馬鈴薯田早死病病原菌的分離與鑒定

馬鈴薯田早死病病原菌的分離與鑒定

作為重要的食品、蔬菜、飼料和輕化劑原料，馬蹄在中國(guó)有著很大的種植面積。甘肅省年種植馬鈴薯面積達(dá)65萬hm2,約占全國(guó)的1/9,居全國(guó)第3位;定西市年種植馬鈴薯近23.3萬hm2,占甘肅省種植面積的1/3。由于馬鈴薯具有產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)效益顯著等特點(diǎn),定西市從1997年實(shí)施“洋芋工程”以來,種植面積一度猛增,進(jìn)入2000年以來,種植面積穩(wěn)定在23.3萬hm2左右,迎、重茬現(xiàn)象非常普遍,導(dǎo)致目前病害發(fā)生種類多,發(fā)病重。2009-2010年在全市各縣區(qū)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)一種新的病害,造成馬鈴薯在田間早死,對(duì)馬鈴薯的產(chǎn)量造成較大損失。為了提供科學(xué)的防治依據(jù),對(duì)早死病株進(jìn)行了病原真菌的分離與鑒定。鑒定結(jié)果顯示,該病由球炭疽菌(Colletotrichumcoccodes)引起。2007年劉會(huì)梅等對(duì)馬鈴薯炭疽病研究進(jìn)展進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道;2011年張建成等在寧波進(jìn)境船舶攜帶薯塊上分離并鑒定了該病原菌;同年王麗麗等將該病報(bào)道為新疆烏昌地區(qū)5種新紀(jì)錄之一。1材料和方法1.1樣本的來源和癥狀描述標(biāo)本來源于甘肅省定西市安定區(qū)團(tuán)結(jié)鎮(zhèn)上楊家川村一‘克新1號(hào)’地膜馬鈴薯田早死病株。通過田間自然感病和人工接種發(fā)病植株進(jìn)行癥狀描述。1.2馬鈴薯生長(zhǎng)與土壤的制備選取馬鈴薯地下莖稈有黑色菌核的病健結(jié)合部,切取0.5cm小塊,表面用75%乙醇消毒3min,無菌水沖洗3次,置于PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng),待長(zhǎng)出菌絲后,挑取菌落邊緣進(jìn)行純化,純化后的菌落通過單孢分離培養(yǎng)。按每1kg滅菌土壤接18g含有大量黑色菌核的培養(yǎng)基,混勻、裝入直徑15cm的花盆中,未混合菌種的滅菌土壤作對(duì)照。將馬鈴薯‘克新1號(hào)’每盆種植一株,并作詳細(xì)記載。依據(jù)柯赫氏法則確定病原菌。1.3社會(huì)學(xué)的評(píng)價(jià)觀察病原菌在PDA平板上的菌落特征、產(chǎn)孢情況,并對(duì)分生孢子盤、剛毛、分生孢子長(zhǎng)寬進(jìn)行顯微測(cè)量。1.4生物鑒定病原菌的分子生物學(xué)鑒定委托上海基康生物技術(shù)有限公司完成。1.4.1提取的dna病原菌DNA提取采用易潤(rùn)華等的方法。1.4.2pcr產(chǎn)物的純化采用真菌核糖體基因ITS區(qū)域引物D1(GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG)和D2(GGTCCGTGTTTCAAGACGG)擴(kuò)增ITSrDNA。反應(yīng)在20μL體系中進(jìn)行,體系含有2×SuperTaqMix10μL,primerF1μL,primerR1μL,DNA模板1μL,ddH2O7μL。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性2min,進(jìn)入循環(huán),94℃變性20s,50℃退火10s,72℃復(fù)性30s,35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸2min,4℃保存。取5μL反應(yīng)產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,在紫外投射儀下檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小,DNAMarkerDL2000。用北京博大泰克生物工程有限公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒;擴(kuò)增產(chǎn)物上樣ABI3730DNA測(cè)序儀檢測(cè),采用雙脫氧測(cè)序法,測(cè)序引物為D1/D2,進(jìn)行雙向測(cè)序。1.4.3同源序列搜索使用BioEdit校對(duì)測(cè)序結(jié)果并拼接序列。測(cè)序后的序列經(jīng)校正后,在核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank(http://blast.ncbi.nlm.nihgov/)中進(jìn)行同源序列搜索,比較測(cè)試菌株與數(shù)據(jù)庫(kù)中相應(yīng)序列的相似程度。2結(jié)果與分析2.1地表下主莖組菌核數(shù)量根、地下莖和匍匐莖都產(chǎn)生大量黑色菌核、大小0.5mm,尤其地表下主莖基部空腔內(nèi)菌核數(shù)量最多。田間越冬病株殘?bào)w皮層組織脫落,呈現(xiàn)“纖維狀”,表皮生大量菌核。2.2疾病的測(cè)量接菌植株地表以下主莖表現(xiàn)出與自然病株相同的癥狀,未接菌植株表現(xiàn)正常。從回接發(fā)病馬鈴薯植株上100%分離得到原接種病菌。2.3濃度lm法病菌在PDA培養(yǎng)基上菌絲乳白色表生,產(chǎn)生大量菌核,呈同心環(huán)狀排列。分生孢子盤聚生于菌核上,黑褐色,直徑220～320μm,剛毛聚生或散生于分生孢子盤中,褐色至暗褐色,剛硬,至上端漸細(xì),(50.9～174.6)μm×(2.4～4.8)μm,平均100.3μm×4.2μm,有1～3個(gè)隔膜。分生孢子直或紡錘形、上尖下圓、無色,單胞、有的中腰縊束,(15.07～24.66)μm×(2.58～4.45)μm,平均20.32μm×3.63μm。2.4p左右條帶使用真菌ITS區(qū)域的引物D1和D2擴(kuò)增出了600bp左右的條帶(見圖2)。將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序所得序列與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行Blast分析,該序列與已報(bào)道的C.coccodes序列同源性最高,相似性達(dá)97%。3馬鈴薯炭疽病馬鈴薯炭疽病是馬鈴薯生產(chǎn)上的一種毀滅性病害,可以侵染馬鈴薯的各個(gè)生長(zhǎng)部位,尤其對(duì)生長(zhǎng)期地下主莖危害嚴(yán)重,引起馬鈴薯早死。根據(jù)2010年生長(zhǎng)期調(diào)查,定西市安定區(qū)團(tuán)結(jié)鎮(zhèn)地膜馬鈴薯‘克新1號(hào)’植株7月中旬開始發(fā)病,7月底全部枯死,比正常植株提前枯死2個(gè)多月,經(jīng)測(cè)產(chǎn)減產(chǎn)28%,對(duì)產(chǎn)量影響十分嚴(yán)重。這與Tsror等研究表明能夠減產(chǎn)22%～30%相符合。該病是由球炭疽菌引起的,在田間土壤中可以自由存活長(zhǎng)達(dá)13年,同時(shí)可以侵染葫蘆科、茄科、胡椒科等13個(gè)科的35種寄主,尤其喜歡馬鈴薯、番茄、胡椒等。馬鈴薯炭疽病分布于50多個(gè)國(guó)家。在我國(guó)吉林、山東、浙江、新疆已有報(bào)道。該病一旦擴(kuò)散傳播,對(duì)我省馬鈴薯產(chǎn)業(yè)將會(huì)造成不可估計(jì)的損失。NadavNitzan等研究表明通過接菌此病可以侵染多種作物和雜草,國(guó)外主要采用輪作栽