酵母生物學(xué)研究的幾個問題

酵母生物學(xué)研究的幾個問題

1工業(yè)酵母的分類母細(xì)胞象是一種低水平的真核生物。它不僅具有類似原核生物的生長特性（易于栽培、快速繁殖、易于遺傳移動等），而且具有典型的真核生物特性。酵母作為人類利用最早的微生物,和人類的生活極其密切,是釀造、食品、飼料等領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的工業(yè)微生物。酵母生物學(xué)研究的最顯著特點是基礎(chǔ)理論研究與應(yīng)用實踐研究的內(nèi)在統(tǒng)一,酵母不僅是研究真核細(xì)胞各種生命過程的有用模型和重要工具,而且也是外源真核生物基因表達(dá)的適宜宿主生物,對現(xiàn)有工業(yè)酵母菌種遺傳改良和重組基因工程酵母生產(chǎn)外源蛋白顯示出廣闊的前景。酵母并非為一個嚴(yán)格的分類學(xué)概念,它是一類單細(xì)胞世代較長的低等真核生物的統(tǒng)稱。至少包括80個屬,600個種,10000多個獨立菌株。常將其分成3大類:(1)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),又稱面包酵母,有真核生物中“大腸桿菌”的美名,主要以發(fā)酵糖類產(chǎn)生乙醇和CO2為主要特征。一般人們討論的酵母就是這一類酵母,它們是工業(yè)酵母應(yīng)用中最重要的一類。(本文以下不特殊說明的酵母就指釀酒酵母)(2)粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe),人們對其研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及釀酒酵母,其在分子及細(xì)胞生物學(xué)方面更加接近高等真核生物,以無性裂殖為特征,其單倍細(xì)胞僅有3條染色體。(3)非常規(guī)酵母(Nonconventionalyeast),除釀酒酵母和粟酒裂殖酵母外的酵母統(tǒng)稱,近年這一類生物資源引起了人們的強烈興趣,它的一些菌種為條件性致病菌,如Candidaalbicans(白假絲酵母,即“白色念球菌”),引起人們興趣的主要原因是非常規(guī)酵母在生物工程方面的應(yīng)用前景很廣闊,對Pichiapastoris(巴氏畢赤酵母,即甲醇酵母)、Kluveromyces(克魯維酵母)、Candida(假絲酵母)、Rarrowia和Hansenula等屬酵母的一些菌株已建成了基因表達(dá)系統(tǒng),其中尤以Pichiapastoris和KluveromycesLactis較為重要。2遺傳多樣性研究釀酒酵母的工業(yè)應(yīng)用比較廣泛,歷史悠久,遺傳背景清楚,不產(chǎn)生有毒物質(zhì),生物安全性好,易于推廣應(yīng)用,現(xiàn)已成為分子生物學(xué)研究最重要的工具和模型。2.1雙鏈環(huán)形dna的制備酵母細(xì)胞核內(nèi)有16條染色體,基因組為12052kb,核外線粒體mtDNA為長約25μm(約75kb)的雙鏈環(huán)狀分子,常見內(nèi)源質(zhì)粒為2μ雙鏈環(huán)狀DNA(6kb,周長約2μm),每個單倍體基因組含質(zhì)粒60～100個拷貝。酵母基因組與高等真核生物基因組相比,最突出的特點是其緊密性(compactness),共有6138個ORFs,編碼蛋白質(zhì)的基因預(yù)計共有5800個,約有6%～7%為不編碼蛋白質(zhì)的基因。2.2菌株結(jié)構(gòu)及染色體結(jié)構(gòu)酵母細(xì)胞染色體在有絲分裂或減數(shù)分裂期間能高度有序地傳遞給子細(xì)胞,已知有3種結(jié)構(gòu)成分對染色體有效、穩(wěn)定遺傳是必需的:(1)ARS(autonomouslyreplicatingsequence自主復(fù)制序列),染色體自主復(fù)制序列,是從酵母中克隆的真核細(xì)胞DNA復(fù)制起點序列。酵母每條染色體由多個復(fù)制子組成,復(fù)制子平均長度為36kb,整個基因組約由400多個復(fù)制子組成。(2)CEN(centromeresequence著絲粒序列),著絲粒是真核細(xì)胞染色體在細(xì)胞分裂中精確分離的必需結(jié)構(gòu),每個染色體都具有一個著絲粒,現(xiàn)已分離了多個CEN序列,其大小為900～600bp,CEN不具有染色體專一性,卻具有種屬專一性。