小葉蓮提取物抗乳腺癌活性研究

小葉蓮提取物抗乳腺癌活性研究

小葉蓮?fù)ǔＪ且环N藏藥。這是一種干燥、成熟的水果。它不僅具有活血調(diào)經(jīng)的功能，還具有明顯的腫瘤活性。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn),小葉蓮乙醇提取物(X1)以及主要成分8,2’-二異戊烯基槲皮素-3-甲醚(S1)對于人乳腺癌細胞增殖有抑制作用。為此,擬繼續(xù)對X1、小葉蓮的乙酸乙酯提取物(X2)、小葉蓮正丁醇提取物(X3)以及小葉蓮主要成分S1和槲皮素(S2)進行體內(nèi)、外抗乳腺腫瘤活性研究,旨在闡明小葉蓮抗乳腺癌活性作用和其物質(zhì)基礎(chǔ),為新藥研發(fā)和臨床用藥提供依據(jù)。其中,小葉蓮不同極性提取物和異戊烯基黃酮類化合物的體內(nèi)抗乳腺腫瘤研究尚屬首次報道。1材料表面1.1流式細胞術(shù)和酶標(biāo)儀超凈工作臺(北京偉達凈化廠);CP214型電子天平(美國Ohaus公司);培養(yǎng)箱(德國Binder公司);流式細胞儀(美國BDPharmingen公司);VersaMax型酶標(biāo)儀(美國MolecularDevices公司);CKX31型倒置顯微鏡(日本Olympus公司);96孔板(美國CorningCostar公司)。1.2晶珠藏藥公司小葉蓮,2009年10月購于青海晶珠藏藥公司,產(chǎn)地為青海,憑證標(biāo)本(編號:6339)存放于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院生藥標(biāo)本室。1.3培養(yǎng)基和胎牛血清環(huán)磷酰胺(CTX,美國AcrosOrganics公司,批號:A1064185);碘化丙錠(PI)、磺酰羅丹明B、核糖核酸酶RNase(美國Sigma公司);1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司);二甲基亞砜(DMSO)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)均為分析純,購自北京化工廠。1.4[實驗動物使用許可證]scxkBalb/c裸小鼠,♀,4~6周齡,體質(zhì)量(19.0±2.5)g,由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供[實驗動物使用許可證:SCXK(京)2011-0012]。人乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB-231均由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院藥劑學(xué)系呂萬良教授惠贈。2方法2.1凍干粉的制備取小葉蓮干燥藥材17.5kg,粉碎為粗粉,以8倍量的95%乙醇回流提取2次,每次2h,50%乙醇提取1h,提取液合并后濃縮至基本無醇味,得到4.17kgX1。取4.01kgX1,加蒸餾水12L至完全懸浮后,依次用等倍體積乙酸乙酯、水飽和正丁醇各提取5次。提取液分別減壓回收溶劑,得各提取物。其中,X2為深棕色浸膏1150.0g,X3為紅棕色浸膏794.8g。分別取X1、X2、X3各10g,制成凍干粉,備用。每1gX1相當(dāng)于原生藥4.19g,每1gX2相當(dāng)于原生藥14.5g,每1gX3相當(dāng)于原生藥20.9g。S1和S2為筆者從小葉蓮中分離得到并經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定,二者純度>98.0%。2.2dmso貯備液和體外細胞實驗用2.2.1小葉蓮提取物溶液的制備取X1、X2、X3凍干粉適量,以蒸餾水制備成質(zhì)量濃度為100mg/ml的蒸餾水貯備液(供動物實驗用);以DMSO制備成質(zhì)量濃度為10mg/ml的DMSO貯備液(供體外細胞實驗用)。2.2.2S1和S2溶液的制備取S1和S2適量,以0.5%CMC-Na制備成質(zhì)量濃度為1.5mg/ml的0.5%溶液(供動物實驗用);以DMSO制備成濃度為10μmol/ml的DMSO貯備液(供體外細胞實驗用)。2.3細胞內(nèi)添加dmso人乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231復(fù)蘇后,于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3d傳代培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的貼壁腫瘤細胞以200μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板,每孔8000個細胞。貼壁生長24h后給藥。制備4種質(zhì)量濃度的X1、X2、X3溶液(1、25、50、100μg/ml)和4種濃度的S1和S2溶液(12.5、25、50、100μmol/L)。每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。48h取出培養(yǎng)板,每孔加入10%(m/V)的三氯乙酸(TCA)100μl固定細胞,4℃放置1h。棄固定液,用蒸餾水洗滌5次,空氣中自然干燥,每孔加磺酰羅明B溶液100μl,室溫下放置10~30min。用1%醋酸洗滌5次,自然干燥。最后加入150μl/孔Tris溶液,在平板振蕩器上振蕩5min。用酶標(biāo)儀在515nm波長處測定光密度(OD),用空白對照調(diào)零。以細胞內(nèi)加DMSO作模型對照。按下式計算腫瘤細胞生長的抑制率:抑制率=(OD模型對照-OD給藥)/OD515模型對照×100%。