一種厭氧氨氧化菌的分離鑒定

一種厭氧氨氧化菌的分離鑒定

1厭氧氨氧化反應(yīng)硝化反硝化研究和脫氮理論在過(guò)去一直占據(jù)主導(dǎo)地位。氨氧化是在絕對(duì)好氧條件下進(jìn)行的（schmidtal.2002；陳福生等，2004）。Mulder等(1995)在荷蘭的Gist-Brocades公司處理工業(yè)廢水的中試流化床中發(fā)現(xiàn)氨氮的消失與亞硝酸的消失同時(shí)發(fā)生,且成一定的比例,他們認(rèn)為反應(yīng)器內(nèi)氨氮與亞硝酸鹽同時(shí)發(fā)生的反應(yīng),產(chǎn)物為氮?dú)?并將此命名為厭氧氨氧化(anaerobicammoniaoxidation,Anammox)。vandeGraaf等(1995)通過(guò)一系列研究證明厭氧氨氧化過(guò)程是生物過(guò)程,并隨后證明參與厭氧氨氧化反應(yīng)的微生物是自養(yǎng)型細(xì)菌,富集培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)參與厭氧氨氧化的細(xì)菌為格蘭氏陰性。厭氧氨氧化的發(fā)現(xiàn)對(duì)于開發(fā)高效新型的廢水生物脫氮工藝具有重要意義(Khin&Annachhatre,2004)。因此,國(guó)內(nèi)外學(xué)者一方面致力于用普通活性污泥啟動(dòng)厭氧氨氧化反應(yīng)器,另一方面繼續(xù)探討厭氧氨氧化菌的特性和運(yùn)行條件。本文主要針對(duì)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)厭氧氨氧化菌的鑒定和特性進(jìn)行綜述。2厭氧細(xì)菌的作用2.1厭氧氨氧化反應(yīng)機(jī)理vandeGraaf等(1995)通過(guò)一系列研究證明厭氧氨氧化過(guò)程是生物過(guò)程,并隨后證明參與厭氧氨氧化反應(yīng)的微生物是自養(yǎng)型細(xì)菌;又在研究厭氧氨氧化的反應(yīng)機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)此反應(yīng)是在3種酶的催化作用下完成,即亞硝化還原酶,肼的水解酶和肼的氧化酶,這3種酶可能由厭氧氨氧化菌分泌(vandeGraafetal.,1996);用15N作為示蹤元素,研究了厭氧條件下的氨氧化,提出了厭氧氨氧化菌(浮霉?fàn)罹?在厭氧條件下以亞硝酸鹽為電子受體的氨氧化代謝途徑(vandeGraafetal.,1997)。因此,厭氧氨氧化菌對(duì)于完成厭氧氨氧化反應(yīng)具有重要作用。2.2大陸板塊沉積物的厭氧氨氧化菌多樣性海洋沉積物大都處于厭氧狀態(tài),沉積物中的無(wú)機(jī)氮亞硝酸鹽和硝酸鹽一方面發(fā)生著反硝化的作用,另一方面銨鹽和亞硝酸鹽發(fā)生著厭氧氨氧化反應(yīng)。Ward等(2003)認(rèn)為,海洋中30%～50%的氮?dú)猱a(chǎn)出與厭氧氨氧化菌有關(guān),最初的計(jì)算表明與海洋50%的氮循環(huán)有關(guān);大陸板塊沉積物海洋中67%的氮?dú)猱a(chǎn)出與厭氧氨氧化菌有關(guān),比反硝化對(duì)氮的去除更重要(Thamdrup&Dalsgaard,2002)。無(wú)論是自然生態(tài)系統(tǒng)還是人工生態(tài)系統(tǒng),厭氧氨氧化菌都是氮?dú)獾闹饕圃煺?。因?厭氧氨氧化對(duì)于全球的氮循環(huán)發(fā)揮著重要作用。2.3厭氧氨氧化物歧化物及亞硝酸鹽的去除通過(guò)富集培養(yǎng),厭氧氨氧化反應(yīng)器中厭氧氨氧化菌達(dá)到一定濃度后可以達(dá)到很高的脫氮效果。