外研究甚少,實驗彌補了該空白,同時為臍帶間充質(zhì)干細胞的深入研究及其應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。3由于時間、資金問題,實驗未對干細胞在體內(nèi)的分化做進一步研究,課題組會在后續(xù)的實驗中深入探討。0間充質(zhì)干細胞衰老(agingorsenescence)是復(fù)雜的自然現(xiàn)象,涉及諸多領(lǐng)域,表現(xiàn)為機體結(jié)構(gòu)和功能衰退,適應(yīng)性和抵抗力降低。有關(guān)衰老的機制,學(xué)者們曾提出許多學(xué)說。立足于衰老發(fā)生的自由基機制,目前研究表明,間充質(zhì)干細胞和清除自由基的抗氧化劑番茄紅素均可表現(xiàn)出不同程度的延緩衰老作用。間充質(zhì)干細胞是來源于中胚層的一種多能干細胞,最初在骨髓中發(fā)現(xiàn),因其具有多向分化潛能、造血支持和免疫調(diào)控等特點而日益受到人們的關(guān)注。間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下可分化為多種組織細胞,可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。來源不同的間充質(zhì)干細胞其生物學(xué)特性非常相似。臍帶間充質(zhì)干細胞相對于骨髓間充質(zhì)干細胞具有無腫瘤污染、增殖能力強、采集方便、免疫活性低、無需配型等許多優(yōu)點,并且臍帶作為醫(yī)療廢棄物,對供者無不利影響,不受倫理問題的限制,使得臍帶間充質(zhì)干細胞極有可能成為骨髓間充質(zhì)干細胞的理想替代物。番茄紅素屬于類胡蘿卜素的一種,主要存在于茄科植物西紅柿的成熟果實中,是目前自然界中發(fā)現(xiàn)的功能最強的抗氧化劑之一,通過猝滅單線態(tài)氧和清除自由基,防止脂蛋白和DNA受到氧化破壞,從而抵抗衰老并預(yù)防癌癥的發(fā)生。目前,干細胞抗衰老、番茄紅素抗衰老研究已成為醫(yī)學(xué)研究的熱點前沿,但以往的研究幾乎都是各自單獨的抗衰老研究,對于二者聯(lián)合抗衰老作用,國內(nèi)外研究甚少,目前基本處于空白狀態(tài)。文章在以往2種方法單獨研究的基礎(chǔ)上,用異體來源臍帶間充質(zhì)干細胞移植到D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型小鼠體內(nèi),同時給予番茄紅素灌胃,通過檢測相關(guān)衰老指標,與單獨的干細胞、單獨的番茄紅素治療相比較,并觀察植入細胞在衰老小鼠體內(nèi)的分布及安全性。旨在探討二者聯(lián)合抗衰老的作用,為抗衰老研究提供一種新的模式——聯(lián)合抗衰老,同時為臍帶間充質(zhì)干細胞的深入研究及其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。1材料和方法隨機對照動物實驗。于2012年3至10月在中國科學(xué)院中藥研究所完成。實驗動物及設(shè)備8周齡ICR小鼠80只,SPF級,體質(zhì)量25-35g,雌雄各半,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2012-0001,動物飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級,實驗過程中對動物處置符合2006年科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。由北京大學(xué)航天臨床醫(yī)學(xué)院中心實驗室提供。主要試劑和儀器連接到輻射干燥物和番茄紅素的抗衰老試驗中體外細胞中cm-dii表達及組織學(xué)檢測將80只ICR小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,分性別按體質(zhì)量隨機分為對照組、模型組、干細胞治療組、番茄紅素治療組、干細胞聯(lián)合番茄紅素治療組,每組16只,雌雄各8只。除對照組外其余4組每天頸背部皮下注射5%D-半乳糖,給藥量為500mg/kg,連續(xù)8周;對照組則給予相同體積生理鹽水。動物每周稱1次體質(zhì)量,根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整給藥量。