家兔熱原實驗的幾點思考

家兔熱原實驗的幾點思考

家蠶熱原實驗是對產(chǎn)品中熱原的經(jīng)典有效實驗。許多國家還認為，它是熱原檢測的“黃金參考”。由于該實驗是一個整體的動物實驗,動物自身的行為、生理、外部環(huán)境等許多因素都可直接影響實驗結(jié)果的準確性。盡管隨著我國實驗動物的飼養(yǎng)管理的規(guī)范化和標準的不斷提高,外部環(huán)境對實驗結(jié)果的影響在逐步減小,然而要保證熱原實驗結(jié)果的準確性,仍有許多因素需要探索。本文就本實驗室對影響家兔熱原實驗的部分因素進行了探討。1實驗樣品和試劑熱原檢測儀(型號:SIBP-PC100,上海生研所生產(chǎn));家兔為普通級(購自北京市科宇公司,動物合格證號:01-5021);環(huán)境設(shè)施和飼養(yǎng)條件:為清潔級飼養(yǎng)環(huán)境,設(shè)施合格證號:01-4072;實驗樣品:來自不同的廠家,在實驗時隨機進行安排;給藥劑量按規(guī)定的標準執(zhí)行;其它:如酒精棉球,無菌無熱原注射器等。數(shù)據(jù)處理:本文中所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析均使用SAS程序進行。2試驗方法和結(jié)果2.1標準和檢驗方法對家兔不合格原因的影響按生物制品規(guī)程(以下簡稱規(guī)程)和藥典預(yù)檢溫要求,在2003年12月24日至2004年5月10日對726只家兔進行預(yù)檢溫試驗。結(jié)果見表1、表2。從表1可見,726只用規(guī)程篩選合格的家兔,如果采用藥典的預(yù)檢溫方法和判定標準,僅有472只(65%)合格;即使按照0.5℃的判定標準,采用藥典的0.5h采點計算,也有近16.5%的家兔不合格。經(jīng)Fisher精確概率法統(tǒng)計,采用兩種不同的方法,相同標準(0.5℃)的合格率差異也有顯著意義。值得注意的是,在這726只規(guī)程判定合格的家兔中,如果用藥典方法判定,35只體溫低于38℃;134只溫差在0.4到0.5℃之間。2.2不同預(yù)檢溫前家兔的心理變化下列實驗結(jié)果是2003年11月14日購進的一批家兔,在本實驗室適應(yīng)9天,于11月24日進行預(yù)檢溫情況。實驗的具體時間如下:預(yù)檢溫當天,早晨8點開始固定家兔,8:30固定結(jié)束,并開始打印數(shù)據(jù),一直到16點結(jié)束,總計56只家兔。每隔30min采集、打印一次溫度,預(yù)留不定的穩(wěn)定時間,計算4h內(nèi)的8個溫度點的溫差,并按照不超過0.4℃判為合格家兔。結(jié)果見表3。從表3可見,家兔因捉拿、運輸、固定等造成的應(yīng)激,隨著預(yù)檢溫前的穩(wěn)定時間的延長大約在1~1.5h基本消逝。這時的篩選率能夠基本顯示家兔的正常狀況。穩(wěn)定時間越長,篩選率越高(經(jīng)雙向有序且屬性不同的2×8表的等級相關(guān)分析,p=0.0136)。但由于在測定熱原時還需要約4h的固定時間,穩(wěn)定時間過長,會出現(xiàn)動物的覓食等條件反射的一些影響,所以實際意義不大。2.3不同體溫下的動物數(shù)該組數(shù)據(jù)來源于2003年7月至11月的熱原實驗結(jié)果,總計740只家兔,均為第一次進行熱原實驗。預(yù)檢溫和熱原實驗采用規(guī)程的要求,將每只家兔實驗前的平均體溫匯總統(tǒng)計,按體溫≤38.5℃,在38.5~39.0℃之間和≥39.0℃的家兔劃分為3組,對給予樣品后的升溫超過0.6℃的家兔進行統(tǒng)計。