酶促反應動力學(有方程推導過程)

3.4酶促反響動力學酶促反響動力學(kineticsofenzyme-catalyzedreactions)是研究酶促反響速度及其影響因素的科學。酶促反響的影響因素主要包括酶的濃度、底物的濃度、pH、溫度、抑制劑和激活劑等。酶促反響動力學.一.酶濃度的影響在一定溫度和pH下，酶促反響在底物濃度大于100Km時，速度與酶的濃度呈正比。酶濃度對速度的影響機理：酶濃度增加，[ES]也增加，而V=k3[ES]，故反響速度增加。.二.溫度對酶促反響速度的影響酶促反響與其它化學反響一樣，隨溫度的增加，反響速度加快。化學反響中溫度每增加10℃反響速度增加的倍數(shù)稱為溫度系數(shù)Q10。一般的化學反響的Q10為2～3，而酶促反響的Q10為1～2。在一定范圍內，反響速度到達最大時對應的溫度稱為該酶促反響的最適溫度〔optimumtemperatureTm〕.一般動物組織中的酶其最適溫度為35～40℃，植物與微生物中的酶其最適溫度為30～60℃，少數(shù)酶可達60℃以上，如細菌淀粉水解酶的最適溫度90℃以上。.溫度對酶促反響速度的影響機理：1.溫度影響反響體系中的活化分子數(shù)：溫度增加，活化分子數(shù)增加，反響速度增加。2.溫度影響酶的活性：過高的溫度使酶變性失活，反響速度下降。最適溫度不是酶的特征常數(shù)，因為一種酶的最適溫度不是一成不變的，它要受到酶的純度、底物、激活劑、抑制劑、酶反響時間等因素的影響。因此，酶的最適溫度與其它反響條件有關。..三.pH對酶促反響速度的影響大多數(shù)酶的活性受pH影響顯著，在某一pH下表現(xiàn)最大活力，高于或低于此pH，酶活力顯著下降。酶表現(xiàn)最大活力的pH稱為酶的最適pH(optimumpHpHm)。典型的酶速度-pH曲線是較窄的鐘罩型曲線，但有的酶的速度-pH曲線并非一定呈鐘罩型。如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的速度-pH曲線。胃蛋白酶的速度-溫度曲線如以以下圖：.胃蛋白酶和葡萄糖-6-磷酸酶的pH活性曲線：..pH對酶促反響速度的影響機理：1、pH影響酶和底物的解離:酶的活性基團的解離受pH影響，底物有的也能解離，其解離狀態(tài)也受pH的影響，在某一反響pH下，二者的解離狀態(tài)最有利于它們的結合，酶促反響表現(xiàn)出最大活力，此pH稱為酶的最適pH；當反響pH偏離最適pH時，酶促反響速度顯著下降。2、pH影響酶分子的構象：過高或過低pH都會影響酶分子活性中心的構象，或引起酶的變性失活。.

動物體內多數(shù)酶的最適pH值接近中性，但也有例外，如胃蛋白酶的最適pH約1.8，肝精氨酸酶最適pH約為9.8(見下表)。一些酶的最適pH.1902年，Henri用蔗糖酶水解蔗糖的實驗中觀察到：在蔗糖酶酶的濃度一定的條件下測定底物〔蔗糖〕濃度對酶反響速度的影響,它們之間的關系呈現(xiàn)矩形雙曲線(rectangularhyperbola)。如以以下圖所示：四、底物濃度對反響速度的影響1、酶反響與底物濃度的關系..在底物濃度很低時，反響速度隨底物濃度的增加而急驟加快，兩者呈正比關系，表現(xiàn)為一級反應。隨著底物濃度的升高，反響速度不再呈正比例加快，反響速度增加的幅度不斷下降。如果繼續(xù)加大底物濃度，反響速度不再增加，表現(xiàn)為零級反響。此時，無論底物濃度增加多大，反響速度也不再增加，說明酶已被底物所飽和。所有的酶都有飽和現(xiàn)象，只是到達飽和時所需底物濃度各不相同而已。.為解釋酶被底物飽和現(xiàn)象，Michaelis和Menten做了大量的定量研究，積累了足夠的實驗數(shù)據(jù)，提出了酶促反響的動力學方程：.[ES]生成速度：，[ES]分解速度：當酶反應體系處于恒態(tài)時：即：令：則：(1)經整理得：由于酶促反應速度由[ES]決定，即，所以(2)將（2）代入（1）得：(3)當[Et]=[ES]時，(4)所以