(3)TEL(telomericsequences端粒順序),線性染色體DNA保持復(fù)制穩(wěn)定性所必須的端粒順序,為富含TG的長約3000～4000bp的序列,酵母和四膜蟲的TEL基本相似,可以通用。YAC(yeastartificialchromosome酵母人工染色體)將上述酵母染色體3種基本功能性成分及選擇標(biāo)記基因有效組合構(gòu)建了酵母人工染色體(Murray,Szostak1983),YAC實際應(yīng)用中都以穿梭載體的形式構(gòu)建,含有pBR322中的Ampr和Ori,酵母中常用的選擇基因為TRP1,URA3和SUP4,YAC中的TEL序列也可來自四膜蟲。YAC承載的外源基因片段為200～1000bp。2.3母類基因調(diào)控區(qū)的基本原理酵母基因組雖小,但其表達(dá)調(diào)控過程與其它真核生物相似,酵母作為真核基因表達(dá)載體,用于大量生產(chǎn)外源蛋白質(zhì),是真核生物基因表達(dá)研究的理想工具。(1)酵母的轉(zhuǎn)錄由3種RNA多聚酶催化,編碼RNA聚合酶的基因與其它真核生物3種RNA聚合酶基因同源性很高。對酵母反式作用因子(轉(zhuǎn)錄因子)GAL4、ADR1、PPRI等研究,發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)酵母轉(zhuǎn)錄因子的特征激活結(jié)構(gòu)域能促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄,然而若干哺乳動物轉(zhuǎn)錄因子的激活結(jié)構(gòu)域并不促進(jìn)酵母基因的轉(zhuǎn)錄。(2)酵母Ⅱ類基因調(diào)控區(qū)的基本結(jié)構(gòu)特點:結(jié)構(gòu)基因上游大約100bp處含一個或多個TATA盒作為核心啟動子,在位于Cap位點上游幾百bp處是上游激活序列(UAS),UAS結(jié)構(gòu)和功能方面類似于哺乳動物中的增強子,轉(zhuǎn)錄總是在TATAbox下游80～120bp的特定位置開始。結(jié)構(gòu)基因3′末端有效的終止子終止轉(zhuǎn)錄。(3)酵母mRNA具有典型的真核結(jié)構(gòu):5′-帽子,3′-polyA,成熟的mRNA以初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)拼接后成熟產(chǎn)生,酵母只有很少的基因具有內(nèi)含子,且無操縱子結(jié)構(gòu)。酵母基因的翻譯效率受基因編碼序列上游DNA序列的影響,一般要求起始密碼子ATG前保留一段短的、不變的前導(dǎo)序列,它對轉(zhuǎn)錄的起始并非必需,但對mRNA的高效翻譯卻相當(dāng)重要。(4)酵母作為真核生物的另一特征是能對翻譯產(chǎn)生的前體蛋白質(zhì)進(jìn)行加工以產(chǎn)生功能性產(chǎn)物,而且加工往往與分泌作用相偶聯(lián):a.酵母表達(dá)載體構(gòu)建中常用的分泌信號為酵母的MFα1前α一因子前導(dǎo)序列(prepro-2-factor或ppαfl),分泌表達(dá)多肽的分子量范圍為24～842個氨基酸,一般不大于30KD,其它分泌信號有:蔗糖酶信號肽、PH05堿性堿酸酶信號序列、黑曲霉糖化酶信號序列,酵母不但能利用自身的分泌信號(較多),也能利用異源的分泌信號;b.酵母有與真核生物相似的表達(dá)蛋白加工轉(zhuǎn)運途徑,在分泌表達(dá)時,能正確形成二硫鍵和糖基化加工,外源蛋白在酵母中能發(fā)生N—C和O—C連接的兩種不同糖基化,每條糖側(cè)鏈平均50～150甘露糖殘基,即存在過度糖基化傾向,且有時在核心多糖末端存在α-1.3糖鏈,從而使得有的糖蛋白呈較高的抗原特性。2.4酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的研究,為基因研究提供了基礎(chǔ)1978年Hinnen等及Btggs完成了外源DNA引入酵母原生質(zhì)體的實驗,酵母2μ質(zhì)粒及其它載體也相繼完善,酵母轉(zhuǎn)化技術(shù)有了突破,酵母的分子克隆技術(shù)及分子遺傳學(xué)也迅速深入發(fā)展。