甘肅祁連山脈山生柳遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析

甘肅祁連山脈山生柳遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析

簡單重復(fù)序列（ssr，簡單重復(fù)序列）由摩爾等人于1991年創(chuàng)立。這是由幾個(gè)堿性基序列組成的序列的重復(fù)序列。每個(gè)單元的長度為1.6m，兩側(cè)有保守的dna序列。SSR具有很多優(yōu)點(diǎn),它具有高度的多態(tài)性,數(shù)量豐富、信息含量高和重復(fù)性好等特點(diǎn),遵循孟德爾的遺傳規(guī)律同時(shí)具有共顯性的模式,而且對DNA的純度要求不高,這就大大減少了工作的復(fù)雜度。并且SSR標(biāo)記覆蓋整個(gè)基因組,呈現(xiàn)多基因特點(diǎn),表現(xiàn)為共顯性遺傳。需要引起注意的是在SSR引物的獲得途徑中,由于目前只建立了DNA文庫和cDNA文庫,因此對于其中大多數(shù)的物種獲取SSR引物是比較困難的,對于一些以往處于初步研究的樹種可以借鑒其近緣種甚至其他物種已開發(fā)的引物,如柑橘屬(Citrus)的不同種以及獼猴桃屬(Actinidia)的不同種的引物開發(fā)。本試驗(yàn)中首先通過楊樹(Populus)引物在柳樹(Salix)上的通用性探究旨在加速楊柳樹種遺傳育種學(xué)的研究進(jìn)程。山生柳(Salixoritrepha)為楊柳科柳屬多年生落葉直立小灌木,為我國特有種,主要分布于海拔3000~3700m的高山山脊、山坡、溝谷林緣,具有生長快,無病蟲害等特點(diǎn),山生柳不僅具有以灌護(hù)草、以灌育草的作用,還能有效控制水土流失、涵養(yǎng)水源、培育土壤,對于生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性有著重要作用。目前國內(nèi)在分子方面對祁連山不同海拔梯度高寒植物的遺傳多樣性分析未見報(bào)道。因此本課題組在已進(jìn)行的研究中,對祁連山脈的山生柳資源進(jìn)行了較多研究,并對分布于祁連山西水生態(tài)站的山生柳進(jìn)行了梯度式考察取樣并作了細(xì)致的群落調(diào)查。本試驗(yàn)試圖通過從楊樹引物中篩選適合山生柳的引物并通過優(yōu)化反應(yīng)條件,建立山生柳SSR標(biāo)記的反應(yīng)體系和條件,分析山生柳的遺傳多樣性,為山生柳的進(jìn)一步研究提供依據(jù),并為保護(hù)和發(fā)展祁連山高寒植被提出科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1蘇集對土壤、植被的影響本研究選擇山生柳分布較為廣泛的祁連山自然保護(hù)區(qū)西水生態(tài)站作為實(shí)驗(yàn)點(diǎn),該區(qū)極端最高氣溫40℃,極端最低氣溫-35℃,年降水量400.8mm,集中在6-9月,空氣相對濕度58%,年蒸發(fā)量3878mm,平均日照時(shí)數(shù)2879.8h,無霜期平均187d。該區(qū)土壤和植被因氣候差異而形成明顯的垂直分布帶,山地森林灰褐土和亞高山灌叢草甸土是森林適宜生長的土壤,山地森林灰褐土分布在海拔2400~3300m地帶,是喬木林的主要分布帶,混雜有山生柳。亞高山灌叢草甸土分布在海拔3300~3900m地帶,是山生柳的主要分布帶。,-20℃下保存。于2009年6月-2010年6月進(jìn)行了研究。1.2pcr擴(kuò)增程序優(yōu)化PCR程序采用優(yōu)化后的山生柳20μL體系,其中含有2.5mmol/LMg2+1μL,0.10mmol/L濃度的dNTPs1.5μL,0.5UTaq酶用量為1μL,20ng/μLDNA模板1μL,0.5μmol/L的上下游引物各2μL,10×TaqBuffer2μL、ddH2O加至20μL。PCR的預(yù)擴(kuò)增程序經(jīng)優(yōu)化后,94℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,54℃(不同引物有不同的退火溫度)退火45s,72℃延伸30s,循環(huán)數(shù)30個(gè),最后再72℃延伸10min,4℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(200V穩(wěn)壓,2h)分離,銀染檢測。