脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)3型亞型基因診斷

脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)3型亞型基因診斷

脊柱性共濟(jì)失調(diào)是一種以四肢運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)障礙為特征的正常染色體遺傳疾病?；?qū)W檢測(cè)是目前診斷遺傳性脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)(SCA)的金標(biāo)準(zhǔn)。近1年來(lái),本研究對(duì)其臨床特征及基因診斷方面的特征進(jìn)行了探討。現(xiàn)報(bào)告如下。1數(shù)據(jù)和方法1.1肌肉肌力及視網(wǎng)膜反應(yīng)檢測(cè)收集臨床診斷為SCA家系20例,均為漢族,其中患者10例、家系內(nèi)正常人10例。家系1:先證者(Ⅲ6),男,38歲。該家系來(lái)自山東地區(qū),家族無(wú)近親結(jié)婚史。4代17例成員中女性患者2例,男性患者4例,發(fā)病年齡25～36歲,符合常染色體顯性遺傳規(guī)律。先證者體征:構(gòu)音不清,偶有飲水嗆咳,向右注視時(shí)可見(jiàn)慢眼動(dòng),向左注視時(shí)可見(jiàn)快速眼震。雙上肢近端肌肉、雙側(cè)胸鎖乳突肌明顯萎縮,雙上肢肌力Ⅴ級(jí),雙下肢肌力Ⅳ級(jí)?？梢?jiàn)肌肉束顫。四肢肌張力增高。指鼻試驗(yàn)、雙手輪替運(yùn)動(dòng)均不穩(wěn)準(zhǔn),右側(cè)重于左側(cè)。雙上肢肱二頭肌反射、肱三頭肌反射均活躍,雙下肢膝腱反射、跟腱反射均亢進(jìn)。髕陣攣、踝陣攣均陽(yáng)性。雙側(cè)Hoffmans征陽(yáng)性,雙側(cè)Babinski’s征陽(yáng)性,余病理征未引出。腦膜刺激征陰性。家系內(nèi)其他部分患者可見(jiàn)眼球內(nèi)陷、雙側(cè)快速眼震等體征。家系2:先證者(Ⅲ6),女46歲,該家系來(lái)自山東地區(qū),患者母親、舅舅、1個(gè)弟弟均有類(lèi)似癥狀,4代14例成員中女性患者2例,男性患者2例,最高發(fā)病年齡52歲,最低發(fā)病年齡42歲,平均發(fā)病年齡46歲,符合常染色體顯性遺傳規(guī)律。先證者體征:神志清楚,言語(yǔ)清晰,顱神經(jīng)檢查未發(fā)現(xiàn)異常,四肢肌力Ⅴ級(jí),肌張力正常,閉目難立征(+),T6以下痛覺(jué)減退,雙下肢末端觸覺(jué)減退,雙側(cè)膝關(guān)節(jié)以下振動(dòng)覺(jué)減退,雙側(cè)腱反射對(duì)稱(chēng)減弱,病理征未引出,頸軟,腦膜刺激征陰性。家系1遺傳家系圖:見(jiàn)圖1(使用中國(guó)遺傳咨詢(xún)網(wǎng)家系圖在線(xiàn)繪制工具繪制)。家系2遺傳家系圖:見(jiàn)圖2(使用中國(guó)遺傳咨詢(xún)網(wǎng)家系圖在線(xiàn)繪制工具繪制)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1pcr擴(kuò)增效果使用TaKaRaDNA提取試劑盒(大連寶生物工程有限公司提供)提取患者靜脈血中DNA。SCA3亞型引物的PCR參照文獻(xiàn)。2%瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)2個(gè)家系SCA3引物PCR擴(kuò)增均發(fā)現(xiàn)異常條帶,考慮為SCA3亞型。使用TaKaRaAgaroseGelDNAPurifiationKitVer.2.0瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(大連寶生物工程有限公司提供)回收DNA。1.2.2菌株的培養(yǎng)和pcr擴(kuò)增家系1先證者SCA3引物PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果,可見(jiàn)400bp大小異常條帶,回收此條帶DNA進(jìn)行純化。