為了克服大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的缺點,發(fā)展了酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),它除了對其基礎(chǔ)研究起了很大作用外,也為基因工程藥物和疫苗的產(chǎn)業(yè)化做出了巨大的貢獻(xiàn)。現(xiàn)有許多關(guān)于細(xì)菌、真菌和高等動植物基因在酵母中成功克隆和表達(dá)的報道,其中有許多重要蛋白已經(jīng)應(yīng)用酵母工程菌進(jìn)行生產(chǎn)。2.4.1對編碼蛋白表達(dá)的調(diào)控酵母細(xì)胞中基因克隆和表達(dá)的載體一般有5種類型(見表1)。其中以2μ環(huán)為基礎(chǔ)構(gòu)建的YEP最常用。表達(dá)載體與克隆載體不同的是除復(fù)制子和選擇基因外,還需包含表達(dá)必須的DNA區(qū)段:(1)一個或多個供插入外源蛋白質(zhì)編碼序列的限制性酶切位點;(2)核心是其上有一個可調(diào)控轉(zhuǎn)錄表達(dá)的酵母啟動子;(3)啟動子下游是先導(dǎo)序列(和翻譯效率有關(guān)),ATG(起始密碼);(4)往往還含有編碼有用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的序列:信號肽序列,核定位序列,某種抗原表位或其它標(biāo)簽蛋白序列。常用的酵母高效表達(dá)載體多是YEP類型的質(zhì)粒,其中包含的酵母強啟動子有PGALI.(半乳糖激酶啟動子)、PPHO(堿性磷酸酶啟動子)、PAPLI(乙醇脫氫酶啟動子)、PPGK(3-磷酸甘油酸激酶啟動子)。啟動子上游往往包含了其上游激活位點(UAS序列)?？烧T導(dǎo)啟動子用于質(zhì)粒編碼蛋白的條件控制性表達(dá),特別是當(dāng)某基因產(chǎn)物對宿主酵母有毒性時,最好作誘導(dǎo)表達(dá),如PGALI,在培養(yǎng)基含有葡萄糖時,PGALI轉(zhuǎn)錄活性低(每細(xì)胞少于1個轉(zhuǎn)錄物),而在以半乳糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上時,PGALI可大量轉(zhuǎn)錄。對于PPHO5,當(dāng)培養(yǎng)基富含無機磷時,PPHO5活性很低,當(dāng)培養(yǎng)基缺乏無機磷時,則可誘導(dǎo)PPHO5的轉(zhuǎn)錄活性。組成型啟動子中PADH1最常用,也可用PPDK。隨細(xì)胞所處的代謝狀態(tài)(生長培養(yǎng)基)的改變,組成型啟動子的活性也可改變,但這種活性的改變沒有誘導(dǎo)的啟動子那么劇烈。2.4.2篩選后轉(zhuǎn)化體的制備構(gòu)建好的載體質(zhì)粒都要通過轉(zhuǎn)化將外源DNA導(dǎo)入宿主酵母細(xì)胞中,再通過篩選操作分離得到轉(zhuǎn)化體。酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的選擇標(biāo)記基因(M+)與相對應(yīng)的突變基因(M-)的菌株配套使用,不同選擇標(biāo)記有不同的篩選方法(多為營養(yǎng)缺陷互補),轉(zhuǎn)化方法可分以下兩種。(1)常用快速法a最常用的轉(zhuǎn)化方法是乙酸鋰轉(zhuǎn)化法,操作快捷,轉(zhuǎn)化效率高(可達(dá)105～106轉(zhuǎn)化體/μgDNA),分為一般法和快速法兩種?？焖俜ㄊr實用,轉(zhuǎn)化頻率卻較低。在乙酸鋰轉(zhuǎn)化法中,Li+的最適濃度為100mmol/L,受體酵母濃度為5×107細(xì)胞/mL,pH為7.0,為維持高轉(zhuǎn)化頻率,體系中需加聚乙二醇(PEG4000或PEG3350),乙酸鋰可用硫氰化鋰代替。(2)酵母細(xì)胞的分離和制備首先將酵母用酶法去壁成原生質(zhì)體后再進(jìn)行外源DNA導(dǎo)入,篩選出的轉(zhuǎn)化子再使細(xì)胞壁再生,操作過程需將原生質(zhì)體保持在一定合適滲透壓的培養(yǎng)基中。