樹突狀細胞對細胞il-10和gf-

樹突狀細胞對細胞il-10和gf-

c型腫瘤的來源、形態(tài)和功能具有明顯的多樣性和異質性，不僅能誘導t細胞的激活，而且在誘導中腸炎和外圍抵抗方面也發(fā)揮著非常重要的作用。DC的不同成熟狀態(tài)有著不同的功能。DC的成熟狀態(tài)不僅決定T細胞的激活程度,而且還決定T細胞的反應類型。未成熟DC可誘導T細胞無能或調節(jié)性T細胞的產生,從而誘導免疫耐受。本研究旨在探討未成熟DC對T細胞功能的影響及其可能機制。1材料和方法1.1細胞因子和tgf-1的分子RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、逆轉錄試劑盒、TRIZOL為美國Gibco公司產品。PCRMarker購自大連寶生物公司。細胞因子rrIL-2、rrIL-4、rrGM-CSF均為Sigma公司產品。兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體購自SantaCruz公司。乙酰膽堿受體(AChR)由本實驗室提取。健康雄性Lewis大鼠,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。1.2ova負載的dc按本實驗室已有方法培養(yǎng)DC。收集疏松黏附于培養(yǎng)板底的DC,第6天加入LPS的同時,未成熟組和成熟組分別加入50μg/ml的AChR或50μg/ml的OVA,置37℃、5%的CO2孵箱中,用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18h即得AChR負載的iDC(AChR+iDC)、AChR負載的mDC(AChR+mDC)和OVA負載的mDC(OVA+mDC)。充分洗滌后重懸于RPMI-1640完全培養(yǎng)基,加入終質量濃度為25μg/ml的絲裂霉素C,于37℃孵育30min滅活后,以RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌3次,調整細胞數為4×105/ml作為刺激細胞。1.3混合淋巴結反應1.3.1u3000不同濃度的il-2擴增t細胞尼龍毛柱法分離Lewis大鼠脾臟T細胞。取24孔培養(yǎng)板,每孔分別加入106T細胞,再加入105AChR負載的iDC或mDC刺激,用完全培養(yǎng)基調整終體積為1ml。置37℃、5%的CO2孵箱中培養(yǎng)。第6天加入終濃度為100U/ml的IL-2擴增T細胞。2周后,同前條件加入105AChR負載的iDC或mDC再次刺激。再次刺激后第3天加入終濃度為100U/ml的IL-2擴增T細胞。再次刺激1周后,同條件加入105AChR負載的iDC或mDC行第3次刺激。第3次刺激后第3天加入終濃度為100U/ml的IL-2擴增T細胞。1.3.2免疫活性測定取96孔培養(yǎng)板,每孔分別加入2×105AChR負載的DC重復刺激前的T細胞作反應細胞(NT);再分別加2×104、1×104、5×103AChR負載的iDC或mDC作刺激細胞,終體積為200μl;每濃度設3個復孔。37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。4d后每孔加入5mg/ml的MTT20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心棄上清,每孔加入DMSO100μl,測各孔490nm波長的光密度值(A490nm),結果以3孔均值表示。同前方法,反應細胞改為AChR負載的iDC或mDC重復刺激3次后的T細胞(iDC-3T或mDC-3T),測定其對AChR負載的iDC或mDC的增殖活性。同前方法,刺激細胞改為OVA負載的mDC,測定AChR負載的iDC或mDC重復刺激3次后的T細胞對OVA負載的mDC刺激的增殖活性。1.4基于-actin的生物合成工藝收集AChR負載的iDC或mDC初次刺激前、初次刺激后和重復刺激3次后的各組T細胞,用TRIZOL試劑提取細胞總RNA。在逆轉錄酶M-MLV的作用下,將mRNA逆轉錄成cDNA分子。然后通過PCR擴增IL-12p35和參照β-actin的cDNA。IL-10的上游引物為:5′-AGGGCTGCCTTCAGTC-3′,下游引物為:5′-TGGAGAGAGGTACAAACG-3′,擴增產物長度為499bp。β-actin的上游引物為:5′-AGCAGAGAATGGAAAGTCAAA-3′,下游引物為:5′-ATGCTGCTTACATGTCTCGAT-3′,擴增產物長度為266bp。