無菌檢驗操作規(guī)程

無菌檢驗操作規(guī)程醫(yī)療器械產(chǎn)品無菌檢驗操作規(guī)程1目的經(jīng)過無菌檢驗,確保滅菌后產(chǎn)品能夠達到無菌的要求。2適用范圍適用于滅菌后醫(yī)療器械產(chǎn)品的無菌檢驗。3檢驗依據(jù)《中國藥典》(GB14233.2-醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第二部分:生物試驗方法GB15980-1995一次性使用醫(yī)療用品衛(wèi)生標準4儀器、設備超凈工作臺、電熱干燥箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱、壓力蒸汽滅菌器、集菌儀(器、電子天平、PH計、冰箱、恒溫水浴鍋、酒精燈、三角燒瓶,接種環(huán)、無菌棉簽、鑷子,試管架,大試管若干等。5無菌檢驗室的環(huán)境要求5.1無菌檢驗應在環(huán)境潔凈度10000級下的局部百級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行。5.2緩沖區(qū)與外界環(huán)境、無菌檢驗室與緩沖區(qū)之間空氣應保持正壓,陽性對照室與緩沖區(qū)之間空氣應保持負壓。無菌檢驗室與室外大氣之間靜壓差應大于10Pa。無菌檢驗室的室溫應保持18~26℃,相對濕度:45~65%。5.3無菌檢驗室的單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū)懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標準進行懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的監(jiān)測。每年至少檢測一次。5.4無菌檢驗過程中應同時檢查超凈工作臺單向流空氣中的菌落數(shù):每次操作時在層流空氣所及臺面的左中右置3個營養(yǎng)瓊脂平板,暴露30min,于30~35℃培養(yǎng)48小時,菌落數(shù)平均應不超過1CFU/平板。6無菌檢驗前的準備6.1器具滅菌、消毒6.1.1滅菌:試驗過程中與供試品接觸的所有器具必須采用可靠方法滅菌。可經(jīng)電熱干燥箱160℃以上干烤2小時,或置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121℃蒸汽滅菌30分鐘后使用(根據(jù)滅菌效果驗證決定滅菌參數(shù)。所有的滅菌物品不應超過2周即用畢,否則應重新滅菌。6.1.2消毒:凡檢驗中使用的器材無法滅菌處理的,使用前必須經(jīng)消毒處理。如無菌檢驗室的試管架、電子天平、工作臺面、工作人員的手、橡膠吸頭等?？刹捎孟緞┙莼虿潦谩Ｏ緞吭赂鼡Q,以防止產(chǎn)生耐藥菌株。6.1.3標識:器具的滅菌、消毒后必須做好標識,標明滅菌、消毒時間和使用有效期。6.2人員、物料進入無菌檢驗室6.2.1開啟紫外線燈或臭氧發(fā)生器進行空間滅菌處理,消毒時間不得少于30min。6.2.2物料進入無菌檢驗室流程6.2.2.1脫包:進入無菌檢驗室的物品若有雙重包裝的,需將外包裝在傳遞窗/緩沖間拆除后,傳入試驗室。6.2.2.2消毒:進入無菌操作室的所有培養(yǎng)基、供試品等的外表都應采用適用的方法進行消毒處理,以避免將外包裝污染的微生物帶入無菌檢驗室。6.2.2.3傳遞:查看所有進入無菌檢驗室的器具上的滅菌、消毒標識,是否在有效期內(nèi)。符合要求的經(jīng)傳遞窗傳入無菌檢驗室。6.2.3人員進入無菌檢驗室流程6.2.3.1更鞋脫衣:在一更區(qū)脫去一般區(qū)工作鞋,穿上無菌檢驗室工作鞋;脫去一般區(qū)工作服。6.2.3.2洗手:首先用肥皂或洗手液在手上揉擦出泡沫,再用流水連續(xù)沖洗20秒,洗凈泡沫。6.2.3.3更衣:在二更區(qū)按照從上到下的順序穿戴無菌工作服(包括衣、帽、口罩等,要求褲子掖在上衣里,口罩掩住口鼻,帽子包裹所有頭發(fā)。6.2.3.4手消毒:用消毒液浸泡雙手5秒以上或用浸過消毒液的棉球擦拭雙手。消毒液可用洗必泰、新潔爾滅、碘伏、75%酒精等。6.2.3.5人員進入:經(jīng)緩沖間進入無菌檢驗室。6.2.4人員進入無菌檢驗室后,進一步用消毒液擦拭工作臺面,戴無菌手套。7無菌檢驗操作要求7.1全過程必須嚴格執(zhí)行無菌操作,防止微生物污染。7.2使用玻璃器皿應輕取輕放,避免破損,以防培養(yǎng)物擴散。7.3所有操作均應在近火焰區(qū)進行,且不得有大幅度或快速動作,以免攪動空氣中的塵埃微粒。