基于aflp標(biāo)記的新疆核桃種質(zhì)材料遺傳多樣性分析

基于aflp標(biāo)記的新疆核桃種質(zhì)材料遺傳多樣性分析

新疆堅(jiān)果的種子資源豐富。新疆分布著天然的堅(jiān)果林。新疆南部有早熟堅(jiān)果和薄皮堅(jiān)果，全國各地都分布著許多古老的堅(jiān)果樹種，樹齡數(shù)百年。核桃種質(zhì)資源遺傳多樣性研究是核桃種質(zhì)資源學(xué)研究的重要內(nèi)容和核桃新品種選育的理論基礎(chǔ)。由于近年來核桃產(chǎn)業(yè)在全疆乃至全國的不斷發(fā)展,核桃良種和無性系生產(chǎn)逐步深入和擴(kuò)大,資源遭受嚴(yán)重破壞,一些適應(yīng)性強(qiáng)的地方品種和野生種逐漸被淘汰,物種有向單一化發(fā)展的趨勢。利用遺傳標(biāo)記對(duì)核桃資源進(jìn)行遺傳多樣性分析,可為資源的保護(hù)和利用提供可靠有效的理論依據(jù),還可以搞清楚核桃種質(zhì)資源內(nèi)的物種關(guān)系,為核桃遺傳育種及遺傳規(guī)律的研究奠定基礎(chǔ)。AFLP技術(shù)具有可靠、高效、快速、靈敏、穩(wěn)定、所需DNA量少、多態(tài)性檢出率高和重復(fù)性好等特點(diǎn),該方法近年來發(fā)展很快,國外和國內(nèi)已用該技術(shù)對(duì)核桃進(jìn)行了一些研究,而針對(duì)新疆核桃資源的研究相對(duì)很少。國內(nèi)目前已做了關(guān)于核桃的DNA提取、AFLP擴(kuò)增體系的建立、引物篩選和遺傳多樣性、親緣關(guān)系、性狀分子分析等方面的研究,國外已經(jīng)對(duì)稀有核桃種質(zhì)的遺傳多樣性及遺傳連鎖圖的構(gòu)建方面做了相關(guān)工作。本研究是在借鑒前人研究經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上,用AFLP技術(shù)對(duì)新疆的核桃種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析,以期為今后新疆核桃種質(zhì)資源的保護(hù)、新品種選育和改良、遺傳規(guī)律研究等方面奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1阿斯塔里木大學(xué)中小企業(yè)供試材料共122份(表1),包含11個(gè)普通核桃栽培品種以及81份野生、實(shí)生核桃類型,其中有百年核桃4份。分別于2006年9月、2007年6月、2007年8月采自新疆阿克蘇地區(qū)溫宿核桃林場及庫車縣、庫爾勒若羌縣、喀什葉城縣、和田地區(qū)、伊犁鞏留野生核桃林自然保護(hù)區(qū)及阿拉爾市塔里木大學(xué)試驗(yàn)站。采核桃葉片,低溫下帶回實(shí)驗(yàn)室,液氮速凍,放入超低溫冰箱中保存待用。1.2研磨、提取、清洗參考已報(bào)道的方法并進(jìn)行改進(jìn)。采用β-巰基乙醇和PVP聯(lián)合除酚、多次洗滌和高鹽相結(jié)合進(jìn)行除糖。在研磨組織時(shí)加入PVP粉劑,防止組織在破碎過程中被多酚氧化。在提取液Ⅰ、Ⅱ中加β-巰基乙醇和PVP,防止提取和裂解過程中的多酚氧化。在基因組DNA釋放之前用提取液Ⅰ進(jìn)行多次洗滌,以除去多糖。同時(shí)在提取過程中加入5mol/LNaCl,沉淀以70%乙醇浸泡2~3h,協(xié)助除糖。1.3aflp分析1.3.1酶切和連接1.3.1.酶切溫度ld酶切體系20μl:純化DNA450ng,10倍反應(yīng)緩沖液2μl,10mg/mlBSA0.2μl,EcoRI和MseI各3U,加ddH2O至20μl混勻后,37℃恒溫酶切5h。1.3.1.酶切連接酶試驗(yàn)連接體系5μl:50μmol/LMseI接頭和50μmol/LEcoRI接頭各1μl,10mg/mlATP1.8μl,T4緩沖液0.5μl,T4連接酶1.5U,加ddH2O至5μl混勻后,加入酶切過的DNA樣品中,37℃恒溫10h以上或過夜。連接完成后,65℃變性10min。1.3.2選擇性pcr65預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系20μl:含5.0μl連接后經(jīng)5倍稀釋產(chǎn)物作為預(yù)擴(kuò)增的模板,含Mg2+的10×PCRbuffer2.0μl,2.5mmol/LdNTPs1.6μl,Taq酶0.5U,預(yù)擴(kuò)增引物各30ng,加ddH2O至20μl混勻后,礦物油封口,95℃預(yù)變性2min;95℃30s,56℃30s,72℃1min,30個(gè)循環(huán)。