將〔4〕代入〔3〕，那么：.Vmax指該酶促反響的最大速度，[S]為底物濃度，Km是米氏常數(shù)，V是在某一底物濃度時相應的反響速度。從米氏方程可知：當?shù)孜餄舛群艿蜁r[S]<<Km,那么V≌Vmax[S]/Km，反響速度與底物濃度呈正比;當?shù)孜餄舛群芨邥r，[S]>>Km，此時V≌Vmax，反響速度達最大速度，底物濃度再增高也不影響反響速度。.2.米氏常數(shù)的意義〔1〕.物理意義：Km值等于酶反響速度為最大速度一半時的底物濃度?！?〕.Km值愈大，酶與底物的親和力愈??；Km值愈小，酶與底物親和力愈大。酶與底物親和力大，表示不需要很高的底物濃度，便可容易地到達最大反響速度?！?〕.Km值是酶的特征性常數(shù)，只與酶的性質，酶所催化的底物和酶促反響條件(如溫度、pH、有無抑制劑等)有關，與酶的濃度無關。酶的種類不同，Km值不同，同一種酶與不同底物作用時，Km值也不同。各種酶的Km值范圍很廣，大致在10-1～10-6M之間。.3.Km在實際應用中的重要意義〔1〕鑒定酶：通過測定可以鑒別不同來源或相同來源但在不同發(fā)育階段、不同生理狀態(tài)下催化相同反響的酶是否屬于同一種酶?！?〕判斷酶的最正確底物：如果一種酶可作用于多個底物,就有幾個Km值，其中Km最小對應的底物就是酶的天然底物。如蔗糖酶既可催化蔗糖水解(Km=28mmol/L),也可催化棉子糖水解(Km=350mmol/L),兩者相比，蔗糖為該酶的天然底物?！?〕計算一定速度下的底物濃度：如某一反響要求的反響速度到達最大反響速度的99%，那么[S]=99Km.〔4〕了解酶的底物在體內具有的濃度水平：一般地，體內酶的天然底物的[S]體內≈Km，如果[S]體內<<Km,那么V<<Vmax，細胞中的酶處于“浪費〞狀態(tài)，反之，[S]體內>>Km，那么V≈Vmax，底物濃度失去生理意義，也不符合實際狀態(tài)?！?〕判斷反響方向或趨勢：催化正逆反響的酶，其正逆兩向的反響的Km不同，如果正逆反響的底物濃度相當，那么反響趨向于Km小對應底物的反響方向。.稱為Lineweaver-Buck方程〔或雙倒數(shù)方程〕(doublereciprocalplotorLineweaverBurkplot)方程：

用1/V0對1/[S]的作圖得一直線，其斜率是Km/Vmax,，在縱軸上的截距為1/Vmax,橫軸上的截距為-1/Km。此作圖除用來求Km和Vmax值外，在研究酶的抑制作用方面還有重要價值。

.雙倒數(shù)作圖法.五.激活劑對酶反響速度的影響能使酶活性提高的物質，都稱為激活劑(activator)，其中大局部是離子或簡單的有機化合物。如Mg++是多種激酶和合成酶的激活劑，動物唾液中的α-淀粉酶那么受Cl-的激活。特點：1、酶對激活劑有一定的選擇性，一種酶的激活劑對另一種酶來說可能是抑制劑2、有一定的濃度要求，當激活劑的濃度超過一定的范圍時，它就成為抑制劑。

.激活劑.六、抑制劑對反響速度的影響凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白變性的物質稱為酶的抑制劑(inhibitor)。使酶變性失活(稱為酶的鈍化)的因素如強酸、強堿等，不屬于抑制劑。通常抑制作用分為可逆性抑制和不可逆性抑制兩類。

..〔一〕不可逆性抑制作用(irreversibleinhibition)不可逆性抑制作用的抑制劑，通常以共價鍵方式與酶的必需基團進行不可逆結合而使酶喪失活性。常見的不可逆抑制劑如以以下圖所示。按其作用特點，又分專一性及非專一性兩種。

..1.非專一性不可逆抑制抑制劑與酶分子中一類或幾類基團作用，不管是必需基團與否，皆可共價結合，由于其中必需基團也被抑制劑結合，從而導致酶的抑制失活。某些重金屬(Pb++、Cu++、Hg++)及對氯汞苯甲酸等，能與酶分子的巰基進行不可逆適合，許多以巰基作為必需基團的酶(通稱巰基酶)，會因此而遭受抑制，屬于此種類型。用二巰基丙醇(britishantilewisite,BAL)或二巰基丁二酸鈉等含巰基的化合物可使酶復活。..2.專一性不可逆抑制

