東亞鉗蝎毒素純化組分對(duì)大鼠皮膚痛覺的影響

東亞鉗蝎毒素純化組分對(duì)大鼠皮膚痛覺的影響

1材料和方法1.1動(dòng)物、材料和儀器wistar大鼠，h，240-300g，由中國科學(xué)院上海腦研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供。東亞鉗子的粗毒從蘇州郊區(qū)的個(gè)人蝎子育種廠購買，nalophone，購自西格瑪。rty-3大鼠輻射熱測量系統(tǒng)、西安鳳蘭電子儀器廠、smup生物信號(hào)微型處理系統(tǒng)、上海醫(yī)科大學(xué)生物科學(xué)研究部。1.2蛋白峰的分離和純化東亞鉗蝎粗毒由電刺激法采集,首先經(jīng)SephadexG-25分子篩柱,取峰1,再經(jīng)SephadexG-50凝膠柱進(jìn)行分離得4個(gè)蛋白吸收峰.峰1-1,1-2主要為分子量在9000以上的大分子物質(zhì),根據(jù)多肽分子表面電荷性質(zhì)的不同,用DEAESephadexA-50陰離子交換凝膠柱將峰3分離得5個(gè)蛋白吸收峰,對(duì)樣品1-3-2經(jīng)HPLC圖譜鑒定可得1-3-2-1和1-3-2-2兩個(gè)組分,再用RP-HPLC方法將其反復(fù)純化,經(jīng)SDS-PAG電泳的鑒定,得BmKAS-1.1.3手術(shù)方法2.4大鼠在戊巴比妥鈉(40mg·kg-1,ip)麻醉下手術(shù),作頭頸背部正中皮膚切口,暴露寰枕膜,在枕骨大孔處挑破寰枕膜插入PE10管,插入時(shí)注意勿刺傷脊髓,自枕骨大孔插入脊髓蛛網(wǎng)膜下腔7.5cm左右(根據(jù)動(dòng)物體重調(diào)整插入深度),管尖抵達(dá)脊髓腰膨大處.術(shù)后2d選四肢無運(yùn)動(dòng)異常的動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn),試驗(yàn)畢進(jìn)行尸檢,凡管尖未達(dá)到規(guī)定部位者其結(jié)果摒棄不用.1.4基礎(chǔ)痛閾的測定先將大鼠放在輻射熱測痛儀實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,安靜5min后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以縮腿潛伏期(PWL)作為測痛指標(biāo).調(diào)節(jié)測痛儀光輻射熱強(qiáng)度,使基礎(chǔ)PWL在4-6s.給藥前每隔3min測痛1次,取3次平均值作為基礎(chǔ)痛閾,鞘內(nèi)給藥后每隔3min測痛1次,以所測PWL值與基礎(chǔ)痛閾的變化百分?jǐn)?shù)來表示痛閾變化,以PWL升高150%為上限以防灼傷鼠足跖.鞘內(nèi)給藥時(shí),每次注射總體積15μL(藥液5μL在前,生理鹽水10μL在后),對(duì)照注射等體積的生理鹽水,納洛酮在BmK給藥前10min給予.1.5sm回復(fù)突變反應(yīng)amk用氨基甲酸乙酯(1.1g·kg-1,ip)麻醉大鼠俯臥在自動(dòng)調(diào)節(jié)溫度的恒溫平臺(tái)上,用一對(duì)不銹鋼針插入單側(cè)后肢第二,三腳趾皮下,施強(qiáng)電流刺激(40V,4ms,0.5Hz,每組連續(xù)15次,兩組間隔3min)作為傷害性刺激.一對(duì)針電極插入同側(cè)下肢半膜半腱肌作為記錄電極.誘發(fā)的反應(yīng)由A和C兩個(gè)成分組成.經(jīng)前級(jí)放大器和VC-11型示波器,輸入到SMUP微機(jī)處理系統(tǒng),根據(jù)設(shè)定的“窗口”和信號(hào)電平,只選擇C反應(yīng)作面積積分.待誘發(fā)的肌電反應(yīng)穩(wěn)定后,在緊靠兩刺激電極尖端之間的跖部sc注射藥物,所有注射均在同一部位,每次注射10μL,對(duì)照注入等體積的生理鹽水,納洛酮在BmK給藥前10min給予.1.62結(jié)果2.1納洛酮在bmkf-10.0.0.3.每只大鼠ithBmKAS-11.2g,給藥后3min痛閾已明顯升高,達(dá)140%,至9min時(shí)痛閾提高至150%以上,持續(xù)至18min迅速下降.每只以0.6μgith后3min痛閾提高,在70%-100%之間持續(xù)達(dá)15min.以0.1μgBmKAS-1同樣給藥則未見痛閾提高(圖1).用同樣的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),未觀察到納洛酮對(duì)BmKAS-1的鎮(zhèn)痛有翻轉(zhuǎn)作用.每只給予BmKF-1-30.01-0.003μgith后,可見動(dòng)物明顯的異常反應(yīng),如呼吸加快,后肢痙攣,頻繁排尿,反應(yīng)遲鈍等.