將已純化PCR產(chǎn)物使用TaKaRaDNALigationKitVer.2.0(CodeNo.D6022)中的SolutionⅠ直接和載體pMD18-T(CodeNo.D101A)連接,連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化至E.coliCompetentCellJM109中,涂布平板(LB液體培養(yǎng)基),37℃過(guò)夜培養(yǎng),觀察有無(wú)菌落。然后挑取不同白色單個(gè)菌落加入LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5h以上,以此菌液為模板,使用M13-47/RV-M(M13-47堿基序列:CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC;RV-M堿基序列:GAGCGGATAACAATTTCACACAGG)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳檢測(cè)。并同時(shí)移板(LB液體培養(yǎng)基),挑選陽(yáng)性克隆子進(jìn)行基因序列測(cè)定。將選定的含有陽(yáng)性克隆的單菌落進(jìn)行植菌,利用TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.2.0(CodeNo.DV801A)提取質(zhì)粒。在ABIPRISM3130XL型全自動(dòng)DNA測(cè)序儀上使用RV-M引物對(duì)質(zhì)粒測(cè)序。2結(jié)果2.1pcr擴(kuò)增結(jié)果家系1先證者及家系內(nèi)其他患者,均可見(jiàn)一條約250bp基因條帶和一條400bp異?；驐l帶。因等位基因一條來(lái)自父方,一條來(lái)自母方,家系1先證者為父系遺傳,因此250bp基因條帶來(lái)自等位基因的母系基因,400bp異?；驐l帶來(lái)自等位基因的另一條父系異?；?。家系1正常人SCA3PCR產(chǎn)物均可見(jiàn)約250bp正常擴(kuò)增條帶。先證者兒子PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果,未見(jiàn)異常電泳條帶。家系2患者SCA3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳均可見(jiàn)約400bp異常條帶。家系2正常人SCA3PCR產(chǎn)物凝膠電泳擴(kuò)增條帶均可見(jiàn)約250bp左右正常電泳條帶,未見(jiàn)異?；驍U(kuò)增帶。2.2211個(gè)家庭和幾個(gè)疾病特征的結(jié)果見(jiàn)表1。3臨床癥狀和cag重復(fù)序列數(shù)脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)3型是SCA中最為常見(jiàn)2.32個(gè)家系部分患者SCA3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物基因測(cè)序見(jiàn)圖1、圖2、圖3。的類(lèi)型,在漢族人群的脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)中約占50%。SCA3的臨床表型具有高度的遺傳異質(zhì)性和臨床變異性,根據(jù)目前研究,大致分為5種不同臨床亞型,根據(jù)此種分型,家系1患者病情嚴(yán)重,發(fā)病年齡較早,主要表現(xiàn)為小腦體征,同時(shí)伴有嚴(yán)重的錐體系和錐體外系癥狀,部分患者可見(jiàn)突眼,屬于第1種亞型。家系2患者癥狀相對(duì)較輕,起病晚,伴有周?chē)窠?jīng)病變?yōu)槠涮攸c(diǎn),屬于第3種亞型。關(guān)于SCA3亞型發(fā)病機(jī)制,研究表明系由突變的CAG重復(fù)堿基片段編碼含有多聚谷氨酰胺片段的蛋白所致病。