大鼠腰5脊神經(jīng)和脊神經(jīng)根不同部位損傷對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的影響

大鼠腰5脊神經(jīng)和脊神經(jīng)根不同部位損傷對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的影響

周圍神經(jīng)損傷和炎癥常導(dǎo)致神經(jīng)激素疼痛，包括疼痛過度過敏（非損傷刺激導(dǎo)致的疼痛）、疼痛反應(yīng)僵硬和自發(fā)疼痛。長(zhǎng)期以來國(guó)內(nèi)外學(xué)者雖然已經(jīng)進(jìn)行了大量研究,但對(duì)其產(chǎn)生機(jī)制仍然不十分清楚。因此,目前對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的治療也還沒有十分有效的措施。臨床上交通事故引起的坐骨神經(jīng)損傷,常引起頑固性疼痛,其損傷的神經(jīng)包括感覺和運(yùn)動(dòng)纖維。椎間盤突出壓迫脊神經(jīng)根,引起慢性腰腿痛,其受累的纖維可能有背根的感覺纖維和前根運(yùn)動(dòng)纖維。長(zhǎng)期以來,研究者們一直認(rèn)為病理性疼痛的產(chǎn)生主要是由于外傷和局部炎癥導(dǎo)致感受器和感覺傳入系統(tǒng)的功能異常而引起,但最近的研究發(fā)現(xiàn)選擇性損傷坐骨神經(jīng)中的運(yùn)動(dòng)纖維也能引起實(shí)驗(yàn)大鼠長(zhǎng)達(dá)5周以上的后肢痛覺過敏。而脊神經(jīng)背根損傷對(duì)病理性疼痛產(chǎn)生的影響也存在有一些相矛盾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此,本實(shí)驗(yàn)通過分別結(jié)扎切斷大鼠L5脊神經(jīng)(lumbar5spinalnerveligation,L5SNL)、L5背根(lumbar5dorsalrhizotomy,L5DR)和L5前根(lumbar5ventralrhizotomy,L5VR),結(jié)合痛行為學(xué)測(cè)試,系統(tǒng)觀察感覺纖維不同部位的損傷以及選擇性損傷運(yùn)動(dòng)纖維對(duì)大鼠痛覺過敏的誘導(dǎo)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生的機(jī)制和椎間盤脫出引起慢性腰腿痛的原因提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。材料和方法1.動(dòng)物的飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)采用成年雄性SD大鼠,體重180～250g,均由醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng)。動(dòng)物分籠飼養(yǎng),室溫保持在23±2℃和50～60%的濕度,12～12h白天-黑夜循環(huán)照明。所有實(shí)驗(yàn)步驟都盡量減輕動(dòng)物的痛苦并按照有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用原則操作。實(shí)驗(yàn)分為L(zhǎng)5SNL加切斷、L5DR和L5VR組。每組又包括手術(shù)組和假手術(shù)組。2.脊神經(jīng)的切除用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(50mg/kg,i.p.)動(dòng)物。按照Kim等報(bào)道的方法對(duì)大鼠進(jìn)行L5SNL并切斷。大鼠L5VR按照Li等描述的方法進(jìn)行。首先在4～6腰椎上方做正中切口,在4至5腰椎間行半椎板切除術(shù),暴露左半部脊髓后,用一鋒利細(xì)針輕輕劃破外側(cè)蛛網(wǎng)膜,直視下看到位于背根下方、外側(cè)的脊神經(jīng)前根后,用一特制的玻璃分針輕輕從背根下方提起前根,用眼科剪剪去2～3mm,然后用37℃生理鹽水沖洗切口,分層縫合肌肉和皮膚,待動(dòng)物蘇醒后放回動(dòng)物房。大鼠L5DR切除時(shí),打開蛛網(wǎng)膜后,用玻璃分針分離背根并切除2～3mm,其余操作同L5VR。假手術(shù)大鼠,除了不切除脊神經(jīng)前根和背根外,其余手術(shù)步驟完全等同于手術(shù)組。嚴(yán)格按照無(wú)菌操作原則進(jìn)行手術(shù)。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,L5VR和L5DR大鼠都經(jīng)過解剖以確認(rèn)前根或背根被切除,而且在L5的位置,不符合標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物從實(shí)驗(yàn)中去除。3.