21固相析出分離技術(shù)

2.1出分別技術(shù)。依據(jù)析出物的形態(tài)不同分為結(jié)晶法〔結(jié)晶析出〕和沉淀法〔無定形固體析出〕第一節(jié)沉淀分別技術(shù)〔如蛋白質(zhì)分子外表疏水基團和親水基團比例的差異〕來轉(zhuǎn)變?nèi)芤旱哪承┬再|(zhì)〔如pH子等，使抽提液中有效成份的溶解度發(fā)生變化，從而到達從抽提液中分別有效成份的目的。一、鹽析沉淀法鹽析的原理定義：一般在低鹽濃度的狀況下，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的上升而增加，這種現(xiàn)象稱為鹽最終引起蛋白質(zhì)分子間相互聚攏并從溶液中析出。鹽能夠轉(zhuǎn)變蛋白質(zhì)的溶解度，蛋白質(zhì)的溶解度與溶液中離子強度有親熱關(guān)系。兩者的關(guān)系可用下式表示：lg〔S/So〕=-KsISI(g/L)；So0度；KsI在溫度肯定的條件下，某一蛋白質(zhì)在某一pH值的水溶液中的溶解度為一常數(shù)So。故上式可改寫為：lgS=lgSo–KsI=β–KsIβ=lgSo為一常數(shù)β值主要取決于蛋白質(zhì)的性質(zhì)，也與溶液的溫度和pHKs，Ks好。pHβKs蛋白質(zhì)的溶解度打算于離子強度Ｉ,Ｉ可用下式計算：Ｉ=1/2∑mZ2iim:溶液中離子的摩爾濃度Zi i鹽的選擇：蛋白質(zhì)的鹽析通常承受中性鹽，如硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉等，其中應(yīng)用子的力量也大，成為有效的鹽析工具。硫酸銨在水中的溶解度大而溫度的影響小 (25℃時溶解度為4.1mol/L，即767g/L;0℃時溶解度為3.7mol/L，即697g/L)，而且價廉易得，不易引起蛋白質(zhì)變性，分別效果比其他鹽好。Ks3通常硫酸銨的添加以百分飽和度來表示(不是濃度百分比)，例如大局部蛋白質(zhì)可在80%硫酸銨飽和度下沉淀。由于硫酸銨參加的體積很大，會轉(zhuǎn)變最終的總體積，很難由濃度百分比來計算，因此使用百分飽和度作為沉淀蛋白質(zhì)的度量。用硫酸銨進展鹽析時，蛋白質(zhì)溶液中硫酸銨濃度的調(diào)整方法主要有二種：〔1〕參加飽和溶液法要求：蛋白質(zhì)溶液體積不大，所需調(diào)整的硫酸銨濃度不高V=V(S-S/〔1-S〕V:所需加進的飽和硫酸銨溶液的體積；V；S0 2 1 2 0 2S150－60℃，0℃1－2100％飽和度。2)參加固體鹽法要求：飽和度高，不增大溶液體積t=G(S-S/〔1-AS〕S2，S1:分別代表所需到達的硫酸銨飽和度和原溶液的硫酸銨飽和度；t1LS12 1 2t〔留意：0℃，25℃25℃〕影響蛋白質(zhì)鹽析的因素：蛋白質(zhì)濃度〔共沉現(xiàn)象25－30g/L。離子強度和離子類型的影響a.離子強度增加，溶解度下降，鹽析易發(fā)生b.不同蛋白質(zhì)鹽析時所需離子強度不同，可承受分步鹽c.離子強度一樣時，高價離子，半徑小的離子鹽析力強大多數(shù)蛋白質(zhì)在等點電時，在鹽溶液中的溶解度最低。所以鹽析時溶液pH值調(diào)到等電點效果最好?！?〕a.在低離子強度或純水中，溫度上升，溶解度增加；b.在高鹽溶液中，溫度上升，溶解度降低。25℃0℃時溶解度低，更簡潔鹽析。實際使用：制備初期：pH，溫度肯定，轉(zhuǎn)變鹽濃度〔離子強度〔KspH度〔β分段鹽析〕lgS=lgSo–KsI=β–KsI鹽析時的留意事項1〕添加的硫酸銨的純度要高，添加后，要放30min〔2〕同一溶液中欲分別幾種蛋白質(zhì)時，可承受分段鹽析的方法。鹽析〔3〕選擇好溫度，一般在室溫下進展〔4〕25－30g/L；低濃度鹽析，可用離心分別；高濃度鹽析70－80％，用過濾〔由于粘度大，離心操作慢；鹽析沉淀得到的蛋白質(zhì)含量較高，純品需經(jīng)脫鹽處理，如透析，凝膠過濾等。