3-np對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠紋狀體的保護(hù)作用

3-np對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠紋狀體的保護(hù)作用

事實(shí)上，條紋體包括身體的學(xué)習(xí)記憶、感覺(jué)感知、運(yùn)動(dòng)和協(xié)調(diào)機(jī)。此外，hd（hunterondisease）不獨(dú)立舞蹈樣的運(yùn)動(dòng)、神經(jīng)精神障礙和認(rèn)知功能的降低明顯與線條體的機(jī)械作用有關(guān)。臨床和實(shí)驗(yàn)表明，hd的病理變化明顯伴有著條紋體。興奮毒性損害機(jī)制牽涉人類HD的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程,喹啉酸(quinolinicacid,QA)為其實(shí)驗(yàn)研究的典型動(dòng)物模型;其為谷氨酸類似物和NMDA受體激動(dòng)劑,通過(guò)促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)元谷氨酸的釋放和干擾谷氨酸的重吸收選擇性地作用紋狀體神經(jīng)元。而另一假說(shuō)是HD時(shí)神經(jīng)元線粒體代謝機(jī)能障礙牽涉到琥珀酸脫氫酶,此能量代謝損害激發(fā)NMDA受體過(guò)度激活,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載和神經(jīng)元死亡。因此,琥珀酸脫氫酶抑制劑3-硝基丙酸(3-nitropropionicacid,3-NP)作為HD能量代謝障礙機(jī)制方面的實(shí)驗(yàn)研究模型。綜觀目前HD的實(shí)驗(yàn)研究,在形態(tài)學(xué)方面仍有許多尚待證實(shí)的問(wèn)題,包括紋狀體損害的定位、神經(jīng)元損傷的類型和性質(zhì)的確切鑒定。為此,本研究以3-NP作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型探測(cè)證實(shí)3-NP誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)大鼠的運(yùn)動(dòng)行為學(xué)變化,組織學(xué)證實(shí)3NP導(dǎo)致紋狀體損害的部位,以及紋狀體不同類型神經(jīng)元對(duì)3NP損害的敏感特異性,為全面認(rèn)識(shí)HD的病理機(jī)制提供形態(tài)學(xué)資料。1材料和方法1.1動(dòng)物分組、給藥和輸注正常雄性成年SD大鼠20只,體質(zhì)量250～300g(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。3-NP(Sigma,12.5mg/mL,生理鹽水配制)腹腔注射(20mg·kg-1·d-1),2次/d,連續(xù)給藥5d。大鼠完成給藥12h后處死。用于組化和免疫組化染色的動(dòng)物,用25%水合氯醛腹腔注射麻醉(2.7mL/kg體重),經(jīng)過(guò)心臟快速灌注0.9%生理鹽水400mL,繼用4%多聚甲醛(0.1mol/LPB配制,pH7.4)400mL灌注固定。常規(guī)取腦后浸于20%蔗糖(含4%多聚甲醛)中,4℃,直至沉底。半導(dǎo)體冰凍系列切片(厚40μm),備用于各種組織學(xué)染色。1.2前嘴唇停留時(shí)間的測(cè)定于3-NP處理前5d至注射后5d(共計(jì)10d),實(shí)驗(yàn)大鼠分別進(jìn)行握力測(cè)試和平衡木測(cè)試。握力測(cè)試:在厚的泡沫墊上空50cm處懸掛一根長(zhǎng)35cm、粗2mm的鋼絲,記錄大鼠前爪在上面懸掛的時(shí)間。一天測(cè)試兩次,共10d。平衡木測(cè)試:讓大鼠從平衡木(長(zhǎng)120cm,寬7cm,離地面35cm處)的一端走到另一端的食物箱內(nèi)(24.5cm×20.0cm×18.0cm),每天測(cè)試3次,共10d。記錄大鼠前進(jìn)之前的停留時(shí)間(啟動(dòng)延擱時(shí)間,包括大鼠被放到平衡木起點(diǎn)到開(kāi)始前進(jìn)20cm的時(shí)間間隔),通過(guò)全程的時(shí)間(從大鼠被放到平衡木起點(diǎn)到鼻子剛好進(jìn)入暗箱的時(shí)間間隔),以及前爪滑落的次數(shù)(即footslips,前爪低于平衡木表面以下1.5cm的次數(shù))。如果大鼠落下或時(shí)間超過(guò)3min即為未完成。1.3免疫組化1.3.1sl組化染色取5只動(dòng)物腦塊按照常規(guī)步驟進(jìn)行切片HE和Nissl組化染色。Tunel染色嚴(yán)格按照InSituCellDeathDetectionKit,POD(Roche)試劑說(shuō)明書步驟進(jìn)行。1.3.2切片處理與形片制備取5只動(dòng)物,用0.9%生理鹽水灌注,快速取腦,置于新鮮配制的Golgi-cox溶液中,室溫,避光浸泡14d。轉(zhuǎn)入30%蔗糖,室溫,避光浸泡3～5d。振動(dòng)切片,收集于70%酒精中,裱片,晾干。DW洗1min,28%氨水1∶1(in雙蒸水)避光30min,雙蒸水洗1min,避光放置30min,梯度酒精脫水,透明,封片。