吉林省羊傳染性膿皰病血清學檢測與分析

吉林省羊傳染性膿皰病血清學檢測與分析

綿羊感染通常被稱為“羊口傷口”。它是由羊感染的病毒（或f.v）引起的。綿羊、山羊和其他中小型反芻動物以及人類的急性和高度接觸的動物共同感染的。ORFV為痘病毒科(Poxviridae)副痘病毒屬(Parapoxvirus)成員,主要侵害3～6月齡羔羊,引起感染皮膚部位和黏膜的增生性病變,臨床上以在感染動物的唇、鼻孔周圍、口腔、乳房以及尾根等部位皮膚/黏膜形成紅斑、丘疹、水皰、膿皰和疣狀痂皮為特征。該病自1787年首次發(fā)生于英國以來,澳大利亞、新西蘭、南非、意大利、印度等多個養(yǎng)羊國家和地區(qū)均有報道。我國最早有關該病的文獻記載是廖延雄等1955年撰寫的西北綿羊“口瘡”之初步報告。自此以后,新疆、西藏、甘肅、內(nèi)蒙、陜西、四川、云南、福建以及東北三省等多個養(yǎng)羊省區(qū)均有該病發(fā)生和流行的報道。近年來,世界各養(yǎng)羊國家和地區(qū)有關ORFV感染的臨床病例報道不斷增多,其感染的宿主范圍也在逐漸擴大,除綿羊、山羊等中小反芻動物外,也不斷有麝牛、馴鹿、松鼠、海豹等多種野生動物以及人發(fā)生感染的報道。此外,該病毒可通過直接接觸感染人類,嚴重威脅人類的身體健康,成為影響我國乃至全世界公共衛(wèi)生安全的一個重要隱患,具有深遠的公共衛(wèi)生意義。針對該病在我國發(fā)生的嚴峻形勢,本試驗通過PCR和ELISA方法分別對病毒核酸以及血清抗體進行檢測,調(diào)查其在吉林省羊群中的感染分布情況,初步闡明其流行規(guī)律。這不僅為研究病毒的分子致病機制奠定基礎,而且將為針對感染現(xiàn)狀日益嚴重的羊傳染性膿皰病科學防控措施的制定提供重要的理論依據(jù)。1pcr檢測和血清界定1.1材料628份痂皮組織樣本采集自2006-2010年吉林省農(nóng)安、九臺、遼源、通化、延邊、松原、白城、四平、大安等9個市縣85個養(yǎng)羊戶不同年齡不同品種疑似羊傳染性膿皰病毒感染羊只;2160份血清樣本隨機采集自上述地區(qū)同期的85個發(fā)病羊群;采集組織和血清樣本均置于-20℃保存。1.2試劑MiniBEST病毒DNA提取試劑盒、rTaqDNA聚合酶、dNTP、DNADL2000Marker等均購自大連TaKaRa公司;GST-CBP融合蛋白由本實驗室制備保存;ORFV陽性羊血清由本實驗室分離保存。1.3引物根據(jù)GenBank公布發(fā)表的ORFV干擾素抗性蛋白(Interferonresistanceprotein,VIR)基因序列,用PrimerPremier5.0軟件設計目的片段擴增引物,引物由上海生物工程有限公司合成。依據(jù)VIR基因設計的引物序列如下:P15′-TTGCTGCGAGGACGGAAACCCG-3′;P25′-TGCAGGTGAAGCGCGGACAGTG-3′,預期擴增目的片段大小為284bp。1.4DNA提取及PCR檢測用MiniBEST病毒DNA提取試劑盒提取病毒基因組DNA,操作按試劑盒說明書進行。以提取的病毒基因組DNA為模板,采用25μL的PCR反應體系,PCR擴增目的基因片段。PCR體系為:10×PCRBuffer2.5μL,2.5mmol/LdNTP1.5μL,rTaq酶0.5μL,25mmol/LP1、P2各1μL,模板5μL,滅菌蒸餾水13.5μL。反應條件為:95℃預變性2min30s;94℃30s,55℃30s,72℃40s,35個循環(huán);72℃延伸10min。PCR擴增結束后,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。1.5血清學檢測本實驗室以大腸桿菌BL21(DE3)大腸桿菌表達的ORFVGST-CBP融合蛋白作為包被抗原,通過優(yōu)化反應條件,建立了用于ORFV抗體檢測的間接ELISA方法。用上述建立的間接ELISA方法對臨床收集的血清樣品進行檢測,將待檢血清樣本按1∶40進行稀釋,100μL/孔,每個血清樣本設2個重復孔,同時設有ORFV陽性血清、陰性血清以及空白對照孔。ELISA測定結束后,通過酶標儀讀其在490nm處的D值,所得數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,并進行統(tǒng)計學分析(t檢驗)。2結果2.1擴增特異性基因片段PCR檢測應用PCR方法從采集自吉林省農(nóng)安、九臺、松原、白城等9個市縣的153份痂皮組織樣品中均擴增到特異性的基因片段,大小約284bp,與預期結果一致(圖1);羊群感染的平均陽性率為56.47%(48/85),痂皮組織樣本的平均陽性率為24.36%(153/628),各地區(qū)ORFV陽性率從16.42%～32.60%不等,其中松原、白城地區(qū)的陽性率較高(表1)。