Ahn和Choi(2006)在外部通風(fēng)的一個(gè)UASB(upflowanaerobicsludgebed)反應(yīng)器的人工配水試驗(yàn)中NH4+的去除高達(dá)95%(TN達(dá)92%);用污泥消化液作為進(jìn)水,總氮去除率第5天和第7天分別達(dá)76%±1.5%和94%±1.7%。Sliekers等(2002)在一個(gè)簡(jiǎn)單自養(yǎng)氨氧化反應(yīng)器中,發(fā)現(xiàn)85%的氮?dú)猱a(chǎn)出由于厭氧氨氧化作用。Furukawa等(2006)運(yùn)用SNAP(single-stagenitrogenremovalusingAnammoxandpartialnitritation)反應(yīng)器,氨氮的去除達(dá)60%～80%。Ahn等(2004)運(yùn)用UASB反應(yīng)器處理豬舍垃圾,2個(gè)反應(yīng)器每天處理的總氮分別為0.59和0.66g·L-1。Trigo等(2006)運(yùn)用MSBR(modifiedsequencingbatchreactor)使氮的移除每天達(dá)0.71g·L-1。張龍和肖文德(2005)利用UASB反應(yīng)器,氨氮和亞硝酸的去除率分別達(dá)63%和78%。周少奇和姚俊芹(2005)成功啟動(dòng)了UASB反應(yīng)器,NH4+-N、NO2--N和TN的去除率分別達(dá)99.4%、97.4%和90.0%。Dapena-Mora等(2004)運(yùn)行了厭氧氨氧化氣提式反應(yīng)器和SBR(sequencingbatchreactor),亞硝酸的去除率高達(dá)99%。Strous等(1997)采用20個(gè)不同形式的流化床反應(yīng)器對(duì)合成基質(zhì)的研究表明,反應(yīng)器系統(tǒng)的基質(zhì)轉(zhuǎn)化率NH4+-N可達(dá)3.0kg·m-3·d-1,NH4+和NO2-平均去除率分別達(dá)99.5%和84.6%。可見厭氧氨氧化技術(shù)對(duì)處理含氮廢水具有很高的效率。2.4ringeniza和anammox組合工藝在自然界和人工生態(tài)系統(tǒng)中,氨和亞硝酸是厭氧氨氧化菌的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。有氧條件下,氨很容易被亞硝化細(xì)菌氧化生成NO-2,而在缺氧條件下厭氧氨氧化菌以NH+4為電子供體,將NO-2反硝化生成N2。SHARON(simultaneousnitrificationanddenitrification)和ANAMMOX組合工藝就是在這2種菌的協(xié)同作用下開發(fā)出來(lái)的,即SHARON反應(yīng)器中包括氨和亞硝酸鹽的混合物,當(dāng)流向ANAMMOX反應(yīng)器時(shí),在厭氧條件下轉(zhuǎn)變成N2(Jetten,1997)。2002年荷蘭Delft工業(yè)大學(xué)的Sliekers等(2002)提出了一種新型的生物脫氮工藝Canon工藝,就是運(yùn)用這2種菌的作用。Furukawa等(2006)運(yùn)用SNAP反應(yīng)器,通過(guò)厭氧氨氧化菌和好氮氨氧化菌共存于固定不動(dòng)的污泥上共同發(fā)揮脫氮作用。Kalyuzhnyi等(2006)成功地在實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定運(yùn)行了新的生物脫氮過(guò)程DEAMOX(denitrifyingammoniumoxidation),就是通過(guò)反硝化菌和厭氧氨氧化菌的聯(lián)合作用。