造模同時,以葵花籽油為溶劑溶解番茄紅素,給小鼠灌胃,連續(xù)8周。給藥量按照人的等效劑量(0.5mg/kg)給藥5.5mg/kg,對照組和模型組灌以等量葵花籽油。動物每周稱1次體質(zhì)量,根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整給藥量。CM-DiI溶于DMSO中制成1g/L保存液。將保存液稀釋到生理鹽水中制成濃度為1mg/L工作液。25mm3培養(yǎng)瓶培養(yǎng)貼壁細胞至80%融合去培養(yǎng)基,PBS洗滌兩三遍,加入上述CM-DiI工作液4mL;然后37℃孵育5min+4℃15min,PBS洗滌2遍,然后胰酶消化細胞,錐蟲藍計數(shù)后,PBS洗滌2遍,加入DMEM/F12培養(yǎng)基,調(diào)整細胞濃度為1×1010L-1。造模第1周末,干細胞治療組、干細胞聯(lián)合番茄紅素組經(jīng)小鼠尾靜脈輸注經(jīng)CM-DiI標記的第2-4代人臍帶間充質(zhì)干細胞懸液0.2mL/只,細胞濃度為1×1010L-1,以后每2周1次,共4次。其余組則于尾靜脈給予等量細胞培養(yǎng)液。解剖前將小鼠背部剃毛,于末次給藥12h后稱質(zhì)量并摘取眼球,取血1.5mL放入EP管中,以3500r/min離心15min,分離血清,置于-80℃冰箱凍存待測。取血后將其斷頭,迅速取出肝臟、全腦、肺臟、腎臟、皮膚分別用預(yù)冷的4℃生理鹽水沖洗表面殘血,濾紙吸干水分,將肝臟左葉、大腦左半球、全部皮膚組織樣品放于15mL離心管內(nèi)于-80℃冰箱保存;取肝臟右葉、大腦右半球、全部腎臟、全部肺臟迅速置于液氮中。取各組小鼠血清、腦勻漿、肝臟勻漿、皮膚勻漿測定:①超氧化物歧化酶活性檢測:采用WST-1法測定,按照試劑盒說明進行,酶標儀450nm波長處測定。②丙二醛含量檢測:采用硫代巴比妥酸法,按照試劑盒說明進行,半自動生化儀532nm波長處測定。③羥脯氨酸含量檢測:組織樣本酸水解法,按照試劑盒說明進行,半自動生化儀550nm處測定。取對照組、模型組、干細胞治療組、干細胞聯(lián)合番茄紅素組小鼠大腦、肝臟、肺臟、腎臟組織行連續(xù)冰凍切片,片厚10μm,經(jīng)蘇木精-伊紅染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察各組織是否發(fā)生病理形態(tài)學(xué)改變。取對照組、模型組、干細胞治療組、干細胞聯(lián)合番茄紅素組小鼠大腦、肝臟、肺臟、腎臟組織制成冰凍切片,用含DAPI的抗淬滅劑封固,3min后熒光顯微鏡下觀察CM-DiI標記細胞在主要組織器官的分布情況。小鼠血清、大腦和肝臟組織中超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量以及皮膚中羥脯氨酸含量;小鼠大腦、肝臟、肺臟、腎臟組織形態(tài)學(xué)變化;人臍帶間充質(zhì)干細胞在主要組織器官的分布情況。所得數(shù)據(jù)均以ue0af±s表示,采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間比較采用單因素方差分析,P≤0.05為差異有顯著性意義。2d-半乳糖后色澤纖維80只ICR小鼠隨機分為5組,全部進入結(jié)果分析,中途無脫失。與對照組相比,模型組小鼠皮下注射D-半乳糖4周后,逐漸出現(xiàn)毛色暗淡,少有光澤,動作遲緩,反應(yīng)不靈敏等衰老征象,且隨給藥時間延長,表現(xiàn)愈加明顯。3個治療組小鼠一般情況介于模型組和對照組之間,且干細胞聯(lián)合番茄紅素組小鼠的毛色、光澤、反應(yīng)靈敏度等情況優(yōu)于干細胞治療組,干細胞治療組優(yōu)于番茄紅素治療組。2.3個治療組與模型組超氧化物歧化酶活性的比較表1模型組小鼠超氧化物歧化酶活性明顯低于對照組,組間比較差異有非常顯著性意義(P≤0.01),顯示出機體抗氧化能力下降,氧自由基增多。在血清中,干細胞、番茄紅素、干細胞聯(lián)合番茄紅素治療可以顯著改善衰老小鼠的抗氧化能力,提高超氧化物歧化酶活性,與模型組之間的差異有顯著性意義(P=0.040,0.045,0.000),同時聯(lián)合組將超氧化物歧化酶活性提高至對照組小鼠水平。在肝臟中,3個治療組超氧化物歧化酶活性與模型組相比差異有顯著性意義(P=0.022,0.037,0.000)。