mb-ag再刺激活化的人細(xì)胞凋亡模型的建立

mb-ag再刺激活化的人細(xì)胞凋亡模型的建立

在這項(xiàng)工作中，我們使用了不同濃度的mtb-ag刺激激活的t細(xì)胞，并對mtb-ag刺激激活的t細(xì)胞進(jìn)行了模型。此外，還觀察了信號轉(zhuǎn)移軌跡無論是ly29002還是nb20560，對mtb-ag刺激誘導(dǎo)人的影響，以及t細(xì)胞因抗核桿菌原生動(dòng)物i-t細(xì)胞的死亡機(jī)制。這為進(jìn)一步探索抗mtb感染機(jī)奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞健康人外周血來自蚌埠醫(yī)學(xué)院健康教工和學(xué)生。1.2產(chǎn)品的基本情況RPMI1640(GIBCO公司產(chǎn)品);淋巴細(xì)胞分離液(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液所產(chǎn)品);新生牛血清(NBS)(杭州四季青生物公司產(chǎn)品);rIL-2(長春長生基因藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品);Mtb-Ag(根據(jù)文獻(xiàn)自行制備);anti-TCRγδ-PE(BD公司產(chǎn)品);anti-CD3-FITC(Ancell公司產(chǎn)品);Annexin-V-FITC/PI試劑盒(BenderMedsystems公司產(chǎn)品);二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)(Sigma公司產(chǎn)品);SB203580溶液,1mgSB203580(Sigma公司產(chǎn)品)溶解于0.662mlDMS0中(無菌操作),濃度為4000μmol/L;LY294002溶液,1mgLY294002(Sigma公司產(chǎn)品)溶解于1.301mlDMS0中(無菌操作),濃度為2500μmol/L;流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)(BD公司產(chǎn)品)。1.3方法1.3.1mtb-ag誘導(dǎo)的t細(xì)胞常規(guī)分離健康人PBMC,用含5%NBS及5%人自體血清的RPMI1640培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液1×106～2×106ml-1,加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔1ml;加入Mtb-Ag5.0μg/ml和rIL-250U/ml用于誘導(dǎo)Mtb-Ag激活的T細(xì)胞(Mtb-AgactivatedhumanTcells,MtbAT);37℃、5%CO2培養(yǎng),每隔3～4天每孔補(bǔ)加rIL-250U,擴(kuò)增細(xì)胞,并根據(jù)細(xì)胞增殖情況分孔培養(yǎng)。取培養(yǎng)15～25天、生長良好的MtbAT(以γδT細(xì)胞為主),實(shí)驗(yàn)前8～12小時(shí)收集細(xì)胞,分別配制成1×106～2×106ml-1的細(xì)胞懸液;再加入rIL-250U/ml,37℃、5%CO2培養(yǎng)8～12小時(shí)使細(xì)胞平衡待用。1.3.2mtb-ag細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表現(xiàn)24小時(shí)的凋亡研究取24孔培養(yǎng)板一塊,分成4個(gè)實(shí)驗(yàn)組即對照組(0μg/mlMtb-Ag)、5.0μg/mlMtb-Ag組、10.0μg/mlMtb-Ag組和20.0μg/mlMtb-Ag組;每孔加上述MtbAT懸液0.2ml,37℃、5%CO2培養(yǎng)24小時(shí)后,參照文獻(xiàn),應(yīng)用Annexin-V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)(Flowcytometry,FCM)檢測γδT細(xì)胞凋亡,在Cellquest或WinMDI2.8軟件分析時(shí)注意:在FSC、SSC散點(diǎn)圖,設(shè)置活細(xì)胞區(qū)(R1區(qū)),盡可能把壞死的細(xì)胞排除在R1區(qū)外;在抗-TCRγδ-PE、Annexin-V-FITC散點(diǎn)圖上,設(shè)置G1=R1,并以被抗-TCRγδ-PE熒光抗體染色的細(xì)胞設(shè)為R2區(qū);在PI、Annexin-V-FITC散點(diǎn)圖上,設(shè)置G2=R1×R2,進(jìn)行T細(xì)胞凋亡分析。