3淡水生態(tài)系統(tǒng)厭氧氨氧化最初是Mulder等(1995)在荷蘭的Gist-Brocades公司處理工業(yè)廢水的中試流化床中發(fā)現(xiàn),隨后人們?cè)趯?shí)驗(yàn)室的反應(yīng)器通過(guò)富集培養(yǎng)都獲得了厭氧氨氧化菌,反應(yīng)器啟動(dòng)的污泥分別采自于污水處理廠的活性污泥、垃圾填埋場(chǎng)的滲濾液和池塘的底泥等(阮文權(quán)等,2002;周少奇和姚俊芹2006;周少奇,2006),說(shuō)明厭氧氨氧化菌在淡水生態(tài)系統(tǒng)中分布廣。近來(lái)也發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化菌在海洋的氮循環(huán)起著很重要的作用(Kuyperetal.,2003),分子組成表明,這群菌有豐富的序列和廣泛的分布(Dalsgaardetal.,2005)。自然界中高鹽生態(tài)系統(tǒng)中已發(fā)現(xiàn)的厭氧氨氧化種群屬于Candidatus“Scalinduasorokinii”(Kuypersetal.,2003),其它種群發(fā)現(xiàn)在淡水生態(tài)系統(tǒng)中。2種厭氧氨氧化種群很少發(fā)現(xiàn)在同一生態(tài)系統(tǒng)中,表明每一個(gè)屬的厭氧氨氧化菌有著自己獨(dú)特的特性和特定的生態(tài)系統(tǒng)(Kartaletal.,2007)。由于目前沒有純化該菌種,雖然對(duì)發(fā)現(xiàn)的每一種厭氧氨氧化菌有介紹,但對(duì)于它的小生境仍就未知(Kartaletal.,2006)。4mmol菌的分離自然環(huán)境中微生物很豐富,但真正能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的不到10%(劉志恒和姜成林,2004)。由于Anammox菌生長(zhǎng)速度很慢,在自然環(huán)境中數(shù)量極少,采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)至今仍未成功分離。雖然有報(bào)導(dǎo)可以用離心法來(lái)純化,但用這種方法純化的細(xì)胞的數(shù)量相當(dāng)?shù)?Strous&Jetten,2004)。而現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展,為鑒定環(huán)境中的微生物和研究環(huán)境中微生物群落的多樣性提供了有力的工具(單國(guó)彬等,2006)。4.1anammox基因最早發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化菌屬于分枝很深的浮霉菌目(Strousetal.,1999)?；谶@個(gè)發(fā)現(xiàn),首次命名的菌是在SBR反應(yīng)器中的厭氧氨氧化污泥富集得到,通過(guò)16SrRNA確定該菌為浮霉菌目的一個(gè)新菌種,并命名為Candidatus“Brocadiaanammoxidans”(Kuenen&Jetten,2001)。Schmid等(2000)在德國(guó)幾個(gè)污水處理廠發(fā)現(xiàn)了一種新的16SrDNA序列,與Candidatus“Brocadiaanammoxidans”的序列相似度只有85%,被暫時(shí)命名為Candidatus“Kueneniastuttgartiensis”。Schmid等(2003)在英國(guó)Pitsea處理垃圾滲濾液的污水處理廠中發(fā)現(xiàn)了特殊的Anammox種群,有2個(gè)種與浮霉菌目的2個(gè)種有99%的同源性,暫時(shí)定名為Candidatus“Scalinduabrodae”和Candidatus“Scalinduawagneri”。Egli等(2001)在瑞士處理有毒廢物垃圾填埋場(chǎng)生物轉(zhuǎn)盤(RBC)富集到一種厭氧氨氧化細(xì)菌,16SrDNA序列與Candidatus“Kueneniastuttgartiensis”有98.5%～98.9%相同。