在大腦中,3個治療組超氧化物歧化酶活性與模型組相比差異有顯著性意義(P=0.021,0.036,0.000)。同時干細胞聯(lián)合番茄紅素治療可將超氧化物歧化酶活性提高至對照組小鼠水平。干細胞治療組、番茄紅素治療組與干細胞聯(lián)合番茄紅素治療組相比,超氧化物歧化酶活性較低,且差異有顯著性意義(P<0.05)。2.4小鼠體內(nèi)丙二醛、羥脯氨酸、mda的組織形態(tài)變化模型組丙二醛含量明顯高于對照組,組間比較差異有非常顯著性意義(P≤0.01),顯示出機體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多。在血清中,干細胞、番茄紅素、干細胞聯(lián)合番茄紅素治療可以顯著改善衰老小鼠脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多的狀況,降低丙二醛含量水平,與模型組之間的差異有顯著性意義(P=0.024,0.042,0.000),同時聯(lián)合組可將丙二醛含量降至對照組小鼠水平。在肝臟中,3個治療組丙二醛含量與模型組相比差異具有顯著性意義(P=0.030,0.029,0.000)。在大腦中,干細胞、干細胞聯(lián)合番茄紅素組丙二醛含量與模型組相比差異有顯著性意義(P=0.016,0.000)。同時聯(lián)合組可將丙二醛含量降至對照組小鼠水平,而番茄紅素治療組與模型組比較差異無顯著性意義(P=0.057)。干細胞治療組、番茄紅素治療組與干細胞聯(lián)合番茄紅素治療組相比丙二醛含量較高,且差異有顯著性意義(P<0.05)。模型組小鼠皮膚中的羥脯氨酸含量明顯低于對照組,組間比較差異有顯著性意義(P≤0.01),干細胞、番茄紅素、干細胞聯(lián)合番茄紅素治療可以顯著提高衰老小鼠皮膚中羥脯氨酸含量,延緩皮膚衰老,與模型組之間的差異有顯著性意義(P=0.034,0.037,0.000),而且干細胞聯(lián)合番茄紅素治療可將皮膚中羥脯氨酸含量提高到對照組小鼠水平。干細胞治療組、番茄紅素治療組與干細胞聯(lián)合番茄紅素治療組相比羥脯氨酸含量較低,且差異有顯著性意義(P<0.05),見圖3。人臍帶間充質(zhì)干細胞移植后第8周的組織病理切片顯示,干細胞治療組、干細胞聯(lián)合番茄紅素治療組小鼠各組織結(jié)構(gòu)清晰,均未發(fā)生壞死、明顯纖維化,未見腫瘤組織形成。與對照組及模型組比較,人臍帶間充質(zhì)干細胞移植后各組織形態(tài)無明顯異常改變,見圖4。對小鼠大腦、肺臟、肝臟、腎臟組織組織進行大量連續(xù)冰凍切片,熒光顯微鏡下可見CM-DiI標記的細胞大量分布在大腦、肺臟,在肝臟、腎臟中也有分布,但較前兩者少,見圖5。對照組及模型組中均未見紅色熒光背景干擾。3胞外因子與細胞抗氧化作用文章在建立D-半乳糖亞急性衰老小鼠模型的基礎(chǔ)上,用臍帶間充質(zhì)干細胞和番茄紅素進行干預(yù)。結(jié)果表明,經(jīng)D-半乳糖注射后小鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶活性、皮膚羥脯氨酸含量明顯下降,丙二醛含量明顯上升,目前認為D-半乳糖引起的代謝紊亂使機體過氧化反應(yīng)增強是其致老化反應(yīng)的重要因素。給動物連續(xù)注射D-半乳糖后,D-半乳糖在體內(nèi)氧化產(chǎn)生的大量自由基超過機體的清除能力,引發(fā)脂質(zhì)過氧化的鏈式反應(yīng),產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物丙二醛,加重對細胞的損傷,并伴隨著抗氧化酶超氧化物歧化酶的減少以及反映皮膚彈性的羥脯氨酸含量的降低。所以作者這次實驗采取D-半乳糖致亞急性衰老模型,并檢測機體中超氧化物歧化酶、羥脯氨酸、丙二醛的含量用以評價衰老模型制作是否成功。實驗結(jié)果確認了D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠模型的建立,從而也為后續(xù)實驗結(jié)果和理論分析的成立提供了保證。