不同離子強(qiáng)度下豬肉肌原纖維蛋白乳化特性研究

不同離子強(qiáng)度下豬肉肌原纖維蛋白乳化特性研究

肉的加工特征主要包括溶解、凝膠、乳化、保水等。乳化是最重要的加工特征之一。肌肉原纖維蛋白質(zhì)是乳化的主要材料。它在形成小纖維素和小油滴離面蛋白膜方面發(fā)揮著重要作用，直接影響著小型果肉的結(jié)構(gòu)、粘度、油容量和最終產(chǎn)品的質(zhì)量。肌原纖維蛋白屬于鹽溶性蛋白質(zhì),當(dāng)pH值升高遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí),提高介質(zhì)的離子強(qiáng)度,則可以提高其溶解度,而蛋白質(zhì)的溶解度與其保水性、乳化性及凝膠性等加工特性有密切關(guān)系。食鹽是肉類加工必不可少的輔料,能有效提高離子強(qiáng)度,從而提高肌原纖維蛋白溶解度,利于肌原纖維蛋白的提取。此外有報(bào)道稱:NaCl可降低肌原纖維蛋白的等電點(diǎn),使其在通常的pH值范圍內(nèi)帶有更多的凈電荷,增強(qiáng)肌原纖維蛋白的溶解性,從而改善其加工特性。Zorba等研究了2.5%、3.0%的食鹽添加量對(duì)豬肉乳化能力的影響,發(fā)現(xiàn)添加3.0%鹽比添加2.5%鹽使豬肉具有更高的乳化能力;Yapar等研究了不同的食鹽添加量對(duì)鯉魚肉乳化能力的影響,發(fā)現(xiàn)乳化能力隨著食鹽添加量的增加(分別為0.0%、1.0%、2.0%)而增加,但并不顯著。綜上,食鹽會(huì)直接影響肌原纖維蛋白的理化特性和加工特性,但過高的用量會(huì)導(dǎo)致高食鹽的攝入,影響人類健康,過低的用量又會(huì)減弱肉蛋白的加工特性,導(dǎo)致肉制品品質(zhì)的劣變。蛋白質(zhì)分子間的相互作用力對(duì)乳化性也有明顯的影響。目前NaCl對(duì)肌肉蛋白質(zhì)加工特性影響的研究較多,但對(duì)其機(jī)制研究較少。由于人們?nèi)找嬉庾R(shí)到動(dòng)物脂肪對(duì)健康的不利影響,而植物油含有高比例的多不飽和脂肪酸且不含膽固醇,因此植物油替代動(dòng)物脂肪已成趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)用大豆油替代豬背膘、用NaCl濃度改變介質(zhì)的離子強(qiáng)度,研究離子強(qiáng)度對(duì)豬肉肌原纖維蛋白乳化特性包括乳化能力(emulsifyingcapacity,EC)、乳化穩(wěn)定性(emulsifyingstability,ES)的影響,同時(shí)測(cè)定不同離子強(qiáng)度下肌原纖維蛋白的理化特性,包括蛋白質(zhì)的溶解度、分子間氫鍵、表面疏水性、活性巰基和總巰基等,并對(duì)理化特性、乳化特性指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,研究離子強(qiáng)度造成乳化性質(zhì)差異的原因,以期為乳化型肉制品的生產(chǎn)優(yōu)化配方、在保證肉制品質(zhì)構(gòu)、感官特性的同時(shí),減少NaCl用量,為低鹽乳化型肉制品的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1微生物樣品的制備宰后24h(pH5.6~5.8)的豬肉背最長(zhǎng)肌,購(gòu)于南京苜蓿園大街菜市場(chǎng)。剔除多余脂肪和結(jié)締組織,切碎,真空包裝,貯存于-20℃?zhèn)溆谩Ｊ褂们皹悠吩?~4℃解凍。金龍魚大豆油購(gòu)于超市。1.2儀器、標(biāo)準(zhǔn)和體制T25數(shù)顯型高速勻漿機(jī)德國(guó)IKA公司;SensoDirectCon200型電導(dǎo)率儀德國(guó)TintometerGmbH公司;DV-IPrime型黏度計(jì)、AvantiJ-E型多用途高效離心機(jī)美國(guó)BeckmanCoulter公司;YZ2515x型蠕動(dòng)泵河北保定蘭格恒流泵有限公司。1.3方法1.3.1肌原纖維蛋白的純化參考韓敏義等的方法提取豬肉肌原纖維蛋白。100g切碎瘦肉解凍12h,加入4倍體積的僵直提取緩沖液(100mmol/LTris,10mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA),pH8.3),勻漿,1000×g離心20min,把沉淀分散在4倍體積的標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液(standardsaltsolution,SSS,100mmol/LKCl、20mmol/LK2HPO4/KH2PO4、2mmol/LMgCl2、1mmol/L乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸、1mmol/LNaN3,pH7.0),1000×g離心10min收集沉淀,重復(fù)3次。