1.3.3mtb-ag再刺激取24孔培養(yǎng)板一塊,分成5個(gè)實(shí)驗(yàn)組即對照組(0μg/mlMtb-Ag)、10.0μg/mlMtb-Ag再刺激MtbAT3、6、12和24小時(shí)組;每孔分別加上述MtbAT懸液0.2ml,37℃、5%CO2培養(yǎng)至相應(yīng)處理時(shí)間后,分別應(yīng)用Annexin-V-FITC/PI染色FCM檢測γδT細(xì)胞凋亡。1.3.4體外細(xì)胞凋亡ma取96孔培養(yǎng)板一塊,分成7個(gè)實(shí)驗(yàn)組即對照組(僅為細(xì)胞懸液)、2.0%DMSO實(shí)驗(yàn)組、10.0μg/mlMtb-Ag實(shí)驗(yàn)組、20.0μmol/LSB203580實(shí)驗(yàn)組、80.0μmol/LSB203580實(shí)驗(yàn)組、10.0μmol/LLY294002實(shí)驗(yàn)組和50.0μmol/LLY294002實(shí)驗(yàn)組。作如下處理:①每孔均加上述MtbAT懸液0.2ml;②2.0%DMSO對照組每孔加入DMSO4μl,20.0μmol/LSB203580實(shí)驗(yàn)組每孔加入p38途徑抑制劑SB203580(4000μmol/L)1.0μl,80.0μmol/LSB203580實(shí)驗(yàn)組每孔加入SB203580(4000μmol/L)4.0μl,10.0μmol/LLY294002實(shí)驗(yàn)組每孔加入磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)途徑抑制劑LY294002(2500μmol/L)0.8μl,50.0μmol/LLY294002實(shí)驗(yàn)組每孔加入LY294002(2500μmol/L)4.0μl,微量攪拌器上混勻;③置37℃、5%CO2溫箱,60分鐘后,除對照組及2.0%DMSO實(shí)驗(yàn)組外,其余實(shí)驗(yàn)組的每培養(yǎng)孔各加入Mtb-Ag(160.0μg/ml)12.5μl,微量攪拌器上混勻;④置37℃、5%CO2溫箱,培養(yǎng)3小時(shí)后,應(yīng)用Annexin-V-FITC/PI染色FCM檢測γδT細(xì)胞凋亡。按下式計(jì)算細(xì)胞凋亡抑制率:細(xì)胞凋亡抑制率(%)=(Mtb-Ag再刺激組細(xì)胞凋亡率-抑制劑組細(xì)胞凋亡率)/(Mtb-Ag再刺激組細(xì)胞凋亡率-對照組細(xì)胞凋亡率)×100%。1.4統(tǒng)計(jì)處理經(jīng)Poisson分布兩樣本均數(shù)比較的u檢驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05為有顯著差異的界限。2結(jié)果2.1凋亡細(xì)胞比例24小時(shí)的凋亡研究與對照組相比,5.0μg/mlMtbAg誘導(dǎo)γδT細(xì)胞凋亡不顯著(P>0.05),凋亡細(xì)胞比例僅增加8.05%;10.0及20.0μg/mlMtbAg顯著誘導(dǎo)γδT細(xì)胞凋亡(P<0.01),凋亡細(xì)胞比例分別增加35.63%及38.83%,且此二種濃度MtbAg在誘導(dǎo)γδT細(xì)胞凋亡方面無顯著性差異(P>0.05),見表1。2.21t細(xì)胞凋亡與對照組相比,10.0μg/mlMtb-Ag再刺激MtbAT3、6、12和24小時(shí)均可顯著誘導(dǎo)γδT細(xì)胞凋亡(P<0.01);10.0μg/mlMtb-Ag再刺激MtbAT3小時(shí)實(shí)驗(yàn)組與再刺激MtbAT24小時(shí)實(shí)驗(yàn)組相比,在誘導(dǎo)γδT細(xì)胞凋亡方面無顯著性差異(P>0.05),后者的凋亡細(xì)胞比例僅比前者增加7.55%,見表2。