淺析甾醇側(cè)鏈切除的微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)

淺析甾醇側(cè)鏈切除的微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)

微生物轉(zhuǎn)化一直受到針灸和莫哈藥房的影響。為了使用低價(jià)天然材料進(jìn)行生產(chǎn)原料，提高微生物轉(zhuǎn)化效率一直是人們的方向。傳統(tǒng)甾體醫(yī)藥生產(chǎn)工藝采用甾體皂甙類自然資源為原料的化學(xué)合成途徑。由于自然資源的逐漸匱乏,化學(xué)合成工藝路線繁長、“三廢”污染嚴(yán)重,上世紀(jì)60年代人們開始采用微生物轉(zhuǎn)化廣泛存在于動、植物體內(nèi)的甾醇。如圖1所示,AD(androst-4-ene-3,17-dione)和ADD(androsta-1,4-diene-3,17-dione)已成為世界市場的重大產(chǎn)品,每年有1000噸以上的甾醇用于ADD/AD生產(chǎn)。這一變革歸功于篩選到了能夠?qū)⒐如薮?、豆甾醇和膽固醇等動植物甾醇轉(zhuǎn)化為關(guān)鍵中間體的微生物菌株和開發(fā)了能用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)。本文綜述微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的新進(jìn)展以及我們最近開發(fā)的濁點(diǎn)系統(tǒng)兩相分配生物反應(yīng)器技術(shù)。1有機(jī)溶劑進(jìn)料法1944年,Turfitt發(fā)現(xiàn)Mycobacterium能利用膽固醇或植物甾醇為唯一碳源進(jìn)行生長和繁殖。起初采用添加酶抑制劑的方法抑制1-2位脫氫酶或9α-羥化酶的活性,后來通過微生物誘變,獲得了阻斷1-2位脫氫酶和9α-羥化酶的突變株或阻斷9α-羥化酶的突變株,使甾醇側(cè)鏈切除的微生物轉(zhuǎn)化進(jìn)入了應(yīng)用時(shí)期。甾醇在水中溶解度很小,甾醇側(cè)鏈切除的微生物轉(zhuǎn)化常常不是由酶催化反應(yīng)速率控制,而是由底物的傳遞過程速率控制。生物轉(zhuǎn)化的底物是有機(jī)物,在水中溶解度一般較小,生物轉(zhuǎn)化疏水性底物是轉(zhuǎn)化技術(shù)的共同問題。如圖2所示,酶轉(zhuǎn)化不溶性底物常采用的策略有均質(zhì)有機(jī)溶劑、兩相系統(tǒng)/乳化、兩相膜生物反應(yīng)器和反膠束系統(tǒng)等。甾醇側(cè)鏈切除是多酶催化過程,必須采用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化,和酶在非水溶劑中穩(wěn)定性相比,微生物在非水溶劑中的生物相容性更加復(fù)雜。早期解決甾醇側(cè)鏈切除轉(zhuǎn)化效率的方法是采用有機(jī)溶劑進(jìn)料,如將甾醇脂質(zhì)體化、二甲基亞胺飽和溶液等。由于水溶性有機(jī)溶劑的生物相容性差,培養(yǎng)基中有機(jī)溶劑濃度受到限制,增加底物溶解的作用難以發(fā)揮。采用添加表面活性劑等的乳濁液進(jìn)料方法也得到廣泛研究,如環(huán)糊精、卵鱗脂、聚氧丙烯醇、Tween80等,表面活性劑一方面增加底物的溶解度,同時(shí)也改變細(xì)胞膜的通透性,對加快底物的傳遞和與微生物作用應(yīng)該會產(chǎn)生明顯效果,但實(shí)際上并不理想。兩相膜生物反應(yīng)器和反膠束系統(tǒng)應(yīng)用于甾醇側(cè)鏈切除的微生物轉(zhuǎn)化還未見文獻(xiàn)報(bào)道。微生物轉(zhuǎn)化甾醇側(cè)鏈切除的效率不但受底物溶解度的影響,還受到底物、產(chǎn)物抑制,產(chǎn)物進(jìn)一步降解等的制約。采用樹脂等吸附劑的原位產(chǎn)物去除(in-situproductremoval)方法實(shí)現(xiàn)了解除產(chǎn)物抑制和保護(hù)產(chǎn)物進(jìn)一步降解,在底物濃度達(dá)到10g/L時(shí)也獲得了較高的產(chǎn)物得率。