此屬抑制劑專一地作用于酶的活性中心或其必需基團，進行共價結合，從而抑制酶的活性。有機磷殺蟲劑能專一作用于膽堿酯酶活性中心的絲氨酸殘基，使其磷?；豢赡嬉种泼傅幕钚?。當膽堿酯酶被有機磷殺蟲劑抑制后，乙酰膽堿不能及時分解成乙酸和膽堿，引起乙酰膽堿的積累，使一些以乙酰膽堿為傳導介質的神經系統(tǒng)處于過度興奮狀態(tài)，引起神經中毒病癥。解磷定等藥物可與有機磷殺蟲劑結合，使酶和有機磷殺蟲劑別離而復活。..(二)可逆性抑制(reversibleinhibition)

抑制劑與酶以非共價鍵結合，在用透析等物理方法除去抑制劑后，酶的活性能恢復，即抑制劑與酶的結合是可逆的。

.1.競爭性抑制(competitiveinhibition)(1)含義和反響式抑制劑I和底物S結構相似，抑制劑I和底物S對游離酶E的結合有競爭作用，互相排斥，已結合底物的ES復合體，不能再結合I。同樣已結合抑制劑的EI復合體，不能再結合S。..〔2〕特點：①抑制劑I與底物S在化學結構上相似，能與底物S競爭酶E分子活性中心的結合基團.例如，丙二酸、蘋果酸及草酰乙酸皆和琥珀酸的結構相似，是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑。.

②抑制程度取決于抑制劑與底物的濃度比、〔ES〕和〔EI〕的相對穩(wěn)定性；③加大底物濃度，可使抑制作用減弱甚至消除。.〔3〕競爭性抑制劑的動力學方程

E+SESE+PE+IEIk1k2k3由米氏方程得：Km＝①Ki＝②

〔E〕＝〔E〕t－〔ES〕－〔EI〕③〔E〕〔S〕〔ES〕〔E〕〔I〕〔EI〕ki.解方程①②③得：〔ES〕=〔E〕t〔1+〕＋1Km〔S〕〔I〕Ki又因vi＝k3〔ES〕,代入上式得：Vi＝〔1+〕＋〔S〕Km〔I〕KiVmax〔S〕.競爭性抑制劑雙倒數(shù)曲線，如以以下圖所示：有競爭性抑制劑存在的曲線與無抑制劑的曲線相交于縱坐標I/Vmax處，但橫坐標的截距，因競爭性抑制存在變小，說明該抑制作用，并不影響酶促反響的最大速度Vmax，而使Km值變大。1vi＝〔1+〕KmVmax〔S〕1+Vmax1〔I〕Ki.很多藥物都是酶的競爭性抑制劑。例如磺胺藥與對氨基苯甲酸具有類似的結構，而對氨基苯甲酸、二氫喋呤及谷氨酸是某些細菌合成二氫葉酸的原料，后者能轉變?yōu)樗臍淙~酸，它是細菌合成核酸不可缺少的輔酶。由于磺胺藥是二氫葉酸合成酶的競爭性抑制劑，進而減少細菌體內四氫葉酸的合成，使核酸合成障礙，導致細菌死亡?？咕鲂?甲氧芐氨嘧啶(TMP)能特異地抑制細菌的二氫葉酸復原為四氫葉酸，故能增強磺胺藥的作用。.磺胺藥物的抑菌作用.2.非競爭性抑制(non-competitiveinhibition)(1)含義和反響式抑制劑I和底物S與酶E的結合完全互不相關，既不排斥，也不促進結合，抑制劑I可以和酶E結合生成EI，也可以和ES復合物結合生成ESI。底物S和酶E結合成ES后，仍可與I結合生成ESI，但一旦形成ESI復合物，再不能釋放形成產物P。..〔2〕特點：①I和S在結構上一般無相似之處，I常與酶分子上結合基團以外的化學基團結合，這種結合并不影響底物和酶的結合，增加底物濃度并不能減少I對酶的抑制。②非競爭性抑制劑的雙倒數(shù)曲線：有非競爭性抑制劑存在的曲線與無抑制劑的曲線相交于橫坐標-1/Km處，但縱坐標的截距，因競爭性抑制存在變大，說明該抑制作用，并不影響酶促反響的Km值，而使Vmax值變小，如以以下圖所示：.非競爭性抑制Vi＝Vmax〔S〕(1+)〔I〕KiKm+()〔S〕1Vi＝〔1+〕〔I〕Ki×〔＋〕1VmaxKmVmax1〔S〕.3.反競爭性抑制(1)含義和反響式反競爭性抑制劑必須在酶結合了底物之后才能與酶與底物的中間產物結合，該抑制劑與單獨的酶不結合。