二、有機溶劑沉淀法〔一〕〔1〕〔2〕度降低。使用的有機溶劑是乙醇和丙酮。優(yōu)點：比鹽析法析出的沉淀簡潔過濾或離心分別，區(qū)分力比鹽析法好，溶劑也簡潔除去。應(yīng)馬上用水或緩沖液溶解，以降低有機溶劑濃度，避開變性。本錢較高，有肯定的危急性。中性鹽可削減在有機溶劑中的溶解度，故中性鹽不宜添加太多。有機溶劑沉淀法一般與等電點沉淀法聯(lián)合使用。即操pH〔1〕〕〔3〕樣品穩(wěn)定構(gòu)造范圍內(nèi)，選擇溶解度最低處的pH〔4〕留意離子強度，離子種類的影響?！捕秤袡C溶劑的選擇和濃度的計算來進展有機溶劑沉淀。〔三〕有機溶劑沉淀的影響因素1溫度：多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在有機溶劑中對溫度特別敏感，溫度稍高就會引起變性，且有機溶劑與水混合時產(chǎn)生放熱反響，因此必需預(yù)冷，操作要在冰鹽浴中進展，參加有機溶劑時必需緩慢且不斷攪拌以免局部過濃。一般規(guī)律是溫度越低，得到的蛋白質(zhì)活性越高。2.樣品濃度：低濃度樣品回收率低，要使用比例更大的有機溶劑進展沉淀。高濃度樣品，可以節(jié)約pHpH離子強度：鹽濃度太大或太小都有不利影響，通常鹽濃度以不超過5％為宜，使用乙醇的量也以不超過原蛋白質(zhì)水溶液的２倍體積為宜，少量的中性鹽對蛋白質(zhì)變性有良好的保護作用，但鹽濃度過高會增加蛋白質(zhì)在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低濃度緩沖液中沉淀蛋白質(zhì)。5.其他金屬離子一些金屬離子如Ca2,Zn2+度而不影響其活性，有利于沉淀形成，并降低溶劑用量。留意：沉淀所得的固體樣品，假設(shè)不是馬上溶解進展下一步的分別，則應(yīng)盡可能抽干沉淀，削減其中有機溶劑的含量，如假設(shè)必要可以裝透析袋透析脫有機溶劑，以免影響樣品的生物活性。三、其他沉淀法等電沉淀法：利用蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低以及不同的蛋白質(zhì)具有不同等電點一這特性，對蛋白質(zhì)進展分別純化的方法稱為等電點沉淀法。在等電點時，蛋白質(zhì)分子的凈電荷為零，消退了分子間的靜電斥力，但由于水膜的存在，蛋白質(zhì)仍有肯定的溶解度而沉淀不完全，所以等電沉淀法常常與鹽析法或有機溶劑沉淀法聯(lián)合使用。單獨使用等電點法主pH止局部過酸或過堿?！捕撤请x子多聚物沉淀法：聚乙二醇PEG，葡聚糖，右旋糖苷硫酸鈉等非離子多聚物可以沉淀蛋白質(zhì)和細菌。機率。1〕〔2〕〔3〕用：沉淀分別細菌，病毒蛋白?！踩吵甥}沉淀法離子

、

、Pb2＋〔2〕〔3〕無機酸沉淀法：磷鎢酸、磷鉬酸等能與陽離子形式的蛋選擇性變性沉淀法：選擇肯定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法稱為選擇性變性沉淀法。⑴熱變性利用生物大分子對熱的穩(wěn)定性不同，加熱上升溫度使非目的生物大分子變性沉淀而保存目的物常在冰浴或冷室中進展。的分別純化步驟。應(yīng)用此法，應(yīng)對欲提純蛋白質(zhì)和雜蛋白的理化性質(zhì)有較全面的了解。其次節(jié) 結(jié)晶法結(jié)晶是制備純物質(zhì)的有效方法。在生物技術(shù)中，結(jié)晶主要應(yīng)用于抗生素、氨基酸、有機酸等小分子的生產(chǎn)中，以作為精制的一種手段。固體有結(jié)晶和無定形兩種狀態(tài)，兩者的區(qū)分在于它們的構(gòu)成單位的排列方式不同，前者有規(guī)章，后者無規(guī)章。由于只有同類分子或離子才能排列成晶體，故結(jié)晶過程有很好的選擇性，析出的晶體純度較高。