操作步驟多而費時,原生質(zhì)體非常脆弱,不能直接篩選(藥物),且原生質(zhì)體可能融合產(chǎn)生多倍體細(xì)胞,對依其表型篩選造成困難,而直接法就不存在這些問題。酵母細(xì)胞亦可通過電脈沖穿孔法轉(zhuǎn)化。在酵母轉(zhuǎn)化過程中,特別是使用乙酸鋰方案時,轉(zhuǎn)化時添加變性的單鏈相對高分子量單體DNA對提高轉(zhuǎn)化效率十分重要,一般是將從鮭魚睪丸制取的雙鏈DNAШ鈉鹽用TE溶液溶解并經(jīng)超聲波處理成2～15kb(最好為平均7kb)的片段,在轉(zhuǎn)化時同質(zhì)粒DNA同時加入轉(zhuǎn)化體系。3外源基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫設(shè)計不合理,實氧條件下發(fā)酵生物酶系統(tǒng)發(fā)育釀酒酵母作為一種基因工程表達(dá)系統(tǒng)存在一定的局限性:(1)釀酒酵母是一種以發(fā)酵為主的酵母,多不適于高密度培養(yǎng),而大多數(shù)外源基因表達(dá)需要的是以好氧條件下的營養(yǎng)生長蛋白質(zhì)合成為條件,用釀酒酵母系統(tǒng)表達(dá)外源基因很難達(dá)到很高的水平;(2)釀酒酵母缺乏強有力的受嚴(yán)格調(diào)控的啟動子;(3)釀酒酵母對外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分泌不夠理想;(4)表達(dá)菌株不夠穩(wěn)定,表達(dá)質(zhì)粒易丟失,此外在翻譯后加工方面也與高等真生物有所不同。3.1甲醇酵母糖苷鏈反應(yīng)型甲醇酵母(Pichiapastoris)的生物學(xué)特點:甲醇代謝的第一步是甲醇在乙醇氧化酶(AOX)作用下被氧化成甲醛。調(diào)控AOX的啟動子是強啟動子,用來調(diào)控外導(dǎo)源蛋白質(zhì)的表達(dá),在以葡萄糖或甘油為碳源的培養(yǎng)基上生長時抑制轉(zhuǎn)錄,而在以甲醇為唯一生長碳源時,誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄,常用的受體菌為GS115,KM71和SMD1168,都為組氨酸缺陷型。甲醇酵母作為真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點:(1)具有強有力的乙醇氧化酶基因(AOXI)啟動子,可嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá);(2)可對表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的加工和修飾,糖基化程度低,糖鏈長度平均每條側(cè)鏈為8～14個甘露糖殘基,較之釀酒酵母50～150甘露糖殘基短得多,核心多糖末端不存在a-1.3糖苷鏈;(3)營養(yǎng)要求低,生長快,培養(yǎng)基廉價,便于工業(yè)化生產(chǎn);(4)可高密度發(fā)酵培養(yǎng),表達(dá)量高,在發(fā)酵罐中細(xì)胞干重甚至可達(dá)120g/L以上,許多蛋白可達(dá)到每升克以上水平;(6)表達(dá)的蛋白既可存在于胞內(nèi),又可分泌至胞外,Pichia自身分泌的蛋白非常少,十分有利于純化。3.2pasdur表達(dá)質(zhì)粒的篩選P.pasteur質(zhì)粒主要應(yīng)用YIP整合性載體,轉(zhuǎn)化最常用的仍為乙酸鋰法。其轉(zhuǎn)化體篩選以His,Ura3營養(yǎng)缺陷型篩選為主,特征載體(PPTC3K,PPTC9K)可用抗G418篩選。典型的pasteur表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)仍為穿梭性載體,載體的一般結(jié)構(gòu)為:(1)5′AOX1,含AOX1啟動子及調(diào)控序列,同時也是載體和宿主發(fā)生重組的位點;(2)MCS;(3)Sig信號肽;(4)TT轉(zhuǎn)錄終止和polyA序列;(5)3′AOX1,TT下游區(qū)及同源重組位點;(6)篩選標(biāo)記及E.coli中的克隆基因。為了提高外源基因整合到基因組中的拷貝數(shù),常在表達(dá)質(zhì)粒中串聯(lián)幾個“啟動子+外源基因+轉(zhuǎn)錄終止區(qū)”這樣的表達(dá)單位,一次整合,即可有多個表達(dá)單位插入基因組。