由于樣品是隨機安排,所以將樣品的影響歸為系統(tǒng)誤差。結(jié)果見表4。表4顯示了按基礎(chǔ)體溫高低劃分的3組中出現(xiàn)的升溫≥0.6℃的動物數(shù)以及低于0.6℃的動物數(shù)。經(jīng)雙向有序且屬性不同的3×2表資料的線性趨勢檢驗可見,各組之間差異顯著。升溫≥0.6℃的家兔數(shù)隨基礎(chǔ)體溫的升高而顯著下降(F=21.66,p<0.001)。2.4從測定時間上看下列數(shù)據(jù)采自與試驗2同一批家兔,計算家兔經(jīng)穩(wěn)定后的體溫波動情況,判定標準按照藥典預(yù)檢溫要求,即每0.5h記錄溫度一次,4h內(nèi)共采集8次,溫差波動不超過0.4℃為合格。見表5。從表5可見,隨著測定時間的延長,家兔的溫差波動逐漸增大,合格率逐步降低(經(jīng)雙向有序且屬性不同的2×4表的等級相關(guān)分析,P=0.0003)。3.5h內(nèi)的合格數(shù)與4.5h內(nèi)的合格數(shù)有顯著的差異(P<0.1)。該數(shù)據(jù)有力地證明,在熱原實驗時,應(yīng)該盡量縮短注射時間,使整個測溫過程不超過4h,以便減少因動物自身體溫波動增大而產(chǎn)生的假陽性。3選的標準不同3.1預(yù)檢溫與熱原實驗時操作程序及標準的不同是造成生物制品重復(fù)率高的重要原因規(guī)程規(guī)定的篩選方式為1h采溫度點一次,與熱原檢測實驗的采溫方式不同(0.5h測體溫一次);并且將體溫波動不超過0.5℃的家兔判定為合格。我們的統(tǒng)計結(jié)果顯示,當預(yù)檢溫改為0.5h測體溫一次時,仍有大約11.7%的家兔體溫波動超過0.5℃,其中有3.7%的家兔出現(xiàn)0.6℃以上的波動。這部分家兔在實驗時,也許即使無熱原刺激,僅僅因?qū)嶒灂r增加的注射等人為因素即可出現(xiàn)升溫超過0.6℃的現(xiàn)象,從而造成假陽性的結(jié)果或復(fù)試率升高。藥典規(guī)定體溫波動不超過0.4℃為合格家兔,并且預(yù)檢溫方式與實驗方法完全一致;這樣有效地減少了假陽性的發(fā)生率,因為經(jīng)本實驗室觀察認為熟練的操作所產(chǎn)生的干擾使體溫波動不超過0.25℃。所以建議篩選方式至少應(yīng)采用與實驗完全一致的方式。隨熱原儀的普及和軟件完善,建議使用體溫變化曲線來篩選家兔。本文的數(shù)據(jù)顯示,家兔的基礎(chǔ)體溫在38.0~39.8℃的范圍內(nèi),對熱原的敏感性隨基礎(chǔ)體溫的高低而有明顯的差異;家兔基礎(chǔ)體溫越低,出現(xiàn)升溫超過0.6℃的概率越大,即敏感性增高的可能性越大。為保證實驗結(jié)果的客觀公正,應(yīng)盡量使用基礎(chǔ)體溫較一致的家兔進行實驗。有關(guān)家兔的篩選方式和篩選標準方面,美國藥典,一直采用除不注射外,其程序完全與實驗程序一致的要求。對基礎(chǔ)體溫的要求則經(jīng)過了修訂:55年版(XV版)以前要求使用基礎(chǔ)體溫在38.9~39.8℃范圍的家兔;從55年版(XV版)開始改為不使用體溫超過39.8℃以上的家兔,對下限沒有提及。因為使用低體溫的家兔,其靈敏度大的概率高;實驗的標準更嚴格了,所以沒有必要規(guī)定。同時,試驗者有更大的靈活性。英國藥典和歐洲藥典對基礎(chǔ)體溫的下限進行了設(shè)定,強調(diào)必須使用38.0~39.8℃范圍內(nèi)的家兔。但是,英國藥典和歐洲藥典的篩選方式以及實驗結(jié)果的判定標準是與美國藥典及我國藥典有很大差異的。