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳檢測,呈均勻的彌散熒光。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物再稀釋5倍,取5.0μl作為選擇性擴(kuò)增的模板,選擇性PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系是20μl體系,其中預(yù)擴(kuò)增稀釋樣品5.0μl,含Mg2+的10×PCRbuffer2.0μl,2.5mmol/LdNTPs1.8μl,EcoRⅠ引物和MseⅠ引物各0.8μl,Taq酶0.75U,加ddH2O至20μl。95℃預(yù)變性2min;第一個(gè)循環(huán)95℃50s,65℃40s,72℃1min,以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7℃,擴(kuò)增13個(gè)循環(huán);然后95℃50s,56℃40s,72℃1min,擴(kuò)增31個(gè)循環(huán);72℃10min,4℃保存。1.3.3冰浴溫度的確定選擇性擴(kuò)增完成后,在其產(chǎn)物中加入10μlloadingbuffer[98%甲酰胺,0.5mol/LEDTA(pH值8.0),二甲苯氰,溴酚藍(lán)],混合后95℃變性10min,立即冰浴15min,置于-20℃下備用。制備6%變性膠(19∶1的聚丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺,7.0mol/L尿素,1×TBE緩沖液),恒功率60W,預(yù)電泳30min,上樣7μl,恒功率40W,電泳至溴酚藍(lán)接近膠底后停止電泳。用銀染法染色,ddH2O漂洗3~4s,0.1%硝酸銀+0.15%甲醛染色15min后ddH2O輕微漂洗3~4s。用0.28mol碳酸鈉+0.15%甲醛+400μl硫代硫酸鈉(10mg/ml)顯影,70r/min慢搖。當(dāng)帶紋與背景對(duì)比度最清楚時(shí),用10%冰醋酸終止顯色,用ddH2O漂洗2min,觀察結(jié)果。1.4數(shù)據(jù)聚類分析對(duì)AFLP圖譜按條帶有無進(jìn)行賦值,有帶賦值為“1”,無帶賦值為“0”,選擇分辨清晰的強(qiáng)帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì),統(tǒng)計(jì)每對(duì)引物擴(kuò)增出的總條帶和多態(tài)性條帶,利用DPS軟件按Nei(1972)的方法計(jì)算遺傳相似系數(shù)和遺傳距離,用UPGMA方法聚類。2結(jié)果與分析2.1引用的過濾和avl分析的多態(tài)性2.1.1aflp分析引物篩選用預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系,從報(bào)道過97、、清晰的選擇性擴(kuò)增引物組合,分別是:E+AAG/M+CAC,E+ACC/M+CAC,E+AAG/M+CAG,E+AAG/M+CAT,E+AGG/M+CAT,E+AAC/M+CTA,E+ACG/M+CTG(表2)。2.1.2AFLP分析多態(tài)性利用AFLP技術(shù)對(duì)122份核桃種質(zhì)的基因組DNA進(jìn)行分析。為了能夠覆蓋基因組盡可能多的遺傳位點(diǎn),研究選用六堿基內(nèi)切酶EcoRⅠ和四堿基內(nèi)切酶MseⅠ對(duì)基因組DNA進(jìn)行雙酶切,然后與接頭連接。用7對(duì)E+3/M+3引物組合(表2)進(jìn)行選擇性擴(kuò)增,對(duì)條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。這7對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定,擴(kuò)增圖譜清晰。圖1是引物組合E+AAC/M+CTA對(duì)1~62號(hào)種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增的圖譜,在不同種質(zhì)之間呈現(xiàn)明顯的多態(tài)性,能較好地區(qū)分不同種質(zhì),尤其是23號(hào)種質(zhì)(溫179)在不同引物對(duì)的擴(kuò)增圖譜中都呈現(xiàn)最多條帶,且能與其他種質(zhì)明顯區(qū)分開。