結(jié)晶1化肥如硝酸銨、氯化鉀、尿素、磷酸胺等世界的年生產(chǎn)量亦已超過了100產(chǎn)中,雖然結(jié)晶態(tài)產(chǎn)品產(chǎn)量相對較低,但具有特別重要的地位以及高額的產(chǎn)值。在冶金工業(yè)、材料工業(yè)中,結(jié)晶亦是關(guān)鍵的單元操作。值得留意的動向是在高技術(shù)領(lǐng)域中,結(jié)晶操作的重要性與日俱增,例如生物化肥、味精、洗衣粉、速溶咖啡、青霉素、紅霉素等產(chǎn)品的生產(chǎn)一般都包含有結(jié)晶過程。經(jīng)過結(jié)晶后的產(chǎn)品,均有肯定的外形,便于枯燥、包裝、運輸、貯存等,從而可以更好地適應(yīng)商品市場的需要。相對于其他化工分別操作,結(jié)晶過程有以下特點：運輸、儲存或使用上都較便利。(2)、對于很多難分別的混合物系,例如同分異構(gòu)體混合物,共沸物,熱敏性物系等,使用其他分別方法難以奏效,而適用于結(jié)晶分別。(3)、結(jié)晶與精餾、吸取等分別方法相比,能耗低得多,因結(jié)晶熱一般僅為蒸發(fā)潛熱的1/3~1/10。又由于可(4)、結(jié)晶是一個很簡單的分別操作,它是多相、多組分的傳熱-傳質(zhì)過程,也涉及到外表反響過程,尚有晶體粒度及粒度分布問題,結(jié)晶過程和設(shè)備種類繁多。近20年來,結(jié)晶技術(shù)理論分析和工業(yè)技術(shù)與設(shè)備的開發(fā)取得刻的生疏。結(jié)晶技術(shù)。結(jié)晶過程的實質(zhì)外表化學(xué)反響過程。一、結(jié)晶的過程結(jié)晶包括三個過程：1.形成過飽和溶液；2.晶核形成；3.晶體生長。稱為結(jié)晶熱。相反的狀況，即溶解時放熱，結(jié)晶時吸熱，比較少見。因此結(jié)晶又是一個同時有質(zhì)量和熱量傳遞的過程。溶液結(jié)晶按過飽和形成的方式不同可將溶液結(jié)晶分為兩大類。①、不移除溶劑的結(jié)晶法不移除溶劑的結(jié)晶法亦稱為冷卻結(jié)晶法,根本上不除去溶劑,而是使溶液冷卻而成為過飽和溶液而結(jié)晶。適用于溶解度隨溫度下降而顯著減小的物系,如硝酸鉀、硝酸鈉、硫酸鎂等溶液。具有中等溶解度的物系如氯化鉀、硫酸鎂等溶液。此外,也可依據(jù)操作是否連續(xù),將結(jié)晶操作分為間歇式和連續(xù)式,或按有無攪拌裝置分為攪拌式和無攪拌式等。過飽和溶液的形成鹽析結(jié)晶。過飽和溶液的形成等溶劑結(jié)晶〕適用于溶解度隨溫度上升而增加的體系；同時，溶解度隨溫度變化的幅度要適中；自然冷卻、間壁冷卻〔冷卻劑與溶液隔開、直接接觸冷卻〔在溶液中通入冷卻劑〕局部溶劑蒸發(fā)法〔等溫結(jié)晶法〕適用于溶解度隨溫度降低變化不大的體系，或隨溫度上升溶解度降低的體系；加壓、減壓或常壓蒸餾真空蒸發(fā)冷卻法使溶劑在真空下快速蒸發(fā)，并結(jié)合絕熱冷卻，是結(jié)合冷卻和局部溶劑蒸發(fā)兩種方法的一種結(jié)晶方法。設(shè)備簡潔、操作穩(wěn)定化學(xué)反響結(jié)晶參加反響劑產(chǎn)生物質(zhì)，當(dāng)該物質(zhì)的溶解度超過飽和溶解度時，即有晶體析出；其方法的實質(zhì)是利用化鹽析結(jié)晶參加一種物質(zhì)于溶液中，使溶質(zhì)的溶解度降低，形成過飽和溶液而結(jié)晶的方法。常用的沉淀劑：固體氯化鈉、甲醇、乙醇、丙酮a.承受第四種方法結(jié)晶多粘菌絲EE近中性，加等量丙酮，其硫酸鹽就結(jié)晶析出。b.并用第一、第四種方法結(jié)晶C.并用其次、第一種方法結(jié)晶1052h，即可得結(jié)晶。d.并用第一、第三種方法結(jié)晶pH4.810℃，2h2核的形成初級成核二次成核31〕初級均相成核：指溶液在較高過飽和度下自發(fā)生成晶核的過程。