最近發(fā)展起來的兩相分配生物反應(yīng)器,萃取相不但充當(dāng)?shù)孜锏膬Υ鎺?還充當(dāng)產(chǎn)物的萃取劑,同時(shí)實(shí)現(xiàn)底物的增溶和產(chǎn)物的原位去除。兩相分配生物反應(yīng)器應(yīng)用于微生物轉(zhuǎn)化甾醇側(cè)鏈切除的典型實(shí)例如表1所示。雙水相系統(tǒng)因生物相容性好而被應(yīng)用于甾醇側(cè)鏈切除的微生物轉(zhuǎn)化,但多聚物的增溶能力和價(jià)格限制了其在工業(yè)中應(yīng)用。相對于水溶性的均質(zhì)有機(jī)溶劑,有機(jī)溶劑兩相系統(tǒng)的生物相容性有提高,在甾醇側(cè)鏈切除的微生物轉(zhuǎn)化中研究較多。但有機(jī)溶劑仍有生物相容性問題,難度仍很大。細(xì)胞固定化技術(shù)是提高微生物生物相容性的有效途經(jīng)。文獻(xiàn)報(bào)道了在有機(jī)溶劑兩相系統(tǒng)中固定化細(xì)胞的催化活性明顯高于游離細(xì)胞。文獻(xiàn)還報(bào)道了在雙水相系統(tǒng)中采用固定化細(xì)胞的磁懸浮方法而改變細(xì)胞在兩相系統(tǒng)中的分配,使微生物轉(zhuǎn)化效率提高。有機(jī)溶劑兩相系統(tǒng)雖有明顯的優(yōu)勢,但培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分在有機(jī)溶劑中存在去極化現(xiàn)象,降低了微生物的生物利用度;底物在有機(jī)溶劑兩相系統(tǒng)中高度的不均勻分配,導(dǎo)致發(fā)生反應(yīng)的溶液相中底物濃度很低,降低了底物的反應(yīng)速率;有機(jī)溶劑的揮發(fā)性,增加了環(huán)境、安全的復(fù)雜性等。甾醇側(cè)鏈切除的微生物轉(zhuǎn)化過程一般都是將甾醇加入微生物的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中,以甾醇為碳源或唯一碳源。這種方法的主要缺點(diǎn)是不能實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞密度轉(zhuǎn)化和生長培養(yǎng)基使下游分離困難?？朔@一缺點(diǎn)的方法之一是采用休止細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化,將培養(yǎng)好的細(xì)胞加入營養(yǎng)成分缺乏的介質(zhì)中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。這一方法還能減少其它微生物污染的可能性。Cabral等在有機(jī)溶劑兩相系統(tǒng)中研究了甾醇側(cè)鏈切除的微生物轉(zhuǎn)化,測定了細(xì)胞量、微生物酶活性等重要數(shù)據(jù),為甾醇側(cè)鏈切除采用休止細(xì)胞轉(zhuǎn)化作了探索。甾體羥化有采用休止細(xì)胞的報(bào)道,但甾醇側(cè)鏈切除是多酶催化,還少見報(bào)道。2濁點(diǎn)系統(tǒng)的開發(fā)非離子表面活性劑溶液不同于離子型表面活性劑溶液的特征之一是在一定溫度或一定添加物濃度的條件下,溶液自動分相而形成表面活性劑濃度很低的稀相和富含表面活性劑的凝聚層相(Coacervatephase),稀相表面活性劑濃度大于或等于臨界膠束濃度。溶液分相時(shí)的溫度稱為濁點(diǎn),這一系統(tǒng)稱為濁點(diǎn)系統(tǒng)(cloudpointsystem,CPS)。在分離科學(xué)領(lǐng)域常利用溶質(zhì)在兩相中不均勻分配而實(shí)現(xiàn)濁點(diǎn)萃取。采用Mycobacteriumsp.NRRLB-3683轉(zhuǎn)化植物甾醇時(shí)獲得主產(chǎn)物ADD、副產(chǎn)物AD和微量副產(chǎn)物20α-羥甲基-孕甾-1,4-二烯-3-酮(圖3)。