超氧化物歧化酶的研究進展

超氧化物歧化酶的研究進展

超氧化物誘導酶（sod）是一種廣泛存在于生物中的金屬酶。它可以誘導超氧化物陰離子自由基的異質(zhì)反應，并將超氧化物誘導酶轉(zhuǎn)化為平衡機體內(nèi)的自由基。它是化學和生物化學研究領(lǐng)域的研究主題。作為生物體內(nèi)超氧陰離子自由基的清潔劑,SOD在防輻射、抗衰老、消炎、抑制腫瘤和癌癥、自身免疫治療等方面顯示出獨特的功能,在醫(yī)學、食品、化妝品等領(lǐng)域得到越來越多的應用。目前,世界各地學者對SOD的研究方興未艾,深入研究SOD不僅有著重大的理論意義,也有著重大的實際應用價值。1活性中心結(jié)合的金屬離子檢測到現(xiàn)在為止,人們已從細菌、原生動物、藻類、霉菌、植物、昆蟲、鳥、魚類和哺乳動物等生物體內(nèi)分離得到SOD。根據(jù)活性中心結(jié)合的金屬離子不同,SOD主要分為:①Cu/Zn-SOD,主要存在于真核細胞的細胞質(zhì)中;②Fe-SOD,主要存在于原核細胞和真核細胞的基質(zhì)中;③Mn-SOD,主要存在原核細胞及少數(shù)植物細胞中。三類主要SOD的理化特性如表1所示。2影響sod結(jié)構(gòu)和活性的因素2.1部位結(jié)構(gòu)的組成Cu/Zn-SOD每個分子由兩個亞基通過疏水作用和氫鍵力締合成二聚體,肽鏈內(nèi)部由半胱氨酸C55和C144的巰基構(gòu)成的二硫橋?qū)喕喓掀鹬匾饔?。Richardson用0.2nmX-射線衍射晶體結(jié)構(gòu)分析得到Cu/Zn-SOD三維結(jié)構(gòu),指出SOD的活性部位是以Cu為中心的一個“疏水口袋”(見圖1)。Cu和Zn處在疏水口袋底部,相距約0.63nm。Cu(Ⅱ)與四個組氨酸殘基咪唑環(huán)上N原子配位形成變形的平面四方形結(jié)構(gòu),其軸向位置上還結(jié)合著一個水分子,Zn(Ⅱ)則與三個組氨酸和一個天冬氨酸配位形成畸變的四面體結(jié)構(gòu),Cu(Ⅱ)與Zn(Ⅱ)之間通過共同連接一分子組氨酸而形成“咪唑橋”結(jié)構(gòu)。Mn-SOD由203個氨基酸殘基構(gòu)成。中心金屬Mn(Ⅲ)具有五配位的三角雙錐結(jié)構(gòu),其中3個配位基位于赤道平面,兩個軸向位置上分別為一個水分子和一個為His28的咪唑基。酶的活性部位在一個主要由疏水殘基構(gòu)成的環(huán)境里,兩個亞基鏈組成一個通道,構(gòu)成了底物或其它內(nèi)界配體接近Mn(Ⅱ)離子的必經(jīng)之路。Fe-SOD的結(jié)構(gòu)比較簡單且與Mn-SOD類似,活性中心中Fe(Ⅱ)離子與3個His、1個Asp和1個H2O配位,形成畸變四方錐結(jié)構(gòu)。2.2cu/zn-sod,zn的抗氧化酶系統(tǒng)SOD的催化活性主要與SOD活性中心的氨基酸殘基、金屬離子及其配位環(huán)境、“咪唑橋”的變化有關(guān)。SOD活性中心的精氨酸和組氨酸對SOD的催化活性具有極其重要的意義。這兩個氨基酸離中心金屬離子非常近,而且均帶有正電荷,能誘導底物O-2·,進入活性中心,并可在催化過程中提供H+以加快歧化反應速度。如這兩個氨基酸殘基被破壞或修飾,SOD將會失活。SOD中心金屬離子的作用也不相同。對于Cu/Zn-SOD,Zn(Ⅱ)的作用一是調(diào)節(jié)咪唑基與Cu的相互作用,二是穩(wěn)定活性中心的結(jié)構(gòu)。若除去酶分子中Zn(Ⅱ)而保留原有環(huán)境中時Cu(Ⅱ),SOD仍有相當高的活性。Cu(Ⅱ)與酶催化作用有關(guān),起著傳遞電子的作用。若除去Cu(Ⅱ),則SOD將會失活,重新加入Cu(Ⅱ)后SOD的酶活性恢復。另一方面,Cu(Ⅱ)所處的環(huán)境對活性有重要影響。若以其它金屬離子代替Cu(Ⅱ),同時用Cu(Ⅱ)代替Zn(Ⅱ),則酶失去全部活性。