在0.001μg時(shí)上述毒性反應(yīng)基本消失,但亦未見提高痛閾的作用.2.2納洛酮對(duì)bmkf-1,bmks-2,bmkf-1的抑制作用以電刺激大鼠后肢趾部誘發(fā)的半膜半腱肌C成分作為痛閾反應(yīng)指標(biāo),在刺激電極間每只scBmKF-1-380μg對(duì)C成分最大抑制率為70%,40μg時(shí)最大抑制率為50%(圖2).BmKF-1-3-260,30和15μg的最大抑制率分別為62%,53%和26%,抑制作用維持約20min(圖3).BmKAS-120,10和5μg最大抑制率分別為71%,50%,28%(圖4).納洛酮對(duì)BmKF-1-3,BmKF-1-3-2,BmKAS-1的外周鎮(zhèn)痛均無翻轉(zhuǎn)作用.3亞氏原螯蝦思想神經(jīng)再生時(shí)體外熱痛行為的反應(yīng)本研究觀察到的第一個(gè)現(xiàn)象是BmKAS-1sc和ith后及BmKF-1-3-2和BmKF-1-3sc后,對(duì)外周痛有抑制作用,并且這種抑制作用可能既涉及到中樞機(jī)理,也涉及到外周機(jī)理.本研究觀察到的第二個(gè)現(xiàn)象是東亞蝎毒多肽的鎮(zhèn)痛作用不通過阿片系統(tǒng)產(chǎn)生,作者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,無論是外周皮膚感受野給藥還是脊髓蛛網(wǎng)膜ith給藥,其鎮(zhèn)痛作用均不被納洛酮翻轉(zhuǎn),這說明該類毒素活性多肽的鎮(zhèn)痛機(jī)理可能有別于阿片肽類物質(zhì).作者先前的工作表明東亞鉗蝎毒素幾種初級(jí)純化組分有鎮(zhèn)痛作用.但同時(shí)也看到局部感受野sc給藥出現(xiàn)較明顯的紅腫現(xiàn)象,這說明初級(jí)純化組分中含有致炎物質(zhì),那么隨著純化程度的提高,鎮(zhèn)痛作用是否隨之增強(qiáng)?致炎和毒性作用隨之減弱?這是本工作要回答的第三個(gè)問題.作者觀察到在皮膚局部感受野強(qiáng)電流刺激誘發(fā)肌電C反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中,BmKAS-1抑制50%C成分的劑量比BmKF-1-3,BmKF-1-3-2降低了3-4倍,但BmKF-1-3和BmKF-1-3-2相差不大.而在脊髓給藥足跖輻射熱痛閾實(shí)驗(yàn)中,BmKAS-1有明顯的提高痛閾的作用,BmKF-1-3無作用,看來蝎毒純化程度和鎮(zhèn)痛強(qiáng)度之間關(guān)系并非線性正相關(guān)的關(guān)系.從本實(shí)驗(yàn)BmKF-1-3在外周給藥和脊髓給藥不同的作用特點(diǎn)來看,東亞鉗蝎毒多肽的鎮(zhèn)痛作用機(jī)理可能是比較復(fù)雜的,對(duì)不同類型的鎮(zhèn)痛作用不同.既然蝎毒多肽的鎮(zhèn)痛作用與阿片受體無關(guān),那么其通過何種機(jī)理起作用?這是在學(xué)術(shù)和應(yīng)用開發(fā)研究中均有重要意義的疑題.目前作者正在進(jìn)行東亞鉗蝎毒素多肽對(duì)背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞TTX-R和TTX-S鈉通道作用和NMDA受體通道作用的研究,以期更深入地了解東亞鉗蝎毒素多肽的作用機(jī)理.結(jié)果以C反應(yīng)面積抑制百分比表示,組間差異的比較用t檢驗(yàn).蝎神經(jīng)毒素的多個(gè)純化組分作為工具藥被應(yīng)用在神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理的研究中.自70年代Miranda等首次成功地從北非3種蝎毒中純化并鑒定了11個(gè)神經(jīng)毒素多肽以來,距今20多年間,國際上已陸續(xù)報(bào)道了在近30個(gè)不同種屬蝎毒中100多個(gè)神經(jīng)毒素多肽成分.與此相比,對(duì)已分離的多肽其功能的研究還有太多的空區(qū).本研究組對(duì)國產(chǎn)東亞鉗蝎(學(xué)名馬氏鉗蝎,ButhusmartensiKarsch,BmK)毒素的純化,結(jié)構(gòu)解析和對(duì)受體的作用進(jìn)行了系統(tǒng)的研究.BmKAS-1是新近篩分的經(jīng)HPLC純化獲得的一個(gè)多肽,BmKAS-1完整的序列結(jié)構(gòu)已被確定,由66個(gè)殘基組成,經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)觀察,BmKAS類多肽可增強(qiáng)標(biāo)記的Ryanodine與兔骨骼肌