2.3mol/lbs20133實(shí)驗(yàn)組與對照組凋亡細(xì)胞比例與Mtb-Ag實(shí)驗(yàn)組相比,80.0μmol/LSB203580及10.0μmol/LLY294002均顯著抑制Mtb-Ag再刺激誘導(dǎo)γδT細(xì)胞凋亡,凋亡抑制率分別為91.6%(P<0.01)及43.1%(P<0.05);80.0μmol/LSB203580實(shí)驗(yàn)組與對照組相比,在凋亡細(xì)胞比例方面無顯著性差異(P>0.05),而10.0μmol/LLY294002實(shí)驗(yàn)組與對照組相比在凋亡細(xì)胞比例方面存在顯著性差異(P<0.05);說明80.0μmol/LSB203580能夠幾乎完全阻斷Mtb-Ag再刺激誘導(dǎo)γδT細(xì)胞凋亡,10.0μmol/LLY294002部分阻斷Mtb-Ag再刺激誘導(dǎo)γδT細(xì)胞凋亡,見表3和圖1。3mtbag再刺激誘導(dǎo)t細(xì)胞凋亡由于γδT細(xì)胞在人外周血中比例甚低,僅占外周血T細(xì)胞的5%左右,分離純化較難,為了進(jìn)一步研究γδT細(xì)胞活化及凋亡機(jī)制,探討其生物學(xué)功能,就需要獲取足量γδT細(xì)胞。本文參照文獻(xiàn),采用外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過Mtb-Ag體外誘導(dǎo)的方法,在短時(shí)間內(nèi)獲得大量高純度γδT細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上,本文參照文獻(xiàn)選擇三種濃度Mtb-Ag作用于培養(yǎng)15～25天的γδT細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)Mtb-Ag(10.0μg/ml)作用于γδT細(xì)胞24小時(shí)可顯著地誘導(dǎo)其凋亡。同時(shí)我們在對Mtb-Ag(10.0μg/ml)再刺激γδT細(xì)胞不同時(shí)間誘導(dǎo)其凋亡的比較研究中,發(fā)現(xiàn)Mtb-Ag作用γδT細(xì)胞3小時(shí)可顯著地誘導(dǎo)其凋亡。至此,我們成功建立Mtb-Ag再刺激活化的人γδT細(xì)胞凋亡模型,為深入研究γδT細(xì)胞凋亡機(jī)制打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。另外,我們前期研究亦發(fā)現(xiàn)MtbAg再刺激已培養(yǎng)8～12天的γδT細(xì)胞,主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)其活化與增殖,誘導(dǎo)其凋亡作用不明顯。之所以出現(xiàn)MtbAg再刺激已活化不同天數(shù)的γδT細(xì)胞,表現(xiàn)出不同生物學(xué)效應(yīng)的原因,可能與γδT細(xì)胞對Mtb-Ag進(jìn)行有效的免疫應(yīng)答要經(jīng)歷活化期和增殖期有關(guān):在活化期內(nèi),T細(xì)胞被誘導(dǎo)表達(dá)IL-2及其受體IL-2R,IL-2與IL-2R結(jié)合后啟動(dòng)T細(xì)胞周期的進(jìn)程,T細(xì)胞進(jìn)入增殖期,增殖期的淋巴細(xì)胞易凋亡。在抗原刺激下,T細(xì)胞一般會導(dǎo)致三種結(jié)果:①T細(xì)胞充分活化及克隆擴(kuò)增,表達(dá)細(xì)胞因子,效應(yīng)細(xì)胞增殖等;②不完全活化;③活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(Activationinducedcelldeath,AICD),即Fas/FasL相互作用觸發(fā)的凋亡。AICD對T細(xì)胞向不同方向分化以及調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫應(yīng)答起重要作用,在AICD過程中,激活T細(xì)胞合成的FasL與帶有Fas的靶細(xì)胞作用,再通過依次激活Fas相關(guān)死亡分子(Fasassociateddeathdomain,FADD)、caspase8及其他下游caspase(包括caspase2、caspase3和caspase5等),最終可使細(xì)胞發(fā)生凋亡;大部分增殖的外周血T細(xì)胞都以凋亡的方式被清除。