2.4小葉蓮提取物對蓮花腫瘤大鼠mcf-7移植瘤的抑制作用2.5統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)以x±s表示,采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。多組間單因素比較先用單因素分析其正態(tài)分布,后以LSD法進行統(tǒng)計。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3結(jié)果3.1人乳腺癌細胞對mb-33的抑制作用X1、X2可較強抑制人乳腺癌細胞MCF-7,X3的抑制作用較弱,3種提取物的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為39.51、55.18、89.10μg/ml。X1、X2、X3對人乳腺癌細胞MDA-MB-231的抑制作用較弱,IC50分別為101.70、96.09、196.00μg/ml。S1、S2對人乳腺癌細胞MCF-7有較強抑制作用,IC50分別為17.67、39.87μmol/L;S1、S2對人乳腺癌細胞MDA-MB-231的抑制作用較弱,IC50分別為36.33、58.76μmol/L。小葉蓮提取物、S1、S2對人乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231的抑制作用分別見表1、表2。3.2被模型1對荷瘤小鼠mcf-7移植瘤體積的抑制作用與模型組比較,X1組、X2組、X3組、S1組、S2組荷瘤小鼠MCF-7移植瘤質(zhì)量減輕,瘤質(zhì)量抑制率明顯升高(P<0.01或P<0.05)。S1、S2對荷瘤小鼠MCF-7移植瘤體積的抑制作用相似。與模型組比較,第3~6天,S1組瘤體積抑制率大于CTX組及S2組;第6~9天,模型組移植瘤體積繼續(xù)增長,而S1組移植瘤體積未增大,S2組移植瘤體積減小。X1、X2、X3對荷瘤小鼠MCF-7移植瘤的抑制作用分別見表3、表4;S1、S2對荷瘤小鼠MCF-7移植瘤質(zhì)量、體積的抑制作用分別見表5、表6。4黃酮類化合物X1、X2對人乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231以及荷瘤小鼠移植瘤有較強的抑制作用,與其主要成分為木質(zhì)素和黃酮有關(guān)。而X3對人乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231以及荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用均較弱,可能因為X3雖然含有黃酮苷和木脂素苷類化合物,但同時含有大量大分子物質(zhì),掩蓋了其活性,因此抗腫瘤作用不明顯。黃酮類化合物被認為具有植物雌激素作用以及線粒體毒性,具有較好的抗腫瘤活性。S1對人乳腺癌細胞MCF-7的抑制作用強于S2,可能是因為異戊烯基取代所致。而S2為S1的黃酮母核,對于多種細胞株在體內(nèi)、外均有較好的抑制作用,從而證明研究S1的體內(nèi)、外抗腫瘤活性有一定意義。乳腺癌為女性常見腫瘤之一,目前運用類雌激素替代治療越來越受到重視。而黃酮類化合物具有類雌激素的生物活性,并且對乳腺癌有抑制作用。通過比較S1和S2對激素依賴型人乳腺癌細胞株體外細胞增殖抑制作用以及對裸小鼠移植瘤的抑制作用,初步得出結(jié)論:具有異戊烯基取代的黃酮類化合物不僅在離體實驗中活性較好,同時在體內(nèi)實驗中也有較好的活性,推測與異戊烯基黃酮的類雌激素作用相關(guān)。從傳統(tǒng)醫(yī)藥中尋找具有活性的天然產(chǎn)物作為先導(dǎo)化合物是創(chuàng)新藥物的研究方向之一。本研究結(jié)果可為小葉蓮的開發(fā)和利用提供依據(jù)。2.4.1模型的復(fù)制人乳腺癌細胞MCF-7復(fù)蘇后,置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3d傳代培養(yǎng)。將貼壁細胞用PBS洗2次,用0.25%胰酶消化,1640培養(yǎng)基(含10%血清)終止消化后,吹打成細胞懸液,計數(shù),離心收集,PBS洗2次,離心收集。加入PBS,使細胞密度為5×107ml-1,每只裸小鼠腋下注射200μl。正常喂養(yǎng)4d后,裸小鼠腋下長出腫瘤塊。處死裸小鼠,無菌操作下取瘤塊,除去邊緣壞死組織部分。將取下的瘤塊以相同大小(3mm3)包埋于每只裸小鼠右側(cè)腋窩皮下。2.4.2分組與給藥(1)X1對荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用:實驗分為3組,即模型組(等容生理鹽水)組、X1(500mg/kg)組、CTX(15mg/kg)組。復(fù)制模型第2天后ig給藥,每天1次,連續(xù)15d。末次給藥1d后處死小鼠,先稱體質(zhì)量,后解剖皮下瘤塊,稱瘤質(zhì)量。裸小鼠實際體質(zhì)量為所稱體質(zhì)量減去瘤質(zhì)量。計算瘤質(zhì)量抑制率[瘤質(zhì)量抑制率(%)=(1-用藥組平均瘤質(zhì)量/模型組平均瘤質(zhì)量)×100%]。(2)X2、X3對荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用:實驗分為4組,即模型(等容生理鹽水)組、X2(500mg/kg)組、X3(500mg/kg)組、CTX(15mg/kg)組。給藥與指標(biāo)檢測同“2.4.2(1)”項下方法。(3)S1和S2對荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用:實驗分為4組,即模型組(等容生理鹽水)組、S1