..〔2〕特點：反競爭性抑制劑存在下，Km、Vmax都變小。1Vi＝KmVmax1〔S〕+1Vmax〔I〕Ki(1+)Vi＝Vmax〔S〕〔S〕〔I〕Ki〔1＋〕Km＋..3.5酶的別離純化及活力測定一、酶的別離提純〔一〕酶在細胞中的分布：胞外酶：水解酶類，易收集，不必破碎細胞，緩沖液或水浸泡細胞或發(fā)酵液離心得到上清液即為含酶液。胞內酶：除水解酶類外的其它酶類，需破碎細胞，不同的酶分布部位不同，最好先將酶存在的細胞器別離后再破碎該細胞器，然后將酶用適當?shù)木彌_溶液或水抽提。.〔二〕別離材料：動植物原料或微生物的發(fā)酵液。微生物發(fā)酵液是用于別離酶的最常用材料，因為微生物種類多，繁殖快，培養(yǎng)時間短，含酶豐富。由微生物發(fā)酵產生的酶或其它生物組織中的酶因含有大量的其它物質，所以必須經過別離、提純、結晶等階段才可做實際應用。對于某種酶的具體制備方案，應通過了解酶的來源、性質及純度需要來確定，無固定的方案。.〔三〕原那么：在增加酶得率和純度的同時，盡可能防止高溫、過酸、過堿、劇烈的震蕩及其它可能使酶喪失活力的一切操作過程。盡最大可能保存酶的活力?！菜摹硠e離提純：1.酶的抽提：將酶溶解出來就稱為抽提。胞外酶：固體培養(yǎng)的菌體加水或適當緩沖溶液浸泡過濾即可。液體培養(yǎng)的菌體將發(fā)酵液離心別離除去菌體收集離心液即可。胞內酶：先破碎細胞，再用水或適當?shù)木彌_溶液抽提。.2.酶的純化：純化的關鍵是維持酶的活性，因為隨著酶的逐漸提純，一些天然的可保持酶活力的其它成分逐漸減少，酶的穩(wěn)定性變差，所以整個純化過程應維持低溫?！?〕酶的沉淀方法：與蛋白質的沉淀方法相同，常用：①鹽析法：常用硫酸銨鹽析，有分段鹽析和一次性鹽析兩種方法。②有機溶劑沉淀法：用乙醇、丙酮等。應低溫操作，溶劑少量分批參加。③等電點沉淀法.〔2〕酶的純化方法：有吸附層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等.3.酶的結晶：純化以后的酶液再次沉淀，仍采用沉淀法。4.酶的保存：

一般在-20℃以下低溫保存。.二、酶活力的測定

定性鑒定提取物中某一酶是否存在，一般是根據(jù)此酶引起的化學反響來判斷，如檢驗在提取物中是否存在淀粉酶。那么用提取物與淀粉反響，一段時間以后，用碘-碘化鉀與反響液反響，假設變藍，說明提取物無淀粉酶活力；反之，提取物有淀粉酶的活力。酶活力的測定：實際上是酶定量測定的方法，酶制劑因含雜質多易失活等原因，故不能用稱重或測量體積來定量。.〔一〕酶活力的概念：

指酶催化特定化學反響的能力。其大小通常用在一定條件下酶催化某一特定化學反響的速度來表示。一定量的酶制劑催化某一化學反響速度快，活力大；反之，活力小。速度表示法常用-dS/dt或dP/dt，測初速度，多用后者。因為反響初期底物過量，底物的減少量不容易測定，而產物從無到有，易測定。.〔二〕酶的活力單位：1961年國際生化協(xié)會酶學委員會統(tǒng)一規(guī)定，酶的國際單位〔IU〕規(guī)定為：在最適反響條件〔溫度25℃〕下，每分鐘內催化1微摩爾〔μmol〕底物轉化為產物所需的酶量〔或1分鐘內轉化底物生成1微摩爾產物的酶量〕稱為1標準單位。測定條件：最正確的反響條件，如最適的T〔或25℃〕、最適pH、[S]>>[E]、初速度下。1972年國際生化協(xié)會又推薦一種新單位，即Katal(Kat)單位。規(guī)定：在最適溫度下，每秒鐘能催化1摩爾底物轉化的酶量定義為1Kat。1Kat=60×106IU...(三)酶的比活力：