以上的研究結(jié)果都是基于對γδT細(xì)胞的研究而提出來的,作為一種特殊的T細(xì)胞亞群的γδT細(xì)胞對抗原的反應(yīng)會如何?我們的研究結(jié)果證實(shí),在MtbAg刺激下γδT細(xì)胞亦會導(dǎo)致上述相似結(jié)果,γδT細(xì)胞先被充分活化及克隆擴(kuò)增,表達(dá)細(xì)胞因子等,MtbAg再刺激可誘導(dǎo)γδT細(xì)胞凋亡,表現(xiàn)為Fas/FasL相互作用觸發(fā)的凋亡。但目前尚不清楚在MtbAg刺激下,γδT細(xì)胞發(fā)生凋亡的具體機(jī)制。絲裂原活化的蛋白激酶(Mitogenactivatedproteinkinase,MAPK)途徑是淋巴細(xì)胞中的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一,參與細(xì)胞的發(fā)育、增殖、活化和促進(jìn)IL-2基因轉(zhuǎn)錄等多種作用。MAPK為絲/蘇氨酸激酶,分為ERK、p38和JAN等亞家族成員。SB203850是p38途徑的特異性抑制劑,本實(shí)驗(yàn)先用SB203850處理γδT細(xì)胞,然后再用Mtb-Ag刺激,以觀察Mtb-Ag誘導(dǎo)γδT細(xì)胞凋亡是否與p38途徑有關(guān),結(jié)果發(fā)現(xiàn)80.0μmol/LSB203580幾乎完全阻斷Mtb-Ag再刺激誘導(dǎo)γδT細(xì)胞的凋亡(凋亡抑制率為91.6%)。這提示Mtb-Ag再刺激誘導(dǎo)γδT細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制涉及p38途徑。至于Mtb-Ag再刺激誘導(dǎo)γδT細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制是否涉及MAPK途徑中的ERK和JAN等亞家族成員,以及p38途徑在Mtb-Ag再刺激誘導(dǎo)γδT細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制中的地位與具體作用,還有待于進(jìn)一步研究闡明。PI3K是T細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,其在TCR/CD3活化信號、IL-2/IL-2R信號、NK細(xì)胞活化信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)中均起一定的作用,另外亦證實(shí)PI3K在CD28介導(dǎo)的γδT細(xì)胞活化信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著十分重要的作用。PI3K由一個(gè)催化亞基(P110)和一個(gè)調(diào)節(jié)亞基(P85)構(gòu)成。P110與蛋白激酶同源,可催化肌醇環(huán)上3位羥基生成3,4二磷酸磷脂酰肌醇(PI-3,4-P2)和3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇(PI-3,4,5-P3),它們均可作為第二信使在γδT細(xì)胞活化中傳遞信號。LY294002是PI3K的特異性抑制劑,它通過競爭性拮抗ATP與P110的結(jié)合使PI3K失去活性而阻斷PI3K活化途徑。為了探討Mtb-Ag誘導(dǎo)γδT細(xì)胞凋亡是否與PI3K有關(guān),我們用LY294002處理γδT細(xì)胞,然后再給予Mtb-Ag刺激,結(jié)果發(fā)現(xiàn)10.0μmol/LLY294002部分阻斷Mtb-Ag再刺激誘導(dǎo)γδT細(xì)胞的凋亡(凋亡抑制率為43.1%)。因此我們推測Mtb-Ag再刺激誘導(dǎo)γδT細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制涉及PI3K。但有關(guān)PI3K在Mtb-Ag再刺激誘導(dǎo)γδT細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的具體作用,還有待于進(jìn)一步研究闡明。近年來,許多學(xué)者在研究中逐漸發(fā)現(xiàn),γδT細(xì)胞在抗結(jié)核桿菌