沉淀重新分散在4倍體積的含1%TritonX-100的SSS中,再1500×g離心10min收集沉淀,重復(fù)兩次。在沉淀中加入4倍體積0.1mol/LKCl,重復(fù)兩次后,在沉淀中加入4倍體積0.1mol/LNaCl溶液經(jīng)1500×g離心10min收集沉淀,得到純化的肌原纖維蛋白。蛋白質(zhì)濃度用雙縮脲法測(cè)定,用牛血清白蛋白作用為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,提取的肌原纖維蛋白在48h內(nèi)用完。稱取一定質(zhì)量的粗蛋白,分別溶于NaCl濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mol/L的磷酸鹽緩沖液中(50mmol/LNa2HPO4/NaH2PO4,pH6.5),根據(jù)需要配制成不同濃度的肌原纖維蛋白溶液,于冷庫(kù)(4℃左右)中保存,待用。1.3.2肌原纖維蛋白凝膠溶解度測(cè)定根據(jù)雙縮脲法,取7mL5mg/mL不同NaCl濃度的肌原纖維蛋白溶液,1500×g離心10min后,取上清液以及不同NaCl濃度的肌原纖維蛋白原液各2mL,分別加入8mL雙縮脲試劑混勻,同時(shí)取不同NaCl濃度的磷酸鹽緩沖液(50mmol/LNa2HPO4/NaH2PO4,pH6.5)2mL與8mL雙縮脲試劑混勻后作空白對(duì)照,置于20~25℃水浴鍋內(nèi)保溫30min,于可見分光光度計(jì)540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,每個(gè)處理測(cè)定3個(gè)重復(fù),按公式(1)計(jì)算溶解度。1.3.3血脂含量的測(cè)定氫鍵含量的測(cè)定參照Visessanguan等方法,并略加改進(jìn)。具體操作步驟:取3mL5mg/mL不同NaCl濃度的肌原纖維蛋白樣液,分別加入0.5mL的S1溶液(20mmolTris,1%十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate,SDS),pH8.0)和S2溶液(0.5mol/LNaOH),室溫振蕩均勻放置1h,12100×g離心30min,取0.6mL上清液加入50%三氯乙酸(trichloroaceticacid,TCA)溶液,使上清液的最終TCA濃度達(dá)到10%,樣品在4℃冷庫(kù)中放置15min后2500×g離心20min,沉淀用S2溶液溶解,蛋白質(zhì)含量采用雙縮脲法測(cè)定,氫鍵含量以S1溶解的蛋白含量占S2溶解的蛋白質(zhì)含量的百分比表示,用相應(yīng)的磷酸緩沖液做空白對(duì)照。1.3.4光密度值的測(cè)定表面疏水性的測(cè)定采用Chelh等方法,并略加修改。取1mL5mg/mL不同NaCl濃度的蛋白樣液,加入60μL1mg/mL的溴酚藍(lán)溶液,渦旋振蕩混勻10min,用相應(yīng)的磷酸緩沖液做空白對(duì)照,離心15min后在595nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值。表面疏水基含量按公式(2)計(jì)算。式中:OD1為空白樣品的光密度值;OD2為樣品的光密度值。1.3.5活性基含量的測(cè)定參照Ellman的方法,并略加改進(jìn)?？値€基含量測(cè)定:取1.5mL5mg/mL不同NaCl濃度的蛋白樣液懸浮于10.0mL的Tris-甘氨酸緩沖液(0.086mol/LTris,0.09mol/L甘氨酸,4mmol/LEDTA,8mol/L尿素,pH8.0);活性巰基含量測(cè)定:取1.5mL5mg/mL不同NaCl濃度的蛋白樣液懸浮于10.0mL的Tris-甘氨酸緩沖液(0.086mol/LTris,0.09mol/L甘氨酸,4mmol/LEDTA,pH8.0);將以上處理樣品分別加50μLEllman試劑(4mg5,5’-二硫基雙-2-硝基苯甲酸(5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoicacid),DTNB)溶解于1mL的Tris-甘氨酸緩沖液中),劇烈振蕩后在(25±1)℃條件下水浴1h,12000×g離心10min,同時(shí)以不加DTNB的為對(duì)照,取上清液在412nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,按公式(3)計(jì)算總巰基、活性巰基含量。