1.3電泳掃描分析根據(jù)電泳結(jié)果,本研究用AmershamPharmaciaBiotech公司的ImageScanner電泳掃描分析對凝膠進(jìn)行掃描,根據(jù)共顯性分子標(biāo)記基因型分型的原則,對得到的圖譜進(jìn)行分析。有帶記為1,無帶記為0,采用Popgen32軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,該軟件的優(yōu)點(diǎn)是處理的數(shù)據(jù)量大,適合于等位酶數(shù)據(jù)處理也適合于SSR的數(shù)據(jù)處理,因?yàn)樗芙o出所研究的各群體之間的一些資料,如:多態(tài)位點(diǎn)百分率,群體間的遺傳距離及遺傳一致度等。2結(jié)果和分析2.1引物的組成和多態(tài)性分析通過對PCR擴(kuò)增的各個(gè)引物結(jié)果進(jìn)行直觀比較從而篩選出15條帶型穩(wěn)定,重復(fù)性高的最佳引物。利用這15對引物對山生柳的遺傳多樣性進(jìn)一步分析。15個(gè)引物,共擴(kuò)增出211條條帶,分子量50~2000bp,不同引物擴(kuò)增的多態(tài)性帶紋數(shù)目從8到22不等,形成了帶型豐富、片斷大小及其組合不同的電泳圖譜(圖2和圖3)。其中多態(tài)性條帶有176個(gè),這說明了山生柳具有較高的遺傳多樣性。楊屬引物的多態(tài)性比例達(dá)到76.41%。47對引物中,有43對帶型穩(wěn)定清晰,通用性達(dá)91.1%(圖1),楊樹引物的多態(tài)性比例較好(表2),引物WPMS15的多態(tài)性比率達(dá)到了90%,而引物SHUKl23、SHUKl24、SHUK034的多態(tài)性比率甚至達(dá)到了100%。結(jié)果證明了楊屬植物的引物在山生柳SSR-PCR體系建設(shè)中通用性良好。2.2引物和遺傳分化通過Popgen32計(jì)算得出的結(jié)果顯示各海拔梯度的shannon指數(shù)(I)的多態(tài)性在0.2342~0.5988,平均為0.4192。Nei指數(shù)在0.1460~0.4342(表3),平均為0.2796,2種指標(biāo)都表明山生柳種群具有較高的遺傳多樣性,而且隨著海拔梯度的升高遺傳多樣性呈現(xiàn)升高的趨勢。不同海拔梯度間的Gst和Nm,總的遺傳多樣性Ht=0.2822,種群內(nèi)遺傳多樣性Hs=0.2558,Gst=0.0935,即9.35%的遺傳變異存在在居群間,90.55%的遺傳變異存在居群內(nèi)(表4)。不同引物其遺傳分化系數(shù)所占的比例不同,其中ORPM-030最高,占到25.39%,引物SHUK034最低,為4.64%(表4)。基于種群間遺傳分化系數(shù)計(jì)算的基因流為Nm=4.8487>1,這說明居群間有較高水平的基因流,足以防止遺傳漂變所導(dǎo)致群居間的遺傳分化。圖2和圖3顯示了不同引物在山生柳擴(kuò)增中的多態(tài)性,不同引物形成了8~22的帶型豐富及重復(fù)性好的電泳圖譜。同時(shí)觀察到楊樹引物能很好的顯示物種的遺傳分化情況,可以方便的鑒定物種的遺傳多樣性。2.3海相上系統(tǒng)相關(guān)系9個(gè)海拔梯度具有較高的遺傳一致度平均為0.9437(表5),其中海拔梯度P9和P8相似系數(shù)最高,為0.9997,海拔梯度越高,遺傳多樣性越高,具有較多相同的遺傳物質(zhì)。9個(gè)海拔梯度的遺傳距離平均為0.0296,海拔梯度P8和P9的遺傳距離最小,同樣說明高海拔的山生柳就有較高的遺傳多樣性。2.4聚合成分配算法根據(jù)種群間的遺傳距離,采用類平均法(UPGMA)對9個(gè)種群進(jìn)行聚類繪圖(圖4),大體分為3類群,P2首先和P3相聚,再與P1,P5相聚為一類。P6和P7相聚再與P4聚為第2類群,最后P8與P9聚為第3類群。Mantel檢驗(yàn)結(jié)果表明,遺傳距離與空間地理距離有顯著相關(guān)性。3結(jié)論和討論3.1與兩端保守序列的互補(bǔ)在SSR標(biāo)記中多態(tài)性非常高,信息量豐富,而引物的變異度大,只要開發(fā)出合適的特異引物,檢測分析就變得簡單易行,因而SSR標(biāo)記在遺傳多樣性分析中有很高的應(yīng)用價(jià)值。但SSR標(biāo)記兩端序列保守,所以設(shè)計(jì)的引物必須考慮與兩端保守序列互補(bǔ),這使SSR標(biāo)記的進(jìn)行有一定的困難?