姜及其炮制品中5種姜辣素成分的測定

姜及其炮制品中5種姜辣素成分的測定

姜（生姜）的羅地亞和姜是姜科姜屬植物。新鮮的根莖是常見的食品香料和中藥生姜的來源，干燥的根莖是常見的干姜來源。生姜在不同炮制加工條件下制成干姜、炮姜和姜炭,收載于2010年版《中國藥典》一部中。生姜經(jīng)炮制后,其成分發(fā)生不同程度變化,可導(dǎo)致藥性及功能主治的改變,生姜辛溫,主散,擅長解表散寒,和中止嘔;經(jīng)曬干即得干姜,其性味辛而大熱,主守,長于溫中回陽;干姜經(jīng)炒黃后得炮姜,其辛辣刺激性降低,溫性增強,長于溫中散寒;干姜經(jīng)炒炭后得姜炭,不具有辛味,長于止血。生姜中主要含有的化學(xué)成分是姜酚,主要包括6-,8-,10-,12-姜酚等10余種,其中6-姜酚含量最高,約占75%。姜烯酚在生姜中含量較少,主要存在于干姜中,包括6-,8-,10-姜烯酚。姜酮則在炮姜、姜炭中才出現(xiàn),且含量較低,但現(xiàn)代藥理研究表明,它具有顯著的抗氧化、改善脂質(zhì)代謝、抗病原微生物、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、解熱等作用,在保護心血管系統(tǒng)和預(yù)防肝損傷方面有良好的應(yīng)用前景。王維皓等利用HPLC特征圖譜分析了姜在炮制過程中的化學(xué)成分變化,并揭示了姜的炮制原理,指認了6-姜酚、6-姜烯酚、姜酮3個色譜峰,但未對其主要成分進行定量分析。對于姜及其炮制品中主要化學(xué)成分的含量測定方法已經(jīng)有較多報道,主要有氣質(zhì)聯(lián)用(GS-MS)測定揮發(fā)油成分;高效液相色譜法(HPLC),液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS),薄層掃描法以及毛細管電泳法(CE)等用于測定或鑒定姜中的化學(xué)成分。但至今為止,未見用高效液相色譜法同時測定姜及其炮制品中的6-,8-,10-姜酚,6-姜烯酚,姜酮5種化合物的含量。為此,本實驗采用高效液相色譜法同時測定了姜及炮制品干姜、炮姜、姜炭中6-,8-,10-姜酚,6-姜烯酚,姜酮這5種姜辣素類化合物的含量,并從化學(xué)成分分析角度闡述了姜在炮制過程中化學(xué)成分的量的變化,同時為姜及其炮制品的質(zhì)量標準提供評價方法。1藥材、藥品與試劑Agilent1100型高效液相色譜儀,HP1100型二極管陣列檢測器,AgilentChemStation色譜工作站(Agilent科技有限公司);AG285電子天平(瑞士MettlerToledo公司);KQ-2200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。生姜藥材購自南京市農(nóng)貿(mào)市場,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉訓(xùn)紅教授鑒定為姜科姜屬植物姜的新鮮根莖,按《中國藥典》2010年版的方法,制備干姜、炮姜、姜炭;姜酮(批號122-48-5)、6-姜酚(批號1221-101017)、8-姜酚(批號23513-08-8)、6-姜烯酚(批號MUST-10090801)、10-姜酚(批號23513-15-7)對照品(中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心)。甲醇和乙腈均為色譜純,水為雙蒸水,其余試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1混合對照品溶液分別取姜酮,6-姜酚,8-姜酚,6-姜烯酚,10-姜酚0.5,5,1,1,1.5mg置于25mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,混勻,即得每1mL含姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚分別為0.02,0.2,0.04,0.04,0.06mg的混合對照品溶液。2.2供試品溶液制備分別取生姜碎末5g,干姜、炮姜、姜炭中粉0.5g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25mL,密塞,稱定重量,超聲(100W,40kHz)30min,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,過濾,取續(xù)濾液,以0.45μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液作為供試品溶液。