在所有引物組合擴(kuò)增出的21989條清晰的條帶中,有多態(tài)性條帶8810條,占40.1%,表明這些核桃種質(zhì)間存在較豐富的遺傳多樣性。2.2個(gè)核桃種質(zhì)間的距離關(guān)系所有核桃種質(zhì)的遺傳距離數(shù)值范圍為0.12000~0.93103。物種間遺傳距離最大的是63號(hào)種質(zhì)(和22)和1號(hào)種質(zhì)(庫車693),距離為0.83930;其次是23號(hào)種質(zhì)(溫179)和1號(hào)種質(zhì),距離為0.70525;遺傳距離最小的是8號(hào)種質(zhì)(伊0117)和5號(hào)種質(zhì)(伊0269)、33號(hào)種質(zhì)(葉23)和32號(hào)種質(zhì)(葉24),距離為0.00000。取自鞏留縣的野生核桃種質(zhì)間遺傳距離變化范圍為0.78571~0.87234,平均距離為0.86774;阿克蘇地區(qū)(庫車縣、溫宿縣、阿拉爾市)的栽培核桃種質(zhì)間遺傳距離變化范圍為0.12000~0.92157,平均距離為0.443690;葉城縣栽培核桃種質(zhì)間距離范圍為0.30769~0.93103,平均距離為0.63482;和田市栽培核桃種質(zhì)間距離范圍為0.2549~0.91489,平均距離為0.69161。這4個(gè)核桃種質(zhì)居群平均距離關(guān)系為0.86774(鞏留縣,野生種質(zhì))>0.69161(和田市,栽培種質(zhì))>0.63482(葉城縣,栽培種質(zhì))>0.44369(阿克蘇地區(qū),栽培種質(zhì)),這表明栽培核桃種質(zhì)整體上在長期栽培和定向選擇過程中可能接受了外來種質(zhì)的遺傳物質(zhì),因而出現(xiàn)了遺傳上的進(jìn)化,而野生種質(zhì)仍沒有受到外來種質(zhì)的干擾,表現(xiàn)出遺傳進(jìn)化上的保守性。而居群間單個(gè)核桃種質(zhì)的遺傳距離上限值關(guān)系是0.93103(葉城縣,千年核桃王,87號(hào))>0.92157(溫宿神木園,千年核桃,97號(hào))>0.91489(和田市,百年核桃,47號(hào))>0.87234(鞏留縣,野生核桃,9號(hào))。這表明最古老的核桃種質(zhì)在南疆地區(qū)(葉城、溫宿、和田),而整體遺傳基礎(chǔ)較廣的核桃種質(zhì)仍在北疆鞏留縣(野核桃林)。溫宿縣的早實(shí)、薄皮核桃種質(zhì)溫81、溫179、新豐等在栽培中品質(zhì)表現(xiàn)優(yōu)良,該核桃居群的長期進(jìn)化受到外來種質(zhì)干擾和人為定向選擇的影響程度較深,這與其平均遺傳距離小于其他居群的結(jié)果吻合。2.3不同產(chǎn)地核桃聚類分析聚類分析結(jié)果將所有供試材料分成了兩大類群(圖2),分別為1~61號(hào)、62~122號(hào)。第一類群(1~61號(hào))可分為5個(gè)亞類,第Ⅰ亞類包括16份種質(zhì),包括4組類型:第一組由1號(hào)、2號(hào)組成,取自庫車縣;第二組包括16號(hào)、17號(hào)、18號(hào)、20號(hào)、21號(hào)、23號(hào)、26號(hào)、28號(hào)共8份材料,主要取自溫宿縣核桃林場;第三組包括25號(hào)、27號(hào)、35號(hào)、50號(hào)共4份材料,前2個(gè)取自葉城縣,后2個(gè)取自和田市;第四組包括29號(hào)和44號(hào)2個(gè)材料,都取自葉城縣。第Ⅱ亞類共有29份種質(zhì),包括3組類型:第一組包括24號(hào)、33號(hào)、40號(hào)、49號(hào)、56號(hào)、57號(hào)、60號(hào)共7份材料,24號(hào)為取自鞏留縣的黑核桃,其余取自葉城縣及和田市;第二組包括30號(hào)、31號(hào)、32號(hào)、34號(hào)、36號(hào)、37號(hào)、38號(hào)、39號(hào)、41號(hào)、42號(hào)、45號(hào)、47號(hào)、51號(hào)、52號(hào)、53號(hào)、54號(hào)、55號(hào)、58號(hào)、59號(hào)、61號(hào)共20份材料,取自葉城縣與和田市;第三組包括43號(hào)和46號(hào),取自和田市。