烏梅白鳳丸對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

烏梅白鳳丸對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

女性進(jìn)入更年期后，由于卵巢機(jī)制的衰退和雌激素水平的降低，導(dǎo)致脂肪和膽固醇的異常代謝，以及動(dòng)脈樣本硬化（as）的形成。我們?cè)缙诘难芯堪l(fā)現(xiàn)烏雞白鳳丸對(duì)脂代謝紊亂有明顯的調(diào)整作用,為進(jìn)一步研究烏雞白鳳丸防治動(dòng)脈粥樣硬化的血管損傷的機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料喂養(yǎng)法建立大鼠早期動(dòng)脈粥樣硬化模型,探討烏雞白鳳丸有效成分對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。1材料和方法1.1乙醇超聲提取法烏雞白鳳丸(9g/丸),藥都制藥集團(tuán)股份有限公司提供,用80%乙醇超聲提取器中提取兩次,每次兩小時(shí),減壓濃縮至2g生藥/ml備用;吉非羅齊,保定市古城藥廠,批號(hào)040625,實(shí)驗(yàn)前用CMC配制濃度為0.016g/ml溶液備用。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料SD大鼠清潔級(jí),體重180～200g,雄性,由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)為SCXK(冀)2003-1-003,動(dòng)物飼料亦由該中心提供。1.3試劑TC、TG、LDL、HDL試劑盒,日本協(xié)和株式會(huì)社提供;Caspase-3兔抗人多克隆抗體,由美國(guó)SantaCruz公司提供。1.4儀器全自動(dòng)生化分析儀(瑞士);Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀,美國(guó)BeckmanCoulter公司。1.5血管內(nèi)皮凋亡及caspase-3活性的檢測(cè)大鼠隨機(jī)分為5組,除正常對(duì)照組外,其余各組采用高脂飼料(2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、10%豬油、0.02%他巴唑、普通飼料87.48%)喂養(yǎng),同時(shí)灌胃烏雞白鳳丸或吉非羅齊混懸液,模型對(duì)照組和正常對(duì)照組給予等容量的自來(lái)水,連續(xù)10周。給藥10周后,各組大鼠禁食12小時(shí),乙醚麻醉,眶后靜脈取血,分離血清,全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定TC、TG、LDL、HDL水平;各組隨機(jī)取6只大鼠,剖取胸主動(dòng)脈約2cm長(zhǎng),剝?nèi)?nèi)膜,70%乙醇固定,制備單細(xì)胞懸液,碘化丙啶染色,同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照,以替代一抗,陽(yáng)性對(duì)照只加一抗或只加二抗,流式細(xì)胞儀檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡及Caspase-3的蛋白表達(dá),數(shù)據(jù)采集為對(duì)數(shù)(log)方式,應(yīng)用Expo32ADC進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞,計(jì)算凋亡率(AP)。AP=凋亡細(xì)胞數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%AΡ=凋亡細(xì)胞數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%用MuticycleAV分析軟件對(duì)DNA細(xì)胞周期擬合分析,計(jì)算出DNA組方圖各時(shí)相分布的百分比,以增殖指數(shù)(PI)表示細(xì)胞的增殖活性:PI=S+G2/MG0/G1+S+G2/M×100%ΡΙ=S+G2/ΜG0/G1+S+G2/Μ×100%2結(jié)果2.1大鼠脂代謝應(yīng)從結(jié)果可見(jiàn),模型對(duì)照組大鼠血清TC、TG、LDL、HDL均較正常對(duì)照組大鼠升高,表明大鼠連續(xù)10周喂養(yǎng)高脂飼料,已造成大鼠脂代謝紊亂。烏雞白鳳丸及陽(yáng)性對(duì)照藥組大鼠血清TC、TG、LDL均較模型組顯著降低,見(jiàn)表1。2.2率、caspase-3的表達(dá)情況Caspase-3蛋白表達(dá)的影響結(jié)果模型對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率、Caspase-3的蛋白表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組,增殖指數(shù)明顯低于正常對(duì)照組;烏雞白鳳丸大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率及Caspase-3蛋白表達(dá)量較模型對(duì)照組大鼠降低,而增殖指數(shù)較模型對(duì)照組大鼠增高,見(jiàn)表2。3細(xì)胞凋亡的形成AS的發(fā)病有明顯的性別差異,育齡期婦女發(fā)生率明顯低于男性,但婦女絕經(jīng)后這一差異逐漸消失,由此推測(cè)絕經(jīng)前婦女體內(nèi)具有某種保護(hù)因素,使其免受AS的侵襲。現(xiàn)今,這種保護(hù)因素被認(rèn)為是雌激素。中西醫(yī)結(jié)合對(duì)腎本質(zhì)的研究表明,腎虛時(shí)有下丘腦-垂體-性腺軸的功能減退,雌激素分泌減少。烏雞白鳳丸具有滋補(bǔ)肝腎,調(diào)補(bǔ)氣血之功,尤重填補(bǔ)腎精,為烏雞白鳳丸防治婦女絕經(jīng)后AS提供了中醫(yī)理論依據(jù)。近幾年發(fā)現(xiàn)細(xì)胞異常凋亡在多種心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展中起重要的作用,特別是在高脂血癥斑塊中發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞都經(jīng)歷著凋亡與壞死,而凋亡占主導(dǎo)地位,參與AS的形成過(guò)程。細(xì)胞凋亡在AS斑塊中明顯加劇,出現(xiàn)大量細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖,組成AS斑塊的病理基礎(chǔ)。大量研究也證實(shí)了人類(lèi)AS斑塊中存在細(xì)胞凋亡。由于凋亡細(xì)胞在體內(nèi)存在時(shí)間極短,低比例的凋亡發(fā)生即意味著大量的細(xì)胞凋亡已經(jīng)發(fā)生。Caspase-3屬于半胱氨酸蛋白酶,相當(dāng)于線蟲(chóng)中的ced-3,在破壞細(xì)胞骨架結(jié)果方面有重要作用,這些蛋白酶是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶,一旦被信號(hào)途徑激活,能將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解,使細(xì)胞不可逆的走向死亡。因此,若能控制該酶的活性對(duì)凋亡的結(jié)局可產(chǎn)生重要影響。本實(shí)驗(yàn)采用高脂食飼法造成大鼠早期動(dòng)脈粥樣硬化模型,我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)模型對(duì)照組大鼠較正常對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率明顯升高,增殖指數(shù)明顯降低,Caspase-3的蛋白表達(dá)也明顯升高;應(yīng)用烏雞白鳳丸后,主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Caspase-3的蛋白表