重組基因?qū)胧荏w細胞

重組基因?qū)胧荏w細胞用與提取目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒使之出現(xiàn)一個切口，將目的基因插入切口處，讓目的基因的黏性末端與切口上的黏性末端互補配對后，在DNA連接酶的作用下連接形成重組DNA分子。提取質(zhì)粒并用限制酶切割用連接酶將目的基因和質(zhì)粒連接目的基因與載體的連接目的基因與質(zhì)粒的連接返回（一）粘性末端法（二）平端連接平端載體+平端目的基因效率1%（三）人工接頭連接法

目的基因和載體上分別+雙股平端DNA序列（內(nèi)切酶識別、切割序列）

（四）同聚物加尾連接法

無法得到相同粘末端的情況下，先切平粘末端，載體+polyA，目的基因+polyT。

(五)PCR法引入酶切位點的連接二、受體細胞受體細胞=宿主細胞=寄主細胞條件：便于重組DNA分子的導(dǎo)入；能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細胞中；便于重組體的篩選；遺傳性穩(wěn)定高，易于擴大培養(yǎng)或發(fā)酵生長；安全性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染；條件：⑥內(nèi)源蛋白水解酶缺失或含量低，有利于外源基因蛋白表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的積累，或促進外源基因的高效分泌表達。⑦具有較好的翻譯后加工機制，便于真核目的基因的高效表達；⑧在遺傳密碼的應(yīng)用上無明顯偏倚性；⑨在理論研究和生產(chǎn)實踐上有較高的應(yīng)用價值。三、重組DNA向受體細胞的轉(zhuǎn)化（一）重組基因?qū)朐思毎?、Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：重組質(zhì)粒DNA分子通過與膜蛋白結(jié)合進入受體細胞，并在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定維持表達的過程。（感受態(tài)細胞）2、λ噬菌體的轉(zhuǎn)染體外包裝重組DNA分子----感染活力的噬菌體顆粒。返回三、重組DNA向受體細胞的轉(zhuǎn)化（一）重組基因?qū)朐思毎?、電轉(zhuǎn)化法電穿孔法---短暫的高壓電流脈沖，形成納米級微孔（真核也可）。返回三、重組DNA向受體細胞的轉(zhuǎn)化（二）重組基因?qū)胫参锛毎?、重組DNA載體轉(zhuǎn)化法1）根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)（最廣泛、最成功）2）病毒衍生載體轉(zhuǎn)化（實驗室，容量有限）載體轉(zhuǎn)化具體方法（1）葉盤法（植物轉(zhuǎn)基因應(yīng)用最廣泛的方法，農(nóng)桿菌）（2）創(chuàng)傷植株感染法（根瘤土壤農(nóng)桿菌接種傷口部位）返回三、重組DNA向受體細胞的轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化具體方法（3）原生質(zhì)體共培養(yǎng)法（新生原生質(zhì)體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)）（4）懸浮細胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法（愈傷組織-液體震蕩-懸浮細胞系）返回三、重組DNA向受體細胞的轉(zhuǎn)化2、植物細胞外援基因的直接轉(zhuǎn)化法（無需載體）1）電擊法（同轉(zhuǎn)化）2）基因槍法（高速微型子彈射擊法）3）激光微束穿孔法（0.5-0.7μm，可逆性穿孔）4）多聚物介導(dǎo)法（PEG，原生質(zhì)內(nèi)吞）5）花粉管通道法（外源基因涂于授粉的柱頭上）返回三、重組DNA向受體細胞的轉(zhuǎn)化（三）重組基因?qū)雱游锛毎?、轉(zhuǎn)染法1）磷酸鈣轉(zhuǎn)染2）DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染3）聚陽離子-DMSO轉(zhuǎn)染2、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化3、動物病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)法4、微注射技術(shù)法返回重組體的篩選與外源基因的鑒定返回基于載體遺傳標(biāo)記篩選與鑒定基于外源基因特征的篩選基于報告基因的篩選法基于外源基因的表達產(chǎn)物基于核酸分子雜交篩選重組體的篩選與外源基因的鑒定返回基于載體遺傳標(biāo)記篩選與監(jiān)督抗藥性篩選插入效應(yīng)篩選插入失活插入表達篩選法噬菌斑篩選法藍白斑篩選法重組體的篩選與外源基因的鑒定返回基于外源基因特征的篩選凝膠電泳法PCR鑒定法限制性酶切圖譜法DNA序列測定法重組體的篩選與外源基因的鑒定返回基于報告基因的篩選法GUS基因NPTⅡ基因CAT基因NOS基因LUC基因和GFP基因重組體的篩選與外源基因的鑒定返回基于外源基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)凝膠電泳法鑒定重組子免疫檢測法鑒定重組子重組體的篩選與外源基因的鑒定返回基于核酸分子雜交篩選堿性