在篩選方式上,程序完全與實驗過程一致,需要注射10ml生理鹽水,且注射后體溫波動不能超過0.6℃,方可使用;還有一條規(guī)定是在熱原實驗時,注射前應(yīng)至少記錄90min家兔的體溫(30min一次),任何兩次的體溫差超過0.2℃的動物均不使用;另外,它們對實驗結(jié)果的判定標準是以3只家兔的溫差和計算的,不考慮單只升溫超標問題。我國藥典在1985年版前均規(guī)定使用體溫在38.5~39.6℃范圍內(nèi)的家兔進行實驗,直到1985版才改用38.0~39.6度范圍內(nèi)的家兔,并指出預(yù)檢溫的4h內(nèi)(每h測溫一次)溫差波動不超過0.4℃;之后一直沿用到2000版使用前。2000版才根據(jù)美國的藥典規(guī)定,將檢測時間由1h測溫一次改為0.5h測溫一次(預(yù)檢溫和實驗均一致)。而規(guī)程在1977年版中對動物體溫的規(guī)定是38.3~39.6℃,且4h內(nèi)的4次溫差波動不超過0.5℃。到1990年版改為38.0~39.8℃范圍,仍然是4h內(nèi)的4次溫差波動不超過0.5℃。1995年版沒有修改;到2000年版做了較大修改,其中要求實驗時的溫度測定時間由1h改為0.5h,但這次對預(yù)檢溫的程序卻沒有任何修改,仍然是每h測溫1次,4次溫度的溫差波動不超過0.5℃為合格。從我們的結(jié)果分析可見,這可能是目前造成我國生物制品熱原試驗復(fù)試率高的一個重要原因。3.2溫度記錄開始前的穩(wěn)定時間對預(yù)檢溫篩選率和實驗時的熱原結(jié)果有顯著影響由于運輸、固定、注射等的應(yīng)激刺激,家兔在1h后體溫才能恢復(fù)正常,從我們的預(yù)檢溫的篩選率結(jié)果可見,第一個采溫點應(yīng)在固定后的60~90min左右為好;這也與英國藥典的要求正好吻合。為保證熱原實驗結(jié)果的可靠性,應(yīng)適當延長檢溫開始前的穩(wěn)定時間。在樣品檢測時,美國藥典經(jīng)1990年的聯(lián)合評價后,在1995年版(XXIII)改為0.5h測溫間隔后,仍不將注射后的0.5h的體溫計算在內(nèi),而是以其后的5點(1~3h)的最大升溫和基礎(chǔ)體溫比較計算其最大升溫溫差,就是考慮到注射對家兔造成的應(yīng)激應(yīng)予以剔除。我們的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),確實有個別家兔在注射后的0.5h體溫最高,由于熱原的正常反應(yīng)時間多在1h以后,所以認為不計算第一點是科學(xué)的。我國藥典至今仍將第一點計算在內(nèi),還沒有修改。3.3合理地縮短熱原實驗的測溫時間可有效保證熱原實驗結(jié)果的準確性測溫時間越長,家兔自身的體溫波動越大;在熱原測定期間,給藥時間的長短和給藥熟練程度可直接影響熱原實驗結(jié)果的準確性。有關(guān)注射時間問題,美國藥典也經(jīng)歷了幾次修訂:1960年版(XVI)前沒有注明,1965年版(XVII)注明每只注射時間不超過2min,1970年版(XVIII)改為含糊的“簡短時間”(briefperiodoftime),到1980年版(XX)再次明確,每組的實驗注射時間在基礎(chǔ)體溫測出后不超過10min完成;之后一直沿用至今,從這個歷程也可見其注重盡量控制整個實驗的時間。我國藥典從1985版開始注明注射時間應(yīng)在測定正常體溫后的15min內(nèi)完成,也是注意到注射時間過長會造成結(jié)果的不準確性。因此建議使用固定的、注