另外,只有結(jié)合態(tài)的Cu(Ⅱ)才直接與活性有關(guān),但在一定濃度范圍內(nèi),增加游離的Cu(Ⅱ)的濃度可顯著提高SOD活性。對“咪唑橋”配合物進行催化的研究表明,在催化過程中,“咪唑橋”在與銅相連的一側(cè)的N原子迅速地發(fā)生了質(zhì)子化和去質(zhì)子化的變化,對酶的催化活性有重要影響。2.3測定o-2sod活性的方法SOD的活性測定方法一般分直接測定法和間接測定法。直接測定法的原理是直接測定SOD催化反應的底物反應速度或產(chǎn)物生成速度。常見的直接測定方法有EPR法、脈沖輻解法、超氧化鉀法等。直接法需專用的儀器,故此類方法一般實驗室較難應用。間接測定法是通過某種能產(chǎn)生O-2·的系統(tǒng),使O-2·進行另一個便于檢測的反應,測定特征波長下的光吸收變化速率,計算SOD對這個反應的抑制程度從而間接定量SOD活性。常見的間接測定方法有黃嘌呤氧化酶-細胞色素C法、鄰苯三酚自氧化法、微量鄰苯三酚自氧化法、黃嘌呤氧化酶-NBT法、NBT光還原法等。3sod的研究國內(nèi)外有關(guān)SOD的研究方興未艾,比較活躍的領(lǐng)域主要有以下幾個方面。3.1sod化學修飾由于受到①半衰期短;②相對分子質(zhì)量大,不易透過細胞膜;③口服時易受胃蛋白酶分解;④體內(nèi)特異性等因素的限制,SOD很難作為藥用酶廣泛應用于臨床中。對SOD進行化學修飾,既能保留天然酶的活性,又能提高其穩(wěn)定性。SOD化學修飾的方法主要有:①對SOD的氨基酸殘基進行化學修飾,主要是對非活性部位進行修飾,目的是提高其穩(wěn)定性同時保留較高的生物活性;②用水溶性大分子(如聚乙二醇、聚蔗糖、右旋糖酐和聚烯屬烴基氧化物等)對SOD進行共價修飾以提高酶學特性;③對SOD進行酶切改造,降低相對分子質(zhì)量、減小抗原性。研究表明:經(jīng)過化學修飾后的SOD基本上保持了天然酶的活性,在耐熱、耐酸堿和抗胃蛋白酶分解等方面均有很大提高。3.2sod模型3.2.1氨基酸及多核配合物由于天然SOD自身存在的缺點,因此尋找和合成一類既能避免天然SOD不足,又具有SOD催化活性的物質(zhì)——SOD模擬物的研究非?；钴S。SOD模擬物具有相對分子質(zhì)量小、穩(wěn)定性高、在體內(nèi)半衰期長及脂溶性好的優(yōu)點。最令人感興趣的是Cu/Zn-SOD活性中心的模擬,可視為以咪唑橋聯(lián)的Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)異雙核配合物?，F(xiàn)今對Mn-SOD模擬物的研究逐漸增多,而Fe-SOD模擬物合成難度較大且SOD活性較低,故其模擬研究較少。近年來國內(nèi)外學者對氨基酸配合物和大環(huán)類配合物進行了廣泛探討。謝英等人合成了以二肽為配體的銅-(N-正十二碳酰雙甘肽)配合物,這是一個帶功能基的長鏈銅(Ⅱ)氨基酸配合物,同時用脈沖輻解法測定了其SOD活性,較好地模擬了SOD。毛宗萬等人研究了具有Cu/Zn-SOD酶活性中心類似結(jié)構(gòu)的模型化合物,深入地討論了不同的咪唑橋聯(lián)方式和不同配位構(gòu)型對模型化合物催化O-2·活性的影響。結(jié)果表明,咪唑橋N原子沿四方錐配位底面位置與Cu(Ⅱ)配位的模擬物活性大大高于咪唑橋N原子沿四方錐軸向與Cu(Ⅱ)配位的模擬物,活性差異的原因很可能與生成Cu(Ⅰ)中間體的穩(wěn)定性有關(guān)。在多核配合物方面,廖展如等根據(jù)天然SOD活性部位結(jié)構(gòu)合成了多種含苯并咪唑的Cu(Ⅱ)、Fe(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Co(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)的配合物,指出配合物活性與其模擬天然SOD結(jié)構(gòu)微環(huán)境程度的大小有關(guān),并將其應用于植物抗冷脅迫實驗。