4關(guān)于研究和應(yīng)用的期待4.1酵母生物基因篩選工具(1)在生物信息領(lǐng)域,通過對酵母基因組數(shù)據(jù)庫的檢索、類比分析,在人類基因組研究中已顯示出巨大潛力。在酵母中進(jìn)行功能互補實驗是一種研究人類基因功能的捷徑,為高等真核生物提供了一個可以檢測的實驗系統(tǒng),酵母成為其它生物新基因的篩選工具。期望構(gòu)建的酵母最小基因組將會更加方便和有用。(2)以酵母為主的不斷完善發(fā)展的分子生物技術(shù)已成為真核分子生物學(xué)研究的重要工具。主要包括:酵母單雜交系統(tǒng)(one-hybridSystem),雙雜交系統(tǒng)(two-hybridsystem),逆向雙雜交系統(tǒng)(reversetwo-hybridsystem),三雜交系統(tǒng)(three-hybridsystem),作為研究蛋白質(zhì)(轉(zhuǎn)錄因子)與DNA,蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì),兩個蛋白質(zhì)與另外的蛋白、RNA和小分子藥物等相互作用重要的生物體內(nèi)試驗方法以及篩選順式作用元件等的重要工具。酵母的單倍體-雙倍體可控制生長和產(chǎn)子囊孢子生長特性,為遺傳研究帶來許多方便。4.2酵母基因在食品和發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用各種酵母在生產(chǎn)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用歷史與前景。酵母作為各種特殊蛋白的表達(dá)系統(tǒng),在生產(chǎn)特殊活性肽(疫苗、藥物等)方面已取得成功應(yīng)用,并且隨著研究的深入還會得到更廣泛的應(yīng)用,這里僅對酵母基因工程在食品和發(fā)酵工業(yè)幾個方面的應(yīng)用作以簡述。4.2.1和sta3國內(nèi)外最早的研究都集中在對釀酒酵母利用淀粉、寡聚糖和糊精的分泌酶進(jìn)行基因工程改良上,最早被克隆并引入的是Saccharomylesdiastaticus(糖化酵母,但不耐酒精)的STA1,STA2和STA3,基因引進(jìn)后以PGK為啟動子,ARS1為復(fù)制子,但2μm質(zhì)粒存在穩(wěn)定性不好的問題。Yocum(1986)將黑曲霉的葡糖淀粉酶(GA)基因通過YIP整合在酵母染色體上,遺傳穩(wěn)定性及酶活能滿足生產(chǎn)要求,存在問題是真菌糖化酶耐熱,不能為巴氏滅菌滅活。Schiwaniomycesoccidentacis的GAM1基因整合劑ADH1(乙醇脫氧酶)在基因啟動子下,可達(dá)正常工藝要求,生產(chǎn)出低糖(干)啤酒。分泌β-葡聚糖酶可降低啤酒汁粘度,改善過濾性能,該酶基因來自木霉(Trichodermareesci)的EGL1或大麥,分泌融合表達(dá),整合入PPGK1下可改善過濾,不影響持泡特性。4.2.2-羥基丁酮和氨酸丁酮的合成雙乙酰作為啤酒成熟的主要標(biāo)志,它來自丙酮酸經(jīng)α-乙酰乳酸合成纈氨酸途徑的副產(chǎn)物,α-乙酰乳酸為雙乙酰的主要前體。通過引入α-乙酰乳酸脫酶(ALDC)基因(來自醋酸桿菌或乳酸菌)整合到酵母的URA3或rDNA上,ALDC則氧化α-乙酰乳酸為3-羥基丁酮,從而達(dá)到降低雙乙酰的目的,縮短后熟時間和對纈氨酸生物合成途徑的基因(ILV)克隆和遺傳操作使ILV2缺失,且插入ILV3,使酵母雙乙酰產(chǎn)量明顯降低。啤酒酵母工藝性狀是一個復(fù)雜的多基因群體作用,對其聯(lián)合綜合改良,是否會超出酵母的生理承受極限,攪亂其自身的遺傳特性,這將是“途徑工程”面臨的新挑戰(zhàn)。4.2.3改良酵母蛋白質(zhì)酵母細(xì)胞營養(yǎng)豐富,一直作為人類及其它動物重要的營養(yǎng)強化劑。按其應(yīng)用主要分為食用營養(yǎng)酵母(foodyeast)和飼用酵母(feedyeast),具有很大的市場發(fā)展空間。酵母作為最重要的單細(xì)胞蛋白(SCP)微生物,應(yīng)用基因工程,改良酵母蛋白質(zhì)也作了不少工作。Hinch