比較模型組與治療組超氧化物歧化酶活性、羥脯氨酸及丙二醛含量發(fā)現(xiàn),輸入臍帶間充質(zhì)干細胞后,小鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶活性、羥脯氨酸含量較模型組均明顯上升,而丙二醛含量則明顯下降,說明臍帶間充質(zhì)干細胞抗衰老作用顯著;經(jīng)番茄紅素灌胃后,小鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶活性、羥脯氨酸含量均較模型組明顯上升,血清、肝臟中丙二醛含量則明顯下降,說明番茄紅素具有一定的抗衰老作用;經(jīng)干細胞聯(lián)合番茄紅素治療后,小鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶活性、羥脯氨酸含量較模型組顯著提高,丙二醛含量顯著降低,其血清、大腦中的超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量以及皮膚中的羥脯氨酸含量較對照組差異不顯著,說明干細胞聯(lián)合番茄紅素治療在一定程度上可使D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠恢復(fù)至正常水平。3個治療組相比,干細胞聯(lián)合番茄紅素組小鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶活性、羥脯氨酸含量較單獨的干細胞、番茄紅素治療均明顯上升,而丙二醛含量則明顯下降,說明干細胞聯(lián)合番茄紅素治療作用優(yōu)于二者單獨治療。本實驗證實,番茄紅素在血清、肝臟中的抗氧化作用尤其是對抗丙二醛的生成效果較大腦中明顯,似乎與其在體內(nèi)的吸收、分布有關(guān)。因番茄紅素主要存在人的血液、腎上腺、肝臟、睪丸、前列腺、乳腺、卵巢、子宮、消化道等器官中,其中血液、腎上腺、睪丸、肝臟等器官中含量較高,且吸收的番茄紅素主要儲存在肝臟中,而其他組織中含量較低。但干細胞聯(lián)合番茄紅素治療在大腦中的效果卻優(yōu)于在肝臟中的效果。通過CM-DiI熒光示蹤,發(fā)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細胞輸入到衰老小鼠體內(nèi)后,腦中含量最高,其次是肺、腎、肝,此點似乎與血流量和組織結(jié)構(gòu)有關(guān)。由此作者推斷,在兩者聯(lián)合抗衰老中臍帶間充質(zhì)干細胞起主要作用。移植后的組織病理切片顯示,各組織結(jié)構(gòu)清晰,均未發(fā)生明顯壞死、纖維化,這表明將臍帶間充質(zhì)干細胞經(jīng)尾靜脈輸注到衰老小鼠體內(nèi)是非常安全的。D-半乳糖能引起生物體內(nèi)及細胞內(nèi)自由基活性的改變及氧化應(yīng)激損傷,是導(dǎo)致動物亞急性衰老及干細胞衰老的共同機制。臍帶間充質(zhì)干細胞能夠歸巢于損傷組,并且具有移植后不發(fā)生免疫反應(yīng)的特點。作者推測臍帶間充質(zhì)干細胞在此過程中的作用機制可能有以下幾個方面:組織損傷修復(fù),即臍帶間充質(zhì)干細胞進入體內(nèi)之后能夠激活小鼠體內(nèi)處于休眠狀態(tài)的干細胞,參與已經(jīng)受到過氧化和代謝累積損傷的組織和器官的修復(fù)作用,干預(yù)自由基應(yīng)激損傷使其恢復(fù)正常功能;分泌營養(yǎng)因子,促進損傷組織內(nèi)細胞增殖分化,恢復(fù)組織器官生理功能;免疫功能調(diào)節(jié),有研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞在體外和體內(nèi)試驗中能夠通過分泌可溶性因子和直接接觸調(diào)節(jié)免疫細胞增殖及其活性,降低機體的炎性反應(yīng)病變;調(diào)節(jié)代謝功能,間充質(zhì)干細胞通過其多向分化能力,增強代謝系統(tǒng)效率,進而加速機體對代謝廢物的運轉(zhuǎn)和排泄,促進對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,使機體維持正常的生理功能,從而降低因D-半乳糖造成的有害廢物的積累,干預(yù)亞急性衰老。但這些作用應(yīng)與間充質(zhì)干細胞的歸巢及其與組織細胞相互作用有關(guān),其詳細機制尚待進一步的研究。綜上所述,作者認為臍帶間充質(zhì)干細胞聯(lián)合番茄紅素較二
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