1.3.3恒冷切片、烘干取5只動(dòng)物,用冷PBS(含10%甘油)灌注,快速取腦,恒冷切片。裱片,晾干。用0.3%mmol/LNBT,0.05molPB和0.05M/L琥珀酸鈉混合液染色,37℃,30min。室溫晾干,脫水,透明,封片。1.3.4小鼠和兔darpp32表達(dá)對(duì)藥敏試驗(yàn)取5只動(dòng)物腦切片。步驟如下:(1)0.1mol/LPB(pH7.4)洗3次;(2)0.3%雙氧水(0.1mol/LPB,pH7.4),室溫,30min;(3)小鼠單克隆抗NeuN抗體(1∶500,Chemicon公司),兔多克隆抗Darpp32抗體(1∶250,CellSignaling公司),4℃,36h;(4)相應(yīng)的抗小鼠或抗兔IgG(1∶100,Sigma公司),室溫,3h;(5)相應(yīng)的小鼠或兔PAP(1∶200,Sigma公司),室溫,2h;(6)DAB-H2O2顯色2～8min。各步驟之間用0.1mol/LPB(pH7.4)洗3次,每次5min。在完成顯色之后進(jìn)行裱片,常規(guī)脫水、透明、封片。1.4統(tǒng)計(jì)處理對(duì)所獲實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行均數(shù)比較的單向方差分析(one-wayANOVA),P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.13-np誘導(dǎo)前后大鼠前3-np前3-n前3-n前3-np前3-np前3-np前3評(píng)分的比較紋狀體牽涉到機(jī)體運(yùn)動(dòng)和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)機(jī)能。因此,本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)3-NP模型大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)行為學(xué)檢測(cè)和評(píng)價(jià)。平衡木測(cè)試結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)大鼠的啟動(dòng)延擱時(shí)間和完成全過(guò)程時(shí)間均比3-NP誘導(dǎo)之前明顯延長(zhǎng)(P<0.05,P<0.05,圖1C),同時(shí)顯示3-NP處理的大鼠前爪滑落次數(shù)與3-NP處理之前相比較也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,圖1A′、1D)。握力實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果顯示,3-NP處理大鼠的抓握時(shí)間也比3-NP處理之前明顯延長(zhǎng)(P<0.05,圖1B、E)。2.23golgis染色組織學(xué)(Nissl和HE染色)探察顯示3-NP誘導(dǎo)紋狀體的損傷區(qū)恒定出現(xiàn)于紋狀體的背外側(cè)區(qū),其出現(xiàn)率為80%(12/15),在損傷區(qū)(見(jiàn)圖2A,B,星號(hào)示)和周邊區(qū)神經(jīng)元發(fā)生嚴(yán)重丟失,在周邊區(qū)可見(jiàn)一些體積較大染色較深的神經(jīng)元幸存(圖2A′和B′,黑色箭頭示)和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(白色箭頭示)。經(jīng)典Golgi組化染色顯示紋狀體損傷區(qū)也在紋狀體背外側(cè)區(qū)明顯可見(jiàn)(圖2C,星號(hào)示),在周邊區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量顯著減少,受累神經(jīng)元的樹(shù)突出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化(圖2C′);可見(jiàn)樹(shù)突呈現(xiàn)銳角彎曲(白色箭頭示)和斷裂(黑色箭頭示)。琥珀酸脫氫酶SDH(succinatedehydrogenase)組化染色在紋狀體背外側(cè)區(qū)同樣出現(xiàn)一塊明顯的淡染區(qū)(圖2D,星號(hào)示),在其周圍和遠(yuǎn)離區(qū)可見(jiàn)一些深染色的細(xì)胞(圖2D′,箭頭示)。2.3經(jīng)元數(shù)量的變化業(yè)已證實(shí),NeuN為神經(jīng)元特異性抗體。借助此抗體染色顯示3-NP導(dǎo)致紋狀體背外側(cè)呈現(xiàn)一塊恒定的損傷區(qū)(圖3A★),在其周圍可見(jiàn)一個(gè)淡染色環(huán),在紋狀體損傷區(qū)域神經(jīng)元絕大部分均已丟失,損傷周邊區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量也顯著減少(圖3A′)。同時(shí)借助Darpp-32免疫組化染色(此被證實(shí)為紋狀體投射神經(jīng)元的特異性抗體)顯示3-NP組的紋狀體背外側(cè)區(qū)(圖3B,★)同樣出現(xiàn)一塊恒定的病灶區(qū),該區(qū)域少見(jiàn)幸存的神經(jīng)元,在損傷周邊區(qū)神經(jīng)元的丟失(圖3B′)比NeuN陽(yáng)性神經(jīng)元更嚴(yán)重(圖3A′),而且幸存的多為體積較大的神經(jīng)元。