2.3色譜條件及色譜圖色譜柱:KromasilC18柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相:乙腈(B)-0.1%醋酸水溶液(A),梯度洗脫(0~10min,B:40%;10~40min,B:40%→90%;40~45min,B:90%→100%;45~50min,B:100%→40%);流速1.0mL·min-1,檢測波長275nm,柱溫30℃,進樣量為10μL。在上述色譜條件下,各相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.5,理論塔板數(shù)均大于4000,滿足定量要求。炮姜對照品、供試品典型色譜圖見圖1。2.4標準曲線的繪制精密吸取混合對照品溶液適量分別稀釋0、2、4、8、16、32倍,精密吸取上述6種濃度的對照品溶液各10μL,注入高效液相色譜儀,測定姜酮,6-姜酚,8-姜酚,6-姜烯酚,10-姜酚峰峰面積積分值,分別以對照品質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標,其峰面積積分值為縱坐標,繪制標準曲線。結(jié)果顯示,5個成分線性關(guān)系良好(r>0.9990),回歸方程、相關(guān)系數(shù)和譜峰參數(shù)見表1。2.5進樣中各組分rsd的測定取一定濃度的混合對照品溶液,按“2.1”色譜條件,連續(xù)進樣6次,分別記錄5種組分的峰面積,計算得姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚的RSD分別為1.48%,0.30%,0.28%,0.29%,0.25%。2.6各組分含量精密稱取炮姜粉末6份,每份1.0g,按照“2.3”項下方法操作,制備所需供試品溶液,測定姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚的含量。結(jié)果各組分含量平均值分別為0.0085%,0.7642%,0.1435%,0.1506%,0.2266%;RSD分別為4.28%,3.50%,3.41%,3.85%,3.70%。2.7進樣及峰面積的測定取同一供試品溶液,分別于配制后0,12,24,36,48h進樣,記錄峰面積,結(jié)果姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚和10-姜酚峰面積的RSD分別為2.50%,3.20%,2.70%,3.82%,4.72%。表明樣品在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.8加樣回收率試驗取含姜酮0.10%,6-姜酚7.91%,8-姜酚1.45%,6-姜烯酚1.51%和10-姜酚2.27%的炮姜樣品0.25g,平行6份,精密稱定,分別精密加入各對照品適量(與0.25g樣品中各待測成分的量相當(dāng)),按照“2.3”項下方法制備供試溶液,進樣測定,計算回收率。結(jié)果姜酮,6-姜酚,8-姜酚,6-姜烯酚,10-姜酚的平均回收率(n=6)分別為101.5%,100.9%,104.7%,102.1%,105.5%;RSD分別為1.26%,1.60%,3.35%,2.98%,3.05%。2.9供試品溶液的制備分別取生姜、干姜、炮姜和姜炭4種樣品,按照“2.3”項下的方法制備供試品溶液。精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各10μL,注入高效液相色譜儀,照“2.1”色譜條件分別測定,分別計算4種樣品中各個組分的含量,結(jié)果見表2。3討論3.1提取效率和組分含量本實驗采用單因素循環(huán)的方法,分別考察了提取溶劑[水、水-甲醇(50∶50)、甲醇、乙醇、己烷]和提取時間(15、30、45、60min),利用高效液相色譜法進樣分析,以5種組分的含量進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn),采用甲醇,超聲提取30min效果最好。3.2檢測波長的確定紫外光譜圖顯示5種組分皆在275nm附近有最大吸收,且在275nm峰形較好,出峰數(shù)量較多,分離度和理論塔板皆能達到定量要求。因此,檢測波長定為275nm,實現(xiàn)了5組分含量的同時測定,獲得了滿意的結(jié)果。在建立HPLC方法時,對流動相的選擇和優(yōu)化進行了系統(tǒng)考察,最終選擇了本實驗乙腈-0.1%醋酸水溶液的梯度洗脫條件,經(jīng)實驗證實所選的色譜系統(tǒng)適用性好,結(jié)果可靠。3.3姜炭的化學(xué)成分由表2可知,姜酮在加工至炮姜時出現(xiàn),并且含量較少,在姜炭中的含量有所增加;生姜中化學(xué)成分的含量普遍較低,尤其是6-姜烯酚含量甚微,主要是由于生姜中水分含量較多所致;干姜與炮姜相比除了不含有姜酮外,其他化學(xué)成分含量比炮姜略高;而姜炭除了姜酮和6-姜烯酚的含量較高外,其他化合物含量均明顯降低。同時從表2的