，F(xiàn)有的SSR標(biāo)記數(shù)量有限,所以不能標(biāo)記所有的功能基因,為了對某種植物進(jìn)行SSR標(biāo)記,就必須設(shè)立與該植物或相近物種的特定引物。楊樹作為林木中的優(yōu)勢樹種,成為第3個(gè)完成基因組測序的物種,所以其SSR引物應(yīng)充分被利用。本實(shí)驗(yàn)中通過楊柳引物通用性的探究,不僅可以有效彌補(bǔ)柳樹分子標(biāo)記不足的現(xiàn)狀,替代在柳樹中重新開發(fā)標(biāo)記,節(jié)約引物開發(fā)成本,而且豐富其標(biāo)記的數(shù)量。今后可在柳樹SSR實(shí)驗(yàn)上采用楊屬引物,從而節(jié)省時(shí)間和成本。尤其本實(shí)驗(yàn)中引物SHUKl23、SHUKl24、SHUK034的多態(tài)性比率達(dá)到了100%,充分證明了楊柳引物的通用性很好。3.2山生柳聚類分析與遺傳多樣性通過SSR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示山生柳具有較高的遺傳多樣性,多態(tài)性條帶比率在50%以上被認(rèn)為遺傳多樣性是豐富的。表明該物種還未產(chǎn)生自交衰退現(xiàn)象。當(dāng)種群Nm>1時(shí),存在一定的基因漂流,它能足以抵制遺傳漂變導(dǎo)致群居間的遺傳分化。在本試驗(yàn)中,Wright認(rèn)為當(dāng)Nm=4.8487>1,屬于較高水平,說明不同居群間存在一定的基因流動,可以防止由遺傳漂變引起的亞種群之間的遺傳分化,其可能為:1)山生柳具有有性繁殖與無性繁殖的雙重性,北方風(fēng)沙大,花粉與種子可以隨處傳播。2)其種群有著一定的克隆生長,一定年齡的基株(個(gè)體)可形成多個(gè)克隆分株,進(jìn)而構(gòu)成高寒灌叢平。根據(jù)結(jié)果顯示隨著海拔梯度的升高,山生柳的遺傳多樣性有所增大,這可能與一定的氣候,溫度相關(guān)聯(lián)。在群落中,由于生境梯度與物種的生物學(xué)特征的不同,經(jīng)常會出現(xiàn):1)群落中物種交錯(cuò)重疊,呈現(xiàn)極為復(fù)雜的關(guān)系。2)群落中物種相互不發(fā)生交錯(cuò)關(guān)系,呈現(xiàn)明顯的分布界限。3)群落中某一個(gè)或幾個(gè)物種生態(tài)適應(yīng)性較寬一些,但是其他物種(或類型)由于生境梯度的急劇變化,而被嚴(yán)格限制在某種生境中。在聚類圖4中出現(xiàn)了一定情況的交錯(cuò)現(xiàn)象,說明在一定海拔處呈現(xiàn)出明顯的生態(tài)交錯(cuò)區(qū)。保護(hù)現(xiàn)存自然種群以保存盡可能多的遺傳多樣性是適宜的保護(hù)措施,生境適宜促進(jìn)物種進(jìn)化,有利于物種長期生存發(fā)展,從另一方面證明山生柳對高寒氣候的適應(yīng)性很強(qiáng),這也是本試驗(yàn)在不同海拔對山生柳遺傳多樣性進(jìn)行探究的目的所在。根據(jù)計(jì)算得到的不同海拔梯度Ht=0.2822,Hs=0.2558,Gst在0.0464~0.2539,平均為0.0935,即4.64%~25.39%的遺傳變異存在于居群間,74.76%~95.26%的遺傳變異存在于居群內(nèi)。山生柳以有性繁殖為主,但是,由于山生柳分布于寒帶氣候如:高山、亞高山、山地寒溫針葉林帶和冰雪帶之間,具有長期積雪、風(fēng)大、低溫、干燥等氣候特點(diǎn)。因此,在惡劣的環(huán)境下,山生柳有性繁殖受到極大限制,因而主要依靠無性繁殖來維持其穩(wěn)定。山生柳聚類分析結(jié)果與形態(tài)學(xué)觀察特征基本一致,即說明了遺傳本質(zhì)差異對外部形態(tài)特征的對應(yīng)反應(yīng)。從另一方面證實(shí)SSR標(biāo)記穩(wěn)定可靠,可以利用標(biāo)記進(jìn)行物種的遺傳多樣性的分析。在祁連山脈隨著海拔的升高呈現(xiàn)出錦雞兒和山生柳叢生的情況,個(gè)體數(shù)較多也有利于傳粉和繁殖,干擾少從而資源保護(hù)很好,山生柳自身在惡劣的環(huán)境下積累了較多的遺傳變異,以適應(yīng)各種環(huán)境變異,例如隨著海拔的升高山生柳葉片蠟質(zhì)增多,葉片變小而厚等。上述結(jié)果均表明,群體分布的海拔和緯度差異,一定程度上造成了天然山生柳的分化。同時(shí)在本次研究中,也存在一定的限制性因素,由于取樣范圍有限,今后