機(jī)械刺激敏感化指標(biāo)為了消除大鼠心理因素對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響,于測(cè)試前一周把大鼠放于測(cè)試箱內(nèi)15～20min,隔天一次,共3次。然后按Chaplan等報(bào)道的“up-down”法,選用8根呈對(duì)數(shù)遞增的vonFreyhair(0.41、0.70,1.20,2.04,3.63,5.50,8.51,15.14g)檢測(cè)大鼠機(jī)械刺激撤足閾值(pawwithdrawalthreshold,PWT),作為機(jī)械刺激敏感化的指標(biāo)。按照Hargreaves等報(bào)道的方法,使用熱平板測(cè)試儀(PlantarTest7370,UgoBasile,Italy)檢測(cè)大鼠熱刺激撤足潛伏期(pawwithdrawallatency,PWL),作為大鼠熱刺激痛覺過敏的指標(biāo)。PWT和PWL的測(cè)試均在每天上午9:00點(diǎn)開始,每2天測(cè)試一次,2周后測(cè)試間隔逐漸延長(zhǎng)。4.ilco麻黃司4.3方法所有行為學(xué)測(cè)試結(jié)果均用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析。同一組大鼠不同測(cè)試時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)用配對(duì)的秩和檢驗(yàn)(Wilcoxonmatchedpairstest)分析。兩個(gè)不同實(shí)驗(yàn)組某個(gè)測(cè)試日間的數(shù)據(jù)比較采用U檢驗(yàn)(Mann-WhitneyUtest)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析通過SPSS10.0(SPSSInc,USA)進(jìn)行,所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,P<0.05認(rèn)為差異有顯著性。結(jié)果1.假手術(shù)組大鼠機(jī)械刺激撤足閾值和熱刺激撤足刑期比較L5SNL后大鼠后腳掌皮膚表現(xiàn)出對(duì)機(jī)械刺激和熱刺激痛覺過敏。與手術(shù)前基礎(chǔ)值和假手術(shù)組比較,大鼠50%的機(jī)械刺激撤足閾值(圖1A)和熱刺激撤足潛伏期(圖1B)于術(shù)后1d顯著下降(P<0.05),術(shù)后3～7d降至最低(P<0.001),在同側(cè)后肢顯著性差異保持到了術(shù)后的35d,而在對(duì)側(cè)后肢也持續(xù)3周以上。2.兩組撤足閾值和熱刺激撤足刑期比較痛行為學(xué)測(cè)試發(fā)現(xiàn),L5VR大鼠同側(cè)及對(duì)側(cè)后肢50%機(jī)械刺激撤足閾值(圖2A)和熱刺激撤足潛伏期(圖2B)與手術(shù)前基礎(chǔ)值和假手術(shù)組比較,手術(shù)后1d顯著下降(P<0.05),7d降至最低點(diǎn)(P<0.001),顯著性差異一直保持至術(shù)后5周左右。3.r大鼠50%機(jī)械刺激撤足閾值與熱刺激撤足刑期比較與手術(shù)前基礎(chǔ)值和假手術(shù)組比較,L5DR大鼠50%機(jī)械刺激撤足閾值(圖3A)和熱刺激撤足潛伏期(圖3B)均無(wú)明顯變化(P>0.05)。結(jié)果見圖3。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)損傷的作用機(jī)制本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)L5SNL可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生病理性疼痛,選擇性切除L5前根而不損傷初級(jí)感覺神經(jīng)元也能引起大鼠雙側(cè)后肢痛覺過敏,但是選擇性損傷L5背根卻不能引起大鼠的痛行為。表明脊神經(jīng)和脊神經(jīng)根不同部位的損傷對(duì)病理性疼痛的產(chǎn)生發(fā)揮不同的作用。早在1992年Kim等發(fā)現(xiàn)大鼠L5SNL可引起雙側(cè)后肢不同程度的痛覺過敏,損傷同側(cè)后肢的痛行為學(xué)變化大持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),對(duì)側(cè)后肢的痛覺過敏較輕且持續(xù)時(shí)間短。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)L5SNL可在術(shù)后1d引起雙側(cè)后肢明顯的痛覺過敏,同側(cè)后肢的痛行為學(xué)的變化持續(xù)到了術(shù)后5周左右,而對(duì)側(cè)也維持到了術(shù)后3周,結(jié)果與Kim等的報(bào)道基本一致。L5脊神經(jīng)是組成坐骨神經(jīng)的重要分支,其感覺纖維支配大鼠腳掌外側(cè)的皮膚淺感覺。