式中:73.53=106/1.36×104,1.36×104為摩爾消光系數(shù)/(L·cm/mol),ρ為樣品的蛋白質(zhì)量濃度/(mg/mL)。1.3.6乳化體系電導(dǎo)率的測(cè)定按照Linder等電導(dǎo)率法測(cè)定EC。取30mL5mg/mL的不同肌原纖維蛋白溶液,加入10mL的大豆油8000×g勻漿1min,用蠕動(dòng)泵以12mL/min的速率加入大豆油,同時(shí)勻漿,用電導(dǎo)率儀跟蹤乳化體系電導(dǎo)率的變化,直至電導(dǎo)率出現(xiàn)第二突變點(diǎn)時(shí)停止加油,以此時(shí)的油量計(jì)算EC。1.3.7乳狀液的配制乳化穩(wěn)定性參考Cameron等的濁度法,稍加改動(dòng)。取5mg/mL蛋白樣液28mL,加入7mL大豆油,8000×g勻漿制成乳狀液。迅速?gòu)男轮频娜闋钜旱撞恳迫?0μL,用0.1%的SDS溶液稀釋500倍,以0.1%的SDS溶液為空白,立即測(cè)定其在500nm波長(zhǎng)處的吸光度A0,將乳狀液靜置5min后,用相同的方法測(cè)定吸光度A5。乳化穩(wěn)定性按公式(4)計(jì)算。式中:ES為乳化穩(wěn)定性;?A=A0-A5,表示乳狀液初始的吸光度與靜置5min后的吸光度差。1.4小鼠肌原纖維蛋白乳化能力的變化對(duì)采集的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)性分析和方差分析。方差分析結(jié)果為±s,如果方差分析差異顯著(P<0.05),則使用Duncan’sMultipleRangeTest進(jìn)行多重比較。由圖1可知,隨著NaCl濃度的增加,乳化能力呈逐漸上升的趨勢(shì)。0.1、0.2mol/LNaCl實(shí)驗(yàn)組,其肌原纖維蛋白的EC值在660mL/g左右,兩者之間差異不顯著(P>0.05),說明離子強(qiáng)度雖有上升,但仍然很低,此時(shí)鹽離子濃度的增加并不能夠改善肌原纖維蛋白的乳化能力;0.3mol/LNaCl實(shí)驗(yàn)組EC值為882mL/g,顯著高于0.1、0.2mol/LNaCl實(shí)驗(yàn)組(P<0.05),而0.4、0.5、0.6mol/LNaCl實(shí)驗(yàn)組的肌原纖維蛋白的EC值都在950mL/g以上,且三者之間無顯著差異(P>0.05),但顯著高于0.1、0.2、0.3mol/LNaCl實(shí)驗(yàn)組,0.6mol/LNaCl實(shí)驗(yàn)組EC達(dá)到最大值,說明在此NaCl濃度下肌原纖維蛋白能乳化的油量最多。2.1.2兩地?zé)o顯著差異p>0.05由圖2可知,隨著NaCl濃度的增加,肌原纖維蛋白的乳化穩(wěn)定性逐漸增大。濃度為0.1、0.2mol/LNaCl實(shí)驗(yàn)組的ES值最差,兩者之間無顯著差異(P>0.05);0.3mol/LNaCl實(shí)驗(yàn)組顯著高于0.1、0.2mol/LNaCl實(shí)驗(yàn)組;0.4、0.5mol/LNaCl實(shí)驗(yàn)組之間差異不顯著(P>0.05),但顯著高于0.1、0.2、0.3mol/LNaCl實(shí)驗(yàn)組(P<0.05);當(dāng)NaCl濃度到達(dá)0.6mol/L時(shí),肌原纖維蛋白乳化穩(wěn)定性顯著高于其他任何實(shí)驗(yàn)組,達(dá)到最大。2.2離子強(qiáng)度對(duì)豬肌肉原纖維素理化特性的影響2.2.1肌原纖維蛋白溶解度由圖3可知,肌原纖維蛋白溶解度隨著NaCl濃度的上升而呈增大趨勢(shì)。NaCl濃度為0.1、0.2mol/L時(shí),肌原纖維蛋白溶解度最差,兩者之間雖有差異但不顯著(P>0.05),均顯著低于0.3、0.4、0.5、0.6mol/L實(shí)驗(yàn)組(P<0.05),以0.6mol/L實(shí)驗(yàn)組的肌原纖維蛋白溶解度為最大。2.2.2離子強(qiáng)度對(duì)豬肌肉原纖維素相互作用力的影響2.2.2.加在加的趨勢(shì)自由圖4可知,不同NaCl濃度條件下,肌原纖維蛋白的氫鍵含量大體呈先減少后緩慢增加的趨勢(shì)。0.1、0.2mol/L實(shí)驗(yàn)組間以及0.4、0.5、0.6mol/L實(shí)驗(yàn)組間肌原纖維蛋白分子間的氫鍵含量雖有差異,但不顯著(P>0.05),而0.2~0.4mol/L實(shí)驗(yàn)組間氫鍵含量呈上升態(tài)勢(shì),且有顯著差異(P<0.05)。2.2.2.肌原纖維蛋白表面疏水基含量的變化由圖5可知,隨著NaCl濃度的增大,肌原纖維蛋白的表面疏水基含量逐漸減小,0.1、0.2mol/L實(shí)驗(yàn)組間以及0.4~0.6mol/L實(shí)驗(yàn)組間肌原纖維蛋白之間的表面疏水基含量雖有差異,但不顯著(P>0.05),0.2~0.4mol/L實(shí)驗(yàn)組間則呈下降態(tài)勢(shì),且有顯著差異(P<0.05)。