Egli等(2003)又發(fā)現(xiàn)在沒有有機(jī)碳條件下,生物膜上微生物的好氧氨氧化的種群為Nitrosomonaseuropaea和N.eutropha,厭氧氨氧化種為Candidatus“Kueneniastuttgartiensis”,絲狀菌來(lái)自細(xì)菌門,亞硝酸氧化菌來(lái)自螺菌屬(Nitrospira)。Toh等(2002)在澳大利亞悉尼的生活污水處理廠污泥中分離和富集到一種自養(yǎng)厭氧氨氧化菌群,主導(dǎo)細(xì)菌與Candidatus“Brocadiaanammoxidans”有著相似的形態(tài)和序列,因此可認(rèn)為是Candidatus“Brocadiaanammoxidans”。Kuyper等(2003)在黑海發(fā)現(xiàn)了一種新的Anammox菌,并定名為Candidatus“CandidatusSorokinii”,這是首次發(fā)現(xiàn)能將自然界中固定的無(wú)機(jī)氮直接移除的厭氧氨氧化菌。Yang等(2006)在一個(gè)制酒廢水處理的厭氧和好氧的水池中發(fā)現(xiàn)了象浮霉菌目的厭氧氨氧化菌,通過(guò)16SrRNA鑒定,未定種與浮霉菌目的4個(gè)屬(Planctomyces,Pirellula,IsosphaeraandGemmata)有81%～89%的同源性。Kartal等(2007)在實(shí)驗(yàn)室的生物反應(yīng)器中成功富集了Anammox菌,暫時(shí)定名為Candidatus“Anammoxoglobuspropionicus”。4.2厭氧氨氧化菌的篩選Strous等(1999)發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化菌的混合培養(yǎng)物中存在大量的硝化細(xì)菌,由此推測(cè),厭氧氨氧化菌與硝化菌(特別是氨氧化菌)有某種內(nèi)在的聯(lián)系,后者可能在過(guò)程中起作用。Bock等(1995)發(fā)現(xiàn),亞硝化單胞菌屬Nitrosomonas中的N.europaea和N.eutropha,可在厭氧條件下以氨為電子供體使亞硝酸鹽還原,他們認(rèn)為這2種細(xì)菌參與厭氧氨氧化。Jetten等(1997)指出,亞硝化單胞菌在氧限制的情況下,可轉(zhuǎn)化氨為氮?dú)獾耐瑫r(shí)消耗氧;在絕對(duì)無(wú)氧時(shí),根本觀察不到氨的轉(zhuǎn)化。胡寶蘭等(2001)報(bào)道,從厭氧氨氧化反應(yīng)器中分離出的厭氧氨氧化菌類似亞硝化單胞菌屬細(xì)菌。Sliekers等(2004)以尿素作為厭氧氨氧化的能源,發(fā)現(xiàn)在富集的厭氧氨氧化種群中N.oligotropha占50%,N.nitrosa占15%,N.eutopaea占5%。而Bock等(1995)認(rèn)為在厭氧條件下,N.europaea的純培養(yǎng)物能夠用氫和NH+4作為電子供體進(jìn)行反硝化。5厭氧氨氧化反應(yīng)Jetten等(1999)從Anammox工藝的反硝化流化床反應(yīng)器中分離并獲取了Anammox細(xì)菌,經(jīng)富集培養(yǎng)后獲得了一種優(yōu)勢(shì)自養(yǎng)菌,該優(yōu)勢(shì)菌種為一種具有不規(guī)則球狀的革蘭氏陰性菌。從其它研究學(xué)者來(lái)看,他們一致認(rèn)為厭氧氨氧化菌是圓形和橢圓形的革蘭氏陰性菌(Sliekersetal.,2004)。該菌具有復(fù)雜的細(xì)胞,外包裹著蛋白質(zhì)和脂多糖;它們聚集生長(zhǎng),蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)和脂多糖一樣相互作用導(dǎo)致凝膠體在體外形成(Cirpusetal.,2006)。