2〕初級非均相成核：指溶液在外來物晶體與攪拌器或器壁碰撞時所產(chǎn)生的微小晶體的誘導(dǎo)下發(fā)生的〔生產(chǎn)較多承受晶過程的完畢，還要靠集中而連續(xù)成長為晶體。溶質(zhì)質(zhì)點〔分子、原子、離子〕在晶核上連續(xù)一層層排列上去而形成晶粒，并且使晶粒不斷增大，此即晶體的成長。在過飽和溶液中，當(dāng)能量在某一瞬間、某一區(qū)域臨時到達較高值時簡潔形成晶核；成核的速度隨溫度上升而上升，但到達最大值后，溫度再上升，速度下降；結(jié)晶水越多，越不簡潔成核。對于有機物質(zhì)，構(gòu)造越簡單，分子量越大，成核速度越慢；機械振動、攪拌能促使成核，電磁場、超聲波、紫外光等都能促進成核；參加晶體能誘導(dǎo)結(jié)晶。晶體的生長晶體生長的集中學(xué)說溶質(zhì)通過集中作用穿過靠近晶體外表的一個滯流層，從溶液中轉(zhuǎn)移到晶體的外表；到達晶體外表的溶質(zhì)長入晶面，使晶體增大，同時放出結(jié)晶熱；結(jié)晶熱傳遞回到溶液中；晶體。當(dāng)晶核生成速度大大超過晶體生長速度時，則得到細小而又不規(guī)章的晶體。結(jié)晶操作中的問題。1．過飽和度增大溶液過飽和度可提高成核速率和生長速率，有利于提高結(jié)晶生產(chǎn)力量。過飽和度過大會消滅問題：1〕成核速率過快，產(chǎn)生大量微小晶體，結(jié)晶難以長大；2〕結(jié)晶生長長速率的同時，不影響結(jié)晶的質(zhì)量。在不易產(chǎn)生晶垢的過飽和度下進展。，假設(shè)降溫速度過快，溶液很快到達較高的過飽和度，生成大量微小晶體，影響結(jié)晶產(chǎn)品的質(zhì)量。溫度最好掌握在飽和溫度與過飽和溫度之間。不設(shè)外部循環(huán)加熱裝置，蒸發(fā)室內(nèi)溫度較低，可防止過飽和度的猛烈變化。產(chǎn)品質(zhì)量。為獲得較好的混合狀態(tài)，同時避開結(jié)晶的裂開，可承受氣提式混合方式，或利用直徑或葉片較大的攪拌槳，降低槳的轉(zhuǎn)速。pHpHpH晶種晶核的形成有兩種狀況,即初級成核和二次成核。初級成核的速率要比二級成核速率大得多,而且對過飽和度的變化格外敏感,故其成核速率很難掌握。因此,除了超細粒子制造外,一般結(jié)晶過程都要盡量避開發(fā)生初級成核,而應(yīng)在有人為參加晶種的狀況下進展。晶種的作用主要是掌握品核的數(shù)量,以得到粒度把握好時機,假設(shè)溶液溫度較高,參加的晶種有可能局部或全部被溶化而不能起到誘導(dǎo)成核的作用;假設(shè)溫以使其均勻地分布在溶液之中,得到高質(zhì)量的結(jié)晶產(chǎn)品。產(chǎn)速度(產(chǎn)量)。但晶漿濃度過高時，懸浮液的流淌性差，混合操作困難。晶漿濃度應(yīng)在操作條件允許的范圍內(nèi)取最大值。在間歇操作中，晶種的添加量應(yīng)依據(jù)最終結(jié)晶產(chǎn)品的大小，滿足晶漿濃度最大的高效生產(chǎn)要求。共存雜質(zhì)的影響明顯影響。但假設(shè)在結(jié)晶操作中雜質(zhì)含量不斷上升(如承受蒸發(fā)式結(jié)晶操作時)，雜質(zhì)的積存會嚴峻影響目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)晶的純度。結(jié)晶操作中需要掌握雜質(zhì)的含量，往往在結(jié)晶系統(tǒng)中增設(shè)除雜設(shè)備。離子交換柱或廢液排放。重結(jié)晶經(jīng)過一次粗結(jié)晶后，得到的晶體通常會含有肯定量的雜質(zhì)。此時工業(yè)上常常需要承受重結(jié)晶的方式進展晶，以獲得高純度的晶體的操作。重結(jié)晶