2.2.2.離子強(qiáng)度對(duì)活性基的影響由圖6可知,蛋白質(zhì)分子的活性巰基含量隨著NaCl濃度的增大呈逐漸上升趨勢(shì),但當(dāng)NaCl濃度增大到一定程度,活性巰基含量的變化不是特別明顯,0.5、0.6mol/L實(shí)驗(yàn)組之間差異不顯著(P>0.05),而總巰基含量隨離子強(qiáng)度的增加沒有明顯變化,說明離子強(qiáng)度的改變對(duì)總巰基沒有產(chǎn)生影響。2.3肌原纖維蛋白溶解度、活性基、氫鍵含量、表面疏水性與ec、es的關(guān)系由表1可知,NaCl濃度與測(cè)定的各指標(biāo)間即EC、ES值、氫鍵均呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與溶解度、活性巰基含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與表面疏水性呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。溶解度與EC值顯著正相關(guān)(P<0.05),與ES值呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),說明隨著肌原纖維蛋白溶解度的增大,肌原纖維蛋白的EC、ES值提高;活性巰基和氫鍵含量都與EC值呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),而表面疏水性與EC值呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),與ES值顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),說明肌原纖維蛋白的活性巰基和氫鍵越多,表面疏水性越小,肌原纖維蛋白的EC值以及ES值越大。由此可見,改變肌原纖維蛋白介質(zhì)的離子強(qiáng)度,導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度及蛋白質(zhì)分子間的作用力產(chǎn)生變化,對(duì)肌原纖維蛋白的乳化特性有顯著或極顯著的影響。3nacl對(duì)肌原纖維蛋白溶解度、ec和蛋白疏水層結(jié)構(gòu)的影響蛋白質(zhì)的乳化主要表現(xiàn)為在油滴周圍形成界面蛋白膜,其形成過程包括3個(gè)步驟:第一步,蛋白向脂肪球表面靠攏,影響這一步的因素主要是蛋白分子的溶解情況、分子大小、溫度條件以及連續(xù)相的黏度情況。第二步,蛋白吸附在脂肪球上,一般蛋白需要克服界面張力等障礙,和已經(jīng)吸附在脂肪球上的物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)并使自己吸附上去,這個(gè)過程受表面氨基酸性質(zhì)、pH值、離子強(qiáng)度和溫度的影響。第三步,蛋白分子必須經(jīng)過構(gòu)象的變化。乳化能力和乳化穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)乳化特性的常用指標(biāo)。乳化能力表示單位質(zhì)量的肌原纖維蛋白能夠乳化的油的體積,EC值越大,說明對(duì)應(yīng)NaCl濃度的肌原纖維蛋白在單位質(zhì)量?jī)?nèi)乳化的油量就越多;而乳化穩(wěn)定性是指蛋白質(zhì)維持乳濁液油水兩相混合不分離時(shí)對(duì)外界條件的抗應(yīng)變能力,是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)維持乳化體系油水界面能力的重要指標(biāo);蛋白質(zhì)的溶解度是蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與溶劑之間的相互作用平衡的一種熱力學(xué)表現(xiàn)形式。當(dāng)介質(zhì)的離子強(qiáng)度達(dá)到一定程度時(shí),肌原纖維蛋白才會(huì)溶解,而可溶性蛋白質(zhì)對(duì)脂肪乳化具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著介質(zhì)離子強(qiáng)度的提高,肌原纖維蛋白的EC和ES值增強(qiáng),這是因?yàn)殡S著離子強(qiáng)度的增大,鹽和蛋白質(zhì)的相互作用增強(qiáng),蛋白質(zhì)的水化作用增大,溶解度大大上升,使得蛋白更容易向脂肪球表面靠攏,相關(guān)性分析結(jié)果也證實(shí)了這點(diǎn)。