Tunel組化為神經(jīng)元凋亡的特異性染色,結(jié)果顯示正常紋狀體少見(jiàn)Tunel陽(yáng)性細(xì)胞,但在3-NP組紋狀體的損傷區(qū)(圖3C,★)及其周邊區(qū)均可見(jiàn)大量Tunel陽(yáng)性細(xì)胞,高倍鏡觀察顯示(圖3C′)這些陽(yáng)性細(xì)胞明顯呈現(xiàn)大(見(jiàn)圖3C′白色箭頭所示)、小(黑色箭頭所示)兩種形態(tài)。3討論3.1hd動(dòng)物模型的篩選HD是一種常染色體顯性遺傳性神經(jīng)退變性疾病,臨床表現(xiàn)為不自主的舞蹈樣運(yùn)動(dòng)、神經(jīng)精神障礙和認(rèn)知機(jī)能低下等特征,其病理學(xué)特征主要是紋狀體嚴(yán)重萎縮和神經(jīng)元大量丟失。盡管Htt(Huntingtin)基因現(xiàn)在已被鑒定并證實(shí)為HD的始動(dòng)因素,興奮毒性、代謝障礙和氧化應(yīng)激仍然被認(rèn)為是導(dǎo)致HD紋狀體神經(jīng)元死亡的重要原因。目前常用的HD動(dòng)物模型有紋狀體注射QA和腹腔注3-NP模型;前者所使用的QA為谷氨酸類似物和NMDA受體激動(dòng)劑,通過(guò)促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)元谷氨酸的釋放和干擾谷氨酸的重吸收選擇性地作用于紋狀體神經(jīng)元。3-NP是琥珀酸脫氫酶的不可逆抑制劑,通過(guò)阻斷三羧酸循環(huán)或線粒體電子傳輸鏈上的復(fù)合物-2產(chǎn)生毒性作用。3-NP模型與臨床HD在病理變化和行為表現(xiàn)方面極為相似,由于3-NP能產(chǎn)生相對(duì)選擇性的紋狀體神經(jīng)元死亡,從而完美地模擬人類HD的病理學(xué)和行為學(xué)特征。本實(shí)驗(yàn)為此采用3-NP大鼠模型,目前的平衡木和握力運(yùn)動(dòng)行為學(xué)測(cè)試結(jié)果再一次證實(shí)3-NP注射明顯導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)大鼠的肌肉強(qiáng)直和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)障礙。具有重要意義的是本實(shí)驗(yàn)從組織病理學(xué)方面的探測(cè)顯示,3-NP誘導(dǎo)大鼠紋狀體的損傷恒定出現(xiàn)于紋狀體的背外側(cè)區(qū),而且主要病理變化為大量神經(jīng)元的丟失,結(jié)合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)行為學(xué)嚴(yán)重障礙,這些結(jié)果明顯提示3-NP對(duì)紋狀體的損害具有選擇特異性,更為重要的是可以借助此結(jié)果反證紋狀體背外側(cè)區(qū)域的運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)能。因此,本實(shí)驗(yàn)?zāi)壳暗馁Y料對(duì)于后續(xù)深入研究紋狀體生理機(jī)能和HD病理機(jī)制具有重要價(jià)值。3.2紋狀體映射神經(jīng)元形態(tài)學(xué)研究證實(shí),紋狀體是基底核的主要成分,與隨意運(yùn)動(dòng)的穩(wěn)定、肌張力的維持以及肢體姿勢(shì)的調(diào)節(jié)活動(dòng)相關(guān)。紋狀體如此碩大的實(shí)質(zhì)性團(tuán)塊,主要由大量的神經(jīng)元所構(gòu)成。因此,紋狀體的細(xì)胞構(gòu)筑極其復(fù)雜,其神經(jīng)元在形態(tài)學(xué)方面主要分為投射神經(jīng)元和中間神經(jīng)元兩大類型。前者包括紋狀體-黑質(zhì)(直接通路)和紋狀體-蒼白球(間接通路)神經(jīng)元。后者包括膽堿能神經(jīng)元,GABA/Parvalbumin神經(jīng)元和Somatostasin/NOS神經(jīng)元等。有研究顯示,HD疾病主要損傷紋狀體的投射神經(jīng)元,而中間神經(jīng)元?jiǎng)t相對(duì)幸免。因此,本文目前的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中所借用的兩種神經(jīng)元特異性標(biāo)記物,一種特異性地標(biāo)記全部神經(jīng)元(包括中間神經(jīng)元和投射神經(jīng)元);另一種僅僅特異性地標(biāo)記紋狀體投射神經(jīng)元。雖然兩種免疫組化結(jié)果均顯示3-NP誘導(dǎo)紋狀體神經(jīng)元的嚴(yán)重丟失,但結(jié)果明顯證實(shí)紋狀體投射神經(jīng)元的丟失更為嚴(yán)重。為進(jìn)一步證實(shí)3-NP的作用機(jī)理和紋狀體神經(jīng)元的損傷性質(zhì),本實(shí)驗(yàn)結(jié)合SDH染色結(jié)果顯示,在3-NP所誘導(dǎo)的紋狀體損害區(qū)受累神經(jīng)元SDH的活性明顯降低,而在損傷周邊及其遠(yuǎn)離區(qū)出現(xiàn)一些較大體積神經(jīng)元的SDH強(qiáng)烈反應(yīng),這些神經(jīng)元在