在進行低溫脅迫后,經(jīng)過SOD模擬物處理對水稻幼苗成活率明顯的高于未處理的幼苗[14,15,16,17,18,19],這些研究成果為研究開發(fā)新型農(nóng)藥開辟了新的途徑。Patel等合成了一系列以水楊醛丙氨酸席夫堿為配體的Cu(Ⅱ)-Cu(Ⅱ),Cu(Ⅱ)-Ni(Ⅱ),Cu(Ⅱ)-Zn(Ⅱ)咪唑橋聯(lián)的雙核配合物和相關(guān)的單核配合物并測定其SOD活性。結(jié)果表明,雙核配合物比單核配合物具有更高的SOD活性,這可能與雙核配合物的結(jié)構(gòu)更加類似于天然SOD的活性中心有關(guān)。3.2.2膠束體系對cu氨基酸由于SOD在生物體內(nèi)發(fā)揮其效用時所處的環(huán)境大多是非均相的,一些學者采用表面活性劑在水中形成的膠束體系來模擬上述非均相反應環(huán)境。金虬等人的研究表明由CTAB(陽離子型表面活性劑)和SDS(陰離子型表面活性劑)形成的膠束體系可使多種Cu(Ⅱ)-氨基酸配合物的SOD活性得到提高。但該體系結(jié)構(gòu)比較復雜,較難弄清其催化O-2·歧化的機理,這方面的研究有待進一步拓展和深化。3.3干旱脅迫對黑麥草葉片sod活性的影響植物在生長發(fā)育過程中可能受到諸如病原菌、水份、大氣污染、輻射、溫度、光照鹽堿度和重金屬等因素的脅迫。這些脅迫均能使植物產(chǎn)生過量的活性氧和自由基,引起細胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞。SOD是清除活性氧過程中第一個發(fā)揮作用的抗氧化酶,在植物體內(nèi)起重要作用。近年來,國內(nèi)外學者對SOD與植物抗逆性之間的關(guān)系做了大量研究。任安芝等人對干旱脅迫下內(nèi)生真菌感染的黑麥草葉中的SOD及其同工酶進行了系統(tǒng)的研究。研究表明:隨著干旱程度的提高,黑麥草葉片中SOD及其同工酶活性顯著提高,內(nèi)生真菌的感染使宿主植物SOD活性對干旱脅迫的反應更為敏銳。這些研究為在沙漠等干旱地區(qū)提高植被成活率提供了理論依據(jù)和方法。4開發(fā)應用程序近年來,SOD在基礎(chǔ)研究和應用研究上均取得實質(zhì)性進步,主要表現(xiàn)在醫(yī)療臨床、食品工業(yè)和化妝品中的廣泛應用。4.1od的應用由于本身就是生物體內(nèi)存在的酶,SOD在醫(yī)療臨床中應用具有先天優(yōu)勢,可以克服某些合成藥物帶來的副作用。SOD在醫(yī)療臨床中的應用范圍主要有:①延緩衰老,清除自由基,阻止自由基連鎖反應的作用;②治療炎癥性疾病,如最近的研究表明Cu/Zn-SOD是布魯士流產(chǎn)菌的抗體免疫原;③治療缺血-再灌性綜合癥,SOD可明顯減輕對組織器官的損壞程度;④防治腫瘤和癌癥,抑制或加強SOD作用均可以作為治療和預防腫瘤研究的思路和方法。4.2sod在食品工業(yè)上的應用SOD進行化學修飾和微膠囊化后,穩(wěn)定性大大提高,且本身活力也保持較高水平。因此極大地促進了SOD在食品工業(yè)中的應用,主要有:①作為保健食品的有效成分,如作為添加劑加入保健品口服液、酸奶、啤酒等;②作為抗氧化劑,抑制過氧化酶的作用,如用于果蔬采后保鮮。4.3皮膚損傷的防治作為化妝品的添加劑,SOD的作用主要是:①有明顯的防曬效果,SOD可有效防止皮膚受電離輻射的損傷;②有效防治皮膚衰老、祛斑、抗皺,起抗氧酶的作用;③有明顯的抗炎作用,對防治皮膚病有一定療效;④有一定的防治瘢痕形成的作用。研究證實外源性SOD能夠滲入皮膚進入體內(nèi)作用,且無不良反應和過敏現(xiàn)象。5國內(nèi)對sod的應用研究自1968年首次發(fā)現(xiàn)SOD以來,相關(guān)的研究一直是化學生物界熱門的研究課題。然而,仍有許多工作有待于進一步研究。在SOD理論研究方面,不少問題還未研究或者有待深入,如對SOD進行化學修飾后,修飾酶的代謝過程及