圖1、圖2和圖3為厭氧氨氧化的一些顯微圖片。圖1可以看出,厭氧氨氧化反應(yīng)器中優(yōu)勢(shì)菌大部分為圓形細(xì)胞。圖2A、B、C為被冷藏的厭氧氨氧化菌電子顯微鏡的照片,A與B表明細(xì)胞外包圍著膜;C表明冷凍后內(nèi)部形成冰晶以及內(nèi)部獨(dú)特的膜結(jié)構(gòu);D表明在反應(yīng)器中可能存在硝化菌細(xì)胞。圖3可見,生物膜上布滿著豐富的菌絲,在活性污泥和絲狀菌上布滿著很多圓形和橢圓形的細(xì)菌。筆者周少奇在實(shí)驗(yàn)室成功啟動(dòng)了5套UASB反應(yīng)器,通過(guò)厭氧氨氧化菌富集培養(yǎng),取出富集培養(yǎng)的活性污泥在電鏡下觀察優(yōu)勢(shì)菌為橢圓形的菌,在UASB生物膜反應(yīng)器活性污泥上可看到大量的菌絲。6厭氧氨氧化的影響由于沒有分離到純的菌株,因此很難研究它的生理特征。研究者只能從反應(yīng)器中是否發(fā)生厭氧氨氧化,以及在什么情況下除氮效果最好間接說(shuō)明它的生理生化特征。厭氧氨氧化的生理生化特征非常適合轉(zhuǎn)化氨和亞硝酸鹽,除了氨之外,尿素也可以通過(guò)兩周的適應(yīng)期后在CANON反應(yīng)系統(tǒng)里被轉(zhuǎn)化(Sliekesetal.,2004;Kartaletal.,2004)。Egli等(2001)研究指出Candidatus“Kueneniastuttgartiensis”能耐受磷酸鹽高達(dá)13mmol,亞硝酸鹽高達(dá)13mmol,但是生物活性低,除氮效果差;最大厭氧氨氧化活性pH為8,溫度是37℃;在45℃時(shí)沒有觀察到厭氧氨氧化活性。Jetten等(1999)認(rèn)為,厭氧氨氧化工藝的溫度范圍為20℃～43℃,最佳為40℃;pH范圍為6.7～8.3,最佳為8.0,在最佳條件下,Candidatus“Brocadiaanammoxidans”活性為55nmo1·mg-1·min-1。Thamdrup和Dalsgaard(2002)則認(rèn)為,有活性的溫度范圍為6℃～43℃。濃度高于20mmo1·L-1的亞硝酸鹽將會(huì)產(chǎn)生抑制作用,超過(guò)2mmol·L-1的磷酸鹽濃度也將會(huì)造成活性的失去。Trigo等(2006)觀察到高鹽的濃度將影響膜生物反應(yīng)器中氮的移除效果。Kartal等(2006)指出淡水的厭氧氨氧化種群可以逐步適應(yīng)鹽的濃度高達(dá)30g·L-1。厭氧氨氧化適宜厭氧的環(huán)境,但在低至5mg·L-1的溶解氧濃度時(shí),厭氧氨氧化活性被完全抑制(Strousetal.,1997)。Third等(2005)指出絮狀物上的生物對(duì)阻止同時(shí)發(fā)生硝化和厭氧氨氧化的低氧濃度非常敏感,同時(shí)指出,在CANON反應(yīng)器中,通過(guò)間隙曝氣,厭氧氨氧化菌的活性沒受到抑制。Kang和Wang(2006)在實(shí)驗(yàn)室EGSB反應(yīng)器中研究了化學(xué)需氧量(COD)濃度對(duì)厭氧氨氧化的影響,發(fā)現(xiàn)反應(yīng)初期COD(濃度為500mg·L-1)對(duì)氨氮去除的抑制作用非常明顯。對(duì)厭氧氨氧化的增殖速率,目前還沒有統(tǒng)一的看法。Graaf等(1996)首先報(bào)道倍增時(shí)間為30d;Strous等(1998)被糾正為11d;Dapena-Mora等(2004)估計(jì)厭氧氨氧化菌在氣提式反應(yīng)器和SBR反應(yīng)的倍增時(shí)間分別為19和15d;Isaka等(2006)報(bào)導(dǎo)在厭氧生物過(guò)濾反應(yīng)器中富集了14和21d后,厭氧氨氧化菌的密度分別為1.1×106和1.7×107個(gè)·ml-1,倍增