相關(guān)性分析表明,溶解度與離子強(qiáng)度極顯著正相關(guān)(r=0.948,P<0.01),與EC值顯著正相關(guān)(r=0.818,P<0.05),與ES值呈極顯著正相關(guān)(r=0.974,P<0.01)。說明肌原纖維蛋白溶解度的增大,使得蛋白質(zhì)能迅速移到油水界面形成界面膜參與乳化,進(jìn)而提高EC值;反之當(dāng)NaCl濃度較低時(shí),肌原纖維蛋白的溶解度低,形成蛋白質(zhì)聚合體,造成疏水鏈的封閉,導(dǎo)致EC值的下降;對(duì)ES值而言,低離子強(qiáng)度時(shí),可移動(dòng)離子的屏蔽作用降低蛋白質(zhì)之間的靜電排斥,高鹽時(shí)增強(qiáng)了帶靜負(fù)電荷的肌球蛋白分子間的靜電排斥作用,使得乳滴之間不易聚集和合并,因而ES隨著離子強(qiáng)度的提高而呈增強(qiáng)趨勢(shì)。離子強(qiáng)度對(duì)肌原纖維蛋白的空間結(jié)構(gòu)也有顯著的影響。肌肉蛋白質(zhì)中參與乳化的蛋白質(zhì)主要為肌球蛋白,其分子尾部的α-螺旋結(jié)構(gòu)是依靠多肽鏈中—CO與—NH之間的氫鍵穩(wěn)定的,氫鍵的穩(wěn)定性一旦發(fā)生變化,就會(huì)導(dǎo)致α-螺旋結(jié)構(gòu)的丟失和破壞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著NaCl濃度的提升,肌原纖維蛋白氫鍵有上升趨勢(shì),說明隨著離子強(qiáng)度的上升,肌球蛋白/肌原纖維蛋白的穩(wěn)定性越好,該結(jié)果與文獻(xiàn)結(jié)果一致。相關(guān)性分析表明,氫鍵與離子強(qiáng)度顯著正相關(guān)(r=0.901,P<0.05),與肌原纖維蛋白的EC值極顯著正相關(guān)(r=0.969,P<0.01);蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)間的相互作用是一種非共價(jià)鍵的相互作用,是維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)最重要的作用力,構(gòu)成蛋白質(zhì)的大多數(shù)非極性氨基酸的側(cè)鏈分布在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部,形成疏水內(nèi)核,通過對(duì)一些已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)表面性質(zhì)的分析表明,一些疏水基團(tuán)也會(huì)出現(xiàn)在蛋白質(zhì)分子的表面,使其表面也具有一定的疏水作用,而表面疏水作用會(huì)影響蛋白質(zhì)分子間的相互作用,并且因蛋白質(zhì)的大分子結(jié)構(gòu),對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響比整體疏水性更大。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著離子強(qiáng)度的上升,表面疏水性呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)樵诟逳aCl濃度時(shí),蛋白質(zhì)周圍的親水基團(tuán)結(jié)合大量的水分子,使蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)部分包埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部,蛋白質(zhì)在天然狀態(tài)下也是盡量把疏水殘基包埋在分子內(nèi)部,該結(jié)果與文獻(xiàn)[27,31]報(bào)道相一致。相關(guān)性分析表明:表面疏水性與離子強(qiáng)度、溶解度呈極顯著負(fù)相關(guān)(分別是r=-0.925,r=-0.906,P<0.01),與肌原纖維蛋白的EC值也極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.945,P<0.01),與ES值呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.811,P<0.05),Nakai等認(rèn)為用疏水性和溶解度兩指標(biāo)來評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的功能特性比單獨(dú)用溶解度評(píng)價(jià)能得到更好的相關(guān)性,溶解性和表面疏水性都是影響蛋白乳化能力的重要因素,溶解能力相