每單位酶蛋白所含的活力單位數(shù)。對固體酶：用活力單位/mg酶蛋白、或活力單位/mg酶蛋白氮來表示；對液體酶：用活力單位/ml酶液來表示。很明顯，比活力越大，酶的活力越大。.〔五〕酶活力的測定方法1、分光光度法：產物與適當?shù)幕瘜W試劑生成有色物質或產物有紫外吸收的能力可采用此法。2、測壓法：產物中有氣體，測氣壓增加量。3、滴定法：產物中有酸生成，用堿滴定。4、熒光法：產物中有熒光物質生成或產物與熒光試劑反響生成熒光產物可用此法。5、旋光法：產物中有旋光物質可采用此法。除了以上方法外，還可根據(jù)產物的性質采用其它方法。.三、回收率和純化倍數(shù)回收率＝×100％每次總活力第一次總活力純化倍數(shù)＝每次比活力第一次比活力酶的回收率和純化倍數(shù)的測定常在酶別離過程中的每個環(huán)節(jié)中進行。一個正常、合理的純化程序，隨著純化的進行，總蛋白量逐漸減少，比活力不斷增加，純化倍數(shù)提高了，但回收率降低。.一、變構酶與變構調節(jié)〔一〕按動力學分類：調節(jié)酶：凡能通過構象變化或亞基解聚或亞基修飾等方式來改變酶活性而對代謝起調節(jié)作用的酶稱為調節(jié)酶?！补矁r調節(jié)酶、別構酶〕、非調節(jié)酶變構酶又稱為別構酶，指調節(jié)物與酶分子的調節(jié)部位以非共價鍵結合后，引起酶的構象的改變，進而改變酶的活性狀態(tài)，酶的這種調節(jié)作用稱為變構調節(jié)(allostericregulation)，具有變構調節(jié)的酶稱變構酶(allostericenzyme)。凡能使酶分子發(fā)生別構作用的物質稱為變構劑或調節(jié)物調節(jié)物能使酶活性增加的效應叫正協(xié)同效應，該調節(jié)物叫正調節(jié)物〔如底物〕調節(jié)物能使酶活性降低的效應叫負協(xié)同效應，該調節(jié)物叫負調節(jié)物.通過其它酶對其多肽鏈某些基團進行可逆共價修飾，使處于活性與非活性的互變狀態(tài)，從而調節(jié)酶活性；共價修飾主要是磷酸化、腺苷?；?、甲基化等。如在蛋白激酶作用下發(fā)生磷酸化，主要的蛋白激酶有蛋白激酶A，磷酸化酶激酶，蛋白酪氨酸激酶等；共價調節(jié)酶是寡聚酶，且在每個亞基上都含有共價修飾的位點。.變構酶多為寡聚酶，含的亞基數(shù)一般為偶數(shù)；且分子中有催化部位〔結合底物〕與調節(jié)部位〔結合變構劑〕，這兩部位可以在不同的亞基上，或者在同一亞基的兩個不同部位。..〔二〕變構酶作用特點1、正協(xié)同效應的變構酶其速度-底物濃度曲線呈S形，如大腸桿菌的天冬氨酸轉甲?；浮睞TCase〕對底物天冬氨酸的結合表現(xiàn)為正協(xié)同效應。.2、負協(xié)同效應的變構酶其速度-底物濃度曲線為類似雙曲線。如3-磷酸甘油醛脫氫酶對NAD+的結合為負協(xié)同效應，..3、由于變構酶動力學不符合米-曼氏酶的動力學，所以當反響速度到達最大速度一半時的底物的濃度，不能用Km表示，而代之以K0.5S表示。.〔三〕生理意義1、在正協(xié)同效應的變構酶的S形曲線中段，底物濃度稍有降低，酶的活性明顯下降，多酶體系催化的代謝通路可因此而被關閉；反之，底物濃度稍有升高，那么酶活性迅速上升，代謝通路又被翻開，因此可以通過細胞內底物濃度的變化來靈敏地控制代謝速度。2、變構抑制劑〔負調節(jié)物〕常是代謝通路的終產物，變構酶常處于代謝通路的入口，通過反響抑制，可以及早地調節(jié)整個代謝通路，減少不必要的底物消耗。..例如葡萄糖的氧化分解可提供能量使AMP、ADP轉變成ATP，當ATP過多時，通過變構抑制劑ATP抑制磷酸果糖激酶的活性，可限制葡萄糖的分解，而ADP、AMP增多時，那么可通過變構激活劑AMP、ADP激活磷酸果糖激酶的活性促進糖的分解。隨時調節(jié)ATP/ADP的水平，可以維持細胞內能量的正常供給。...二、共價調節(jié)酶

1、概念：也稱共價修飾酶，通過其它酶對其多肽鏈某些基團進行可逆共價修飾，使處于活性與非活性的互變狀態(tài)，從而調節(jié)酶活性；共價修飾主要是磷酸化、腺苷?；?、甲基化等。如在蛋白激酶作用下發(fā)生