2.2成年羊不同性別羊羊的檢出率羔羊和育肥羊的ORFV抗原檢出率較高,分別為30.27%(56/185)和31.34%(68/217);在成年羊,公羊的檢出率最低,為6.94%(5/72);母羊的抗原陽性率稍高于公羊,為15.58%(24/154)(表2)。2.3羊及蒙古羊等抗寒羊品種的陽性檢出情況對采自不同品種羊的痂皮樣本進行PCR檢測分析,結果顯示:小尾寒羊、東北細毛羊及蒙古羊等綿羊品種的陽性檢出率高于波爾山羊、遼寧絨山羊以及黑山羊等山羊品種,在綿羊品種中,小尾寒羊的陽性檢出率最高,為31.07%(32/103);遼寧絨山羊在山羊品種中的檢出率最高,為23.93%(28/117)(表3)。2.4血清抗體檢測ORFV抗體陽性率通過間接ELISA方法對采集自吉林省農(nóng)安、九臺、松原、白城等9個市縣85個羊群的2160份血清樣本進行血清抗體檢測發(fā)現(xiàn),所有被檢羊群中均存在有ORFV感染,ORFV抗體平均陽性率為39.44%(852/2160),各地的抗體陽性率從18.95%～53.49%不等,其中松原、白城以及農(nóng)安地區(qū)羊群中ORFV抗體陽性率較高(表4)。2.5黨員質(zhì)量分數(shù)造林密度羔羊和育肥羊ORFV抗體陽性率較高,陽性率分別為50.21%(237/472)和57.17%(335/586);在成年羊,公羊的抗體陽性率為17.80%(94/528),母羊的抗體陽性率為32.40%(186/574)(表5)。2.6抗體陽性率對不同品種羊的血清學調(diào)查結果發(fā)現(xiàn),綿羊ORFV感染的血清學陽性率明顯高于山羊,其中東北細毛羊的抗體陽性率最高,為51.39%(221/432),在山羊品種中,遼寧絨山羊的抗體陽性率較高,為34.06%(156/458)(表6)。3不同地區(qū)和地區(qū)羊受感染的發(fā)生率及發(fā)生情況羊傳染性膿皰病在世界各養(yǎng)羊國家和地區(qū)均有流行和發(fā)生,我國的十多個省份均有報道,其中以北方的養(yǎng)羊省份較為常見,目前該病已成為各養(yǎng)羊國家和地區(qū)羊群中常見的疫病之一。由于ORFV抵抗力強,羊群一旦被感染則不易被清除,可持續(xù)危害羊群多年。此外,近年來頻繁的從國外引種、羊群飼養(yǎng)密度的加大以及粗放的飼養(yǎng)管理,導致羊群感染狀況日益嚴重且常呈全群性發(fā)生,給養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。本試驗應用PCR和間接ELISA方法分別對2006-2010年間采集自吉林省農(nóng)安、九臺、遼源、四平、松原、白城等9個市縣85個羊群的628份痂皮樣本和2160份血清樣本進行ORFV核酸以及血清抗體檢測,病原學檢測結果顯示,在各地區(qū)不同時期不同年齡段不同品種羊的皮膚痂皮樣本中均可檢測到ORFV,羊群中ORFV感染平均陽性率為24.36%(153/628),這表明ORFV在羊群中長期帶毒,呈持續(xù)性流行狀態(tài)。在不同年齡段的羊,以1～6月齡羔羊的抗原陽性率最高,表明ORFV主要侵害羔羊,而對成年羊的危害相對較小。在不同品種的羊,各品種羊的抗原陽性率不同,小尾寒羊、東北細毛羊及蒙古羊等綿羊品種的陽性檢出率高于波爾山羊、遼寧絨山羊以及黑山羊等山羊品種,表明不同品種羊?qū)RFV的易感性不同,綿羊較山羊較為易感。血清學等調(diào)查結果顯示,吉林省各縣市的抗體陽性率從18.95%～53.49%不等,其中松原、白城和農(nóng)安地區(qū)羊群中ORFV抗體陽性率較高。以上這些結果表明,ORFV在吉林省大部分地區(qū)羊群中的感染已經(jīng)非常普遍,應該根據(jù)ORFV的感染現(xiàn)狀有針對性地加強對該病的防控。通過對不同地區(qū)ORFV的感染率分析發(fā)現(xiàn),不同縣市的ORFV感染率存在一定的差別,其中吉林省北部的松原、白城等地區(qū)羊群的感染較為嚴重,這提示我們飼養(yǎng)環(huán)境與ORFV感染有很大關系,可以通過降低羊群的飼養(yǎng)密度、改善羊場的環(huán)境來降低ORFV感染的發(fā)生率。此外,對不同年齡段羊群的ORFV感染率分析發(fā)現(xiàn),ORFV主要感染羔羊,尤其是斷奶前后的羔羊,我們分析其原因:一方面可能是羔羊在吮乳過程中通過與感染的母羊接觸而感染,另一方面是由于羔羊通過與病羊接觸而傳播,這提示我們ORFV的水平傳播是一個重要的傳播途徑。因此,在引種時應進行嚴格的檢疫,及時淘汰陽性種羊,加強對環(huán)境的消毒等是降低ORFV感染的重要途徑。另外,在本次流行病學調(diào)查所涉及的85個羊群均未進行過羊傳染性膿皰病毒疫苗接種,這可能是由于該病的死亡率較低而未引起養(yǎng)羊戶的高度重視,造成羊群發(fā)生普遍感染。這個現(xiàn)象也提示我們,選擇恰當?shù)臅r間進行疫苗接種也能在一定程度上控制羊群中ORFV感染的發(fā)生。近年來,羊傳染性膿皰病在世界各養(yǎng)羊國