正常人與患者的主要區(qū)別表現(xiàn)在CAG重復(fù)數(shù)目的不同,正常人CAG重復(fù)數(shù)目一般為12～41次,患者62～84次。國(guó)內(nèi)謝秋幼報(bào)道,SCA3患者CAG重復(fù)數(shù)目為67～85次。本研究中的2個(gè)SCA3家系患者CAG重復(fù)數(shù)目為51～67次,明顯低于謝秋幼等報(bào)道。且2個(gè)家系患者代間傳遞中有明顯的發(fā)病年齡提前趨勢(shì),從表1可以看出家系1患者發(fā)病年齡第3代比第2代提前,癥狀有加重趨勢(shì);家系2患者發(fā)病年齡第3代比第2代也明顯提前5歲左右,癥狀程度類(lèi)似。家系1患者臨床癥狀在代間傳遞中有明顯的加重趨勢(shì)。在此表中還可看出,2個(gè)家系CAG重復(fù)序列數(shù)在第3代患者中比第2代明顯增多。這也提示臨床癥狀、發(fā)病年齡均與CAG重復(fù)數(shù)目有關(guān),CAG重復(fù)次數(shù)越多發(fā)病年齡越小且癥狀越重,進(jìn)一步證明了此前提到的遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象。遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象主要在父系遺傳中更明顯。家系1先證者屬于父系遺傳,也說(shuō)明了這一點(diǎn)。在家系2先證者屬于母系遺傳,家系2第3代患者中CAG重復(fù)序列數(shù)比第2代CAG序列數(shù)無(wú)明顯增多,雖發(fā)病年齡提前,但癥狀無(wú)加重,需進(jìn)一步搜集病例分析母系遺傳中SCA3的表現(xiàn)。此外,家系1中Ⅲ1CAG重復(fù)序列數(shù)為53次,Ⅲ6CAG重復(fù)序列數(shù)為67次,但Ⅲ1患者發(fā)病年齡比Ⅲ6發(fā)病年齡提前9歲;家系2部分患者中CAG重復(fù)序列數(shù)多于家系1患者,但臨床癥狀卻較家系1患者輕,這種現(xiàn)象可能與遺傳異質(zhì)性有關(guān)。由于不同患者具有不同的遺傳基礎(chǔ),從而導(dǎo)致遺傳方式、病程進(jìn)展、發(fā)病年齡、預(yù)后以及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)、病情嚴(yán)重程度等都可能不同。研究表明,遺傳異質(zhì)性的存在是導(dǎo)致遺傳病病種增多的原因之一。家系2中Ⅰ3、Ⅰ4生前均沒(méi)有共濟(jì)失調(diào)癥狀,死因也可排除SCA類(lèi)疾病,但在子代中出現(xiàn)了發(fā)病患者。這是因?yàn)镃AG重復(fù)片段所在的等位基因具有多態(tài)性的特點(diǎn),如果等位基因攜帶有處于正常與異常之間的CAG重復(fù)數(shù)目(即所謂帶有中間數(shù)目的CAG重復(fù)片段,國(guó)外報(bào)道SCA3一般為48～51次),由于CAG重復(fù)片段的不穩(wěn)定性,在下一代中CAG重復(fù)易發(fā)生新的突變發(fā)病,尤其在父系遺傳中更明顯。因此推測(cè)家系2的Ⅰ3(男性,75歲時(shí)去世)可能攜帶有中間數(shù)目的CAG重復(fù)片段。SCA3癥狀前患者,是指基因檢測(cè)CAG重復(fù)數(shù)目異常,尚無(wú)臨床癥狀的人。由于SCA3是一種遲發(fā)性神經(jīng)變性疾病,因此癥狀前患者達(dá)到一定年齡必定會(huì)出現(xiàn)癥狀。在目前尚無(wú)有效治療方法的情況下,基因?qū)W檢查明確癥狀前診斷防止該病發(fā)生具有重要意義。在本實(shí)驗(yàn)的家系1中,Ⅲ1屬于癥狀前患者,因?yàn)樵诹羧⊙獦訒r(shí),患者尚未出現(xiàn)臨床癥狀,經(jīng)基因檢測(cè)CAG重復(fù)數(shù)目為53次,在隨訪(fǎng)2a后患者出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)癥狀,且發(fā)病年齡較其父親提前,癥狀更重。這也證實(shí)了癥狀前基因診斷預(yù)測(cè)發(fā)