第Ⅲ亞類由48號(hào)材料獨(dú)立構(gòu)成,取自和田市。第Ⅳ亞類共有14份種質(zhì):3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、11號(hào)、12號(hào)、13號(hào)、14號(hào)、15號(hào)、19號(hào),其中3號(hào)取自若羌縣,19號(hào)取自溫宿縣,其余取自鞏留縣。第Ⅴ亞類只有22號(hào)1份種質(zhì)。第二類群(62~122號(hào))可分為2個(gè)亞類。第Ⅰ亞類包括59份種質(zhì),分3種類型:第一組包括13份材料,有62號(hào)、63號(hào)、65號(hào)、66號(hào)、69號(hào)、70號(hào)、71號(hào)、73號(hào)、75號(hào)、80號(hào)、81號(hào)、85號(hào)、86號(hào),取自葉城縣與和田市;第二組包括45份材料,包括除第一組及87號(hào)、103號(hào)、98號(hào)外的其余種質(zhì),取自葉城縣、和田市、溫宿縣和阿拉爾市;第三組為98號(hào),取自阿拉爾市。第Ⅱ亞類只有87號(hào)和103號(hào)2份材料,分別取自葉城縣和阿拉爾市。由聚類圖可以看出,新疆核桃各居群種質(zhì)之間存在差異,在圖上得到很好的區(qū)分。聚類圖展現(xiàn)了一定的地域特征,同一產(chǎn)地的核桃種質(zhì)基本被聚在同一個(gè)類群中,各居群之間核桃種質(zhì)資源存在交流現(xiàn)象,鞏留的野生核桃和溫宿的薄皮核桃聚在一個(gè)類群,溫宿神木園的千年核桃與葉城、和田的古老資源聚到一起。盡管有交流,但是各居群多數(shù)核桃種質(zhì)還是聚在一起,第二類群主要是葉城、和田的。特優(yōu)薄皮核桃栽培品種“溫81”(22號(hào)材料)獨(dú)自聚在第一類群的一個(gè)亞類,而且其他種質(zhì)與它存在明顯的距離,可能正是這比較寬的遺傳基礎(chǔ)使其在栽培實(shí)踐中表現(xiàn)出特優(yōu)良的品質(zhì)(皮很薄、質(zhì)地細(xì)膩)。圖中24號(hào)種質(zhì)是取自鞏留的美國黑核桃,其遺傳距離在0.41176,聚在第一類群的第Ⅱ亞類第一組,可以看出它與新疆其他核桃種質(zhì)的遺傳距離比較近。3討論3.1aflp試驗(yàn)結(jié)果該研究用7對(duì)特異引物對(duì)122份新疆核桃種質(zhì)進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)擴(kuò)增,平均多態(tài)性檢出率為40.1%。試驗(yàn)所用7對(duì)特異引物是直接從王紅霞對(duì)內(nèi)地核桃的研究結(jié)果中挑選的9對(duì)引物中,再用新疆核桃進(jìn)行篩選所得。體系建立和DNA提取方法都是直接參考前人的研究成果,預(yù)試驗(yàn)后稍作調(diào)整而成,試驗(yàn)所用DNA的吸光值(OD260nm/OD280nm)多數(shù)在1.6左右,較理想值稍低,但所得電泳條帶清晰。盡管AFLP技術(shù)比其他分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)各方面的要求較嚴(yán)格,從多態(tài)性結(jié)果和聚類圖與現(xiàn)實(shí)的符合度來看,AFLP技術(shù)在一定程度上將試驗(yàn)所提供的新疆核桃資源的遺傳多樣性進(jìn)行了較充分的揭示,評(píng)價(jià)的有效性是相對(duì)客觀的。從擴(kuò)增帶圖譜上可知23號(hào)種質(zhì)(溫179)條帶數(shù)比千年核桃王(87號(hào)種質(zhì))的多,從聚類圖上可看出栽培類群與野生古老種質(zhì)之間存在差異,又有交流,個(gè)別優(yōu)良材料如溫81(22號(hào)種質(zhì))、千年核桃(87號(hào)種質(zhì))等的遺傳基礎(chǔ)被進(jìn)一步證實(shí),充分展現(xiàn)了新疆核桃資源的多樣性和豐富程度。3.2核桃優(yōu)良種質(zhì)的遺傳關(guān)系聚類結(jié)果明顯將所有供試核桃種質(zhì)材料分成兩大類群,第一類群又分成5個(gè)亞類,第二類群分成2個(gè)亞類,亞類下面又分了若干小組。分類時(shí)考慮到了核桃資源的地域性,但資源之間的交流始終無法避免,即各居群核桃資源在被聚成類群、亞類及小組的過程中,各居群的多數(shù)核桃種質(zhì)都聚在一個(gè)小組內(nèi),但沒有任何居群獨(dú)自聚在一起的,