PCR總反應體積50μl。反應條件為:94℃預變性5min,94℃變性30s,48℃(β-actin為54℃)退火30s,72℃延伸45s,共進行32個循環(huán),72℃加強延伸7min。將10μl擴增產物于瓊脂糖凝膠電泳,紫外透射儀下觀察并攝像。1.5蛋白質電泳檢測收集AChR負載的iDC或mDC初次刺激前、初次刺激后和重復刺激3次后的各組T細胞,提取蛋白質并在595nm波長下進行檢測蛋白濃度。制備SDS凝膠后進行蛋白質電泳。在SDS凝膠上進行蛋白質的電轉移并進行免疫檢測。1.6比較方法:最小顯著差數據以ue0af±s表示,多個實驗組間比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA),兩兩比較采用最小顯著差(LSD)法。兩組之間的比較采用t檢驗。以α=0.05為檢驗顯著性水準。2結果2.1淋巴結移植的測定2.1.1t細胞增殖能力的檢測AChR+mDC初次和重復刺激均能誘導強烈的T細胞增殖。而AChR+iDC初次和重復刺激均只引起較弱的T細胞增殖,重復刺激后T細胞增殖能力更低,見表1。2.1.2t細胞對acrt-mdc的增殖AChR+mDC重復刺激3個循環(huán)后的T細胞對AChR+iDC的刺激引起較弱的增殖反應,而AChR+iDC重復刺激3個循環(huán)后的T細胞對AChR+mDC的刺激不引起增殖。AChR+mDC和AChR+iDC重復刺激3個循環(huán)后的T細胞均能對無關抗原OVA負載的mDC的刺激產生明顯增殖,前者增殖反應更強,見表2。2.2acrt-icp初次和第3次重復刺激il-10morna的表達5組T細胞β-actinmRNA表達恒定,無明顯差異,表明該實驗方法可靠,結果具有可比性。AChR+mDC初次和第3次重復刺激后,IL-10mRNA的表達較刺激前無明顯變化,而AChR+iDC初次和第3次重復刺激后,IL-10mRNA的表達較刺激前均明顯增高,見圖1。2.3TGF-β1的表達AChR+mDC初次和第3次重復刺激后,TGF-β1的表達較刺激前無明顯變化,而AChR+iDC初次和第3次重復刺激后,TGF-β1的表達均顯著增高,重復刺激后TGF-β1的增高尤為明顯,見圖2。3調節(jié)性t細胞的誘導DC不僅可激活T細胞免疫,同時也可誘導中樞和外周耐受。DC提呈抗原最終表現(xiàn)為免疫激活還是免疫耐受的決定因素目前尚不十分清楚。一種觀點認為,機體內存在不同的DC亞群,它們分別負責不同的功能,如髓樣DC激活免疫反應而淋巴樣DC則誘導免疫耐受。但近來研究表明,DC亞群的功能并非一成不變的,如從人的前體細胞分化而來的DC,對不同的活化刺激物表現(xiàn)出不同的反應,而大鼠未成熟髓樣DC可誘導耐受。因此,這種一類細胞對應一類免疫反應的觀念受到了挑戰(zhàn),并提出了另外一種觀點:DC的不同成熟狀態(tài)有著不同的功能。未成熟DC表面MHC、共刺激分子及其它輔助分子的表達水平較低,所以雖然它們具有很強的抗原攝取加工能力,但由于缺少第一和/或第二信號的刺激而不能活化T細胞,導致T細胞的無能或低反應性,從而誘導抗原特異性耐受。未成熟DC可誘導T細胞無能并顯著延長移植物的存活時間。抗原負載的未成熟DC可誘導1型糖尿病耐受。體外實驗發(fā)現(xiàn),未成熟DC可誘導抗原特異性T細胞無能。受者T細胞與供者未成熟DC共同培養(yǎng)后,當再用供者免疫源性DC刺激時,細胞因子的分泌明顯減少且T細胞呈現(xiàn)明顯的低反應性。本研究中,AChR負載的mDC初次和重復刺激均能誘導強烈的T細胞增殖,而AChR負載的iDC初次和重復刺激均只引起微弱的T細胞增殖;當這些經AChR負載的iDC重復刺激3個循環(huán)后的T細胞再用AChR負載的mDC刺激時,也不能引起T細胞增殖;但當用無關抗原OVA負載的mDC刺激時,則產生明顯的增殖反應。提示未成熟DC可引起T細胞耐受,且這種耐受是抗原AChR特異性的。調節(jié)性T細胞是機體內具有特殊表面標志和細胞因子分泌模式并具有調節(jié)功能的一個T細胞群體,其抑制功能在外周耐受的維持中具有十分重要的作用。調節(jié)性T-1(Tr1)細胞不同于Th1/Th2細胞,它們產生大量的IL-10、中量的TGF-β、少量的IL-2但無IL-4。Tr1受到刺激后增殖能力很弱,但在體內外均具有免疫抑制功能,這種免疫抑制功能主要通過細胞因子IL-10和TGF-β而發(fā)揮,細胞間的直接接觸也起重要作用。調節(jié)性T細胞的產生與DC的成熟狀態(tài)密切相關,人類未成熟DC在體內外均可通過誘導具有調節(jié)能力的非增殖性Tr樣細胞的分化引起外周耐