在一定濃度的TritonX-100和TritonX-114組成的表面活性劑溶液中,在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)溫度和產(chǎn)物的誘導(dǎo)下表面活性劑溶液會形成濁點(diǎn)系統(tǒng),我們將濁點(diǎn)系統(tǒng)開發(fā)為新的兩相分配生物反應(yīng)器技術(shù)成功地應(yīng)用于甾醇側(cè)鏈切除。數(shù)學(xué)模擬濁點(diǎn)系統(tǒng)中甾醇側(cè)鏈切除過程確定了表面活性劑濃度是轉(zhuǎn)化過程的重要可調(diào)參數(shù),進(jìn)一步優(yōu)化了生物轉(zhuǎn)化過程的操作參數(shù),使膽固醇添加濃度達(dá)到14.5g/L,產(chǎn)物ADD和AD濃度達(dá)到10g/L以上,摩爾轉(zhuǎn)化率高達(dá)93%。如圖4所示,濁點(diǎn)系統(tǒng)比常規(guī)溶液系統(tǒng)和其它兩相生物反應(yīng)器有優(yōu)勢。在水中,產(chǎn)物抑制微生物轉(zhuǎn)化;在雙水相系統(tǒng)中,高溶劑價(jià)格使其工業(yè)應(yīng)用不現(xiàn)實(shí);在有機(jī)溶劑兩相系統(tǒng)中,有機(jī)溶劑的生物毒性必須使用固定化細(xì)胞;在濁點(diǎn)系統(tǒng)中,不論是活細(xì)胞還是休止細(xì)胞,非固定化細(xì)胞微生物轉(zhuǎn)化都能順利進(jìn)行。類似于反膠束系統(tǒng),濁點(diǎn)系統(tǒng)的凝聚層相形成W/O型微觀乳濁液,對疏水性底物具有增溶作用,使底物的溶解度增加,充當(dāng)著底物的儲存庫。而且濁點(diǎn)系統(tǒng)凝聚層相的微觀乳濁液是表面活性劑和水形成的,消除了有機(jī)溶劑的影響。濁點(diǎn)系統(tǒng)中生物轉(zhuǎn)化液的薄層層析譜如圖5,濁點(diǎn)系統(tǒng)具有一般兩相分配生物反應(yīng)器中底物、產(chǎn)物在兩相中不均勻分配的特征,實(shí)現(xiàn)了底物的緩控釋,解除了底物抑制。產(chǎn)物的萃取解除了產(chǎn)物抑制和降解。我們在濁點(diǎn)系統(tǒng)中證實(shí)了微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)和微生物細(xì)胞生長的可分離性,成功地實(shí)現(xiàn)了甾醇側(cè)鏈切除的休止細(xì)胞微生物轉(zhuǎn)化。HPLC分析活細(xì)胞轉(zhuǎn)化7d和休止細(xì)胞轉(zhuǎn)化4d時(shí)轉(zhuǎn)化液的結(jié)果如圖6所示,轉(zhuǎn)化的主產(chǎn)物ADD、副產(chǎn)物AD和微量副產(chǎn)物20α-羥甲基-孕甾-1,4-二烯-3-酮的出峰時(shí)間分別為3.6min、4.3min和6.2min。休止細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化較活細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物ADD濃度增加,轉(zhuǎn)化周期縮短,可能是實(shí)現(xiàn)了高細(xì)胞密度轉(zhuǎn)化所致。甾醇側(cè)鏈切除形成產(chǎn)物ADD存在母環(huán)的△1-2脫氫反應(yīng),這是依靠輔酶催化的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化,輔酶的連續(xù)再生一般需要活細(xì)胞代謝來維持。休止細(xì)胞和活細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的HPLC圖譜基本一致,這表明休止細(xì)胞維持了活細(xì)胞的生命活力。但休止細(xì)胞和活細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化相比,副產(chǎn)物AD的比例降低,微量副產(chǎn)物20α-羥甲基-孕甾-1,4-二烯-3-酮量略有有升高,表明全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化甾醇側(cè)鏈切除體系有