大鼠L5SNL后雖然引起其支配的肌肉運(yùn)動(dòng)和皮膚感覺功能障礙,但由于L4脊神經(jīng)在后肢屈肌反射起主要作用,所以對(duì)大鼠屈腿并無(wú)顯著影響。又由于L3、4、5、6對(duì)大鼠腳掌皮膚的支配存在有一定程度的重疊,而且損傷纖維的Wallerian變性會(huì)引起臨近未損傷的L4、6DRG神經(jīng)元的敏感化。關(guān)于L5SNL引起大鼠病理性疼痛的機(jī)制已經(jīng)有大量的研究。早期的工作主要集中在受損傷的初級(jí)感覺神經(jīng)元形態(tài)與功能的變化。但近年來的研究發(fā)現(xiàn)鄰近未損傷的初級(jí)傳入神經(jīng)元可能在L5SNL引起病理性疼痛中發(fā)揮更為重要的作用。因?yàn)?無(wú)論于術(shù)前1d,還是于術(shù)后7d切除L5背根,都不能阻斷和減輕L5SNL引起的大鼠痛覺過敏。但是,如果于術(shù)后第7d切除大鼠L4背根,卻能使L5SNL引起的痛覺過敏立刻得到緩解。最新的研究證明大鼠L5SNL不僅在L5背根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglia,DRG),而且在L4DRG也引起了蛋白激酶的激活、離子通道的表達(dá)變化和DRG神經(jīng)元的自發(fā)放電。因此,大鼠L5SNL是一個(gè)理想而常用的研究病理性疼痛的模型。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維損傷在周圍神經(jīng)外傷引起病理性疼痛中的作用一直是一個(gè)懸念,而且長(zhǎng)期以來沒有得到足夠的重視。2002年Li等報(bào)道選擇性切除大鼠前根,而保持感覺神經(jīng)元的完整,也能誘導(dǎo)大鼠雙側(cè)后肢產(chǎn)生長(zhǎng)達(dá)5周以上的痛覺過敏,結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)一致。L5脊神經(jīng)前根主要由運(yùn)動(dòng)纖維組成,感覺纖維少于4%。關(guān)于運(yùn)動(dòng)纖維損傷引起大鼠病理性疼痛的機(jī)制,目前大都認(rèn)為是由于損傷纖維局部致炎因子(TNF-α、IL-1、IL-6等)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子的釋放引起炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),并進(jìn)而引起損傷纖維的Wallerian變性,在局部引起慢性炎癥。在此過程釋放的大量細(xì)胞因子作用于鄰近未損傷的初級(jí)感覺神經(jīng)元,導(dǎo)致其功能改變而引起痛覺過敏。Wu等發(fā)現(xiàn)大鼠L5VR后,L4DRG呈現(xiàn)自發(fā)放電形式,并伴有痛行為學(xué)改變。作者本人最近的研究發(fā)現(xiàn)預(yù)先使用TNF-α合成抑制劑可阻斷L5VR引起的大鼠病理性疼痛。提示運(yùn)動(dòng)纖維損傷刺激釋放的細(xì)胞因子可能在其誘導(dǎo)產(chǎn)生的病理性疼痛過程發(fā)揮重要作用。關(guān)于一側(cè)神經(jīng)損傷引起對(duì)側(cè)后肢痛覺過敏的現(xiàn)象,有人把其稱為“鏡像痛”(mirrorimagepain),其機(jī)制較為復(fù)雜。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑可阻斷對(duì)側(cè)后肢的痛行為。提示脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的激活和信息傳遞可能參與介導(dǎo)了“鏡像痛”。脊神經(jīng)背根主要由初級(jí)感覺神經(jīng)元的中樞突組成,其主要功能是傳導(dǎo)軀體感覺。因此,在臨床上選擇性切除背根有時(shí)被用來緩解身體某部的頑固性疼痛。由于背根中也含有肌肉牽張反射的傳入纖維,所以背根切除也常被用來緩解肌肉痙攣,如肌痙攣性斜頸。但是,有報(bào)道一些兒童接受過此手術(shù)后,常引起相應(yīng)皮膚部位出現(xiàn)痛覺過敏樣癥狀。同時(shí),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)L5DR并不能有效緩解L5SNL引起的大鼠病理性疼痛,相反,大鼠L5DR后卻產(chǎn)生了明顯的痛覺過敏癥狀。但最近Obata等報(bào)道大鼠L5DR僅引起輕微和短暫的痛行為學(xué)變化,而選擇性切除L5DRG卻能引起大鼠病理性疼痛的產(chǎn)生。Ramer等發(fā)現(xiàn),選擇性切除背根不引起大鼠的機(jī)械刺激和熱刺激痛覺過敏,但引起了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物冷刺激的敏感化。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)L5DR沒有引起大鼠痛行為學(xué)