7.4使用金屬接種器具時,用前、用后均需灼燒滅菌。7.5在接種培養(yǎng)物時,動作應輕、準,防止培養(yǎng)物濺出,產(chǎn)生汽溶膠,造成污染。7.6操作過程中所有的帶菌物品,用后均應作消毒、滅菌處理。可在檢驗過程中隨用隨時放入消毒液缸內(nèi)浸泡或消毒桶內(nèi),或在檢驗完成后經(jīng)傳遞窗傳至一般區(qū),立即用壓力蒸汽滅菌鍋121℃滅菌30分鐘。8培養(yǎng)基制備8.1需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基(硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的制備8.1.1所用試劑酪胨(胰酶水解15.0%葡萄糖5.0gL-胱氨酸0.5g硫乙醇酸鈉0.5g(或硫乙醇酸(0.3ml酵母浸出粉5.0g氯化鈉2.5g新配制的0.1%刃天青溶液1.0ml瓊脂0.75g水1000ml8.1.2制備除葡萄糖和刃天青溶液外,取上述成分混合,微溫溶解,調(diào)節(jié)pH為弱堿性,煮沸,濾清,加入葡萄糖和刃天青溶液,搖勻,調(diào)節(jié)pH為7.1±0.2。8.1.3硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)劑氧化層的顏色要求在供試品接種前,培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5,否剛需經(jīng)100℃水浴加熱到粉紅色消失(不超過20分鐘迅速冷卻,只限加熱一次,并應防止被污染。8.2霉菌培養(yǎng)基(改良馬丁培養(yǎng)基的制備8.2.1所用試劑胨5.0g酵母浸出粉2.0g葡萄糖20.0g磷酸二氫鉀1.0g硫酸鎂0.5g水1000ml8.2.2制備除葡萄糖外,取上述成分混和,微溫溶解,調(diào)節(jié)pH值約為6.8,煮沸,加葡萄糖溶解后,搖勻,濾清,調(diào)節(jié)pH為6.4±0.2。8.3還可使用按處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基,按照使用說明書配制。8.4培養(yǎng)基配制后應盡快滅菌,避免微生物繁殖。一般采用高壓蒸汽121℃滅菌30分鐘。8.5制備好的培養(yǎng)基應在2~25℃保存,在3周內(nèi)使用。8.6培養(yǎng)基的無菌性檢查每批配制的培養(yǎng)基均應進行無菌性檢查(可與產(chǎn)品無菌檢驗同步進行。檢查時,每批培養(yǎng)基隨機取不少于5支(瓶培養(yǎng)14天,應無菌生長。9稀釋液、沖洗液的制備9.10.1%蛋白胨水溶液取蛋白胨1.0g,加水1000ml,微溫溶解,濾清,分裝后置入壓力蒸汽滅菌器內(nèi),121℃滅菌30分鐘后,于4℃保存?zhèn)溆谩?分裝后置入壓力蒸汽滅菌器內(nèi),121℃滅菌30分鐘后,于4℃保存?zhèn)溆?.2pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液取磷酸二氫鉀3.56g、磷酸氫二鉀7.23g、氯化鈉4.30g、蛋白胨1.0g,加水1000ml。微溫溶解,濾清,分裝后置入壓力蒸汽滅菌器內(nèi),121℃滅菌30分鐘后,于4℃保存?zhèn)溆谩?.3浸提介質(zhì):9g/L無菌氯化鈉溶液,可直接從有證單位采購大輸液。10對照菌液制備10.1無菌檢驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代。10.2取金黃色葡萄球的普通瓊脂斜面培養(yǎng)物,接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基內(nèi),在30~35℃培養(yǎng)18~24h后備用,同時制備0.9%氯化鈉溶液加入在6支小試管內(nèi),每支試管內(nèi)加9.0ml的0.9%氯化鈉溶液,在壓力鍋內(nèi)經(jīng)121℃滅菌30min備用。將已配好的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)菌液取1.0ml加入第一支小試管內(nèi),稀釋成濃度1:10的菌液;取第一支試管內(nèi)1.0ml菌液加入第二支小試管內(nèi),稀釋成濃度1:100的菌液,同法稀釋成濃度1:106(每ml含菌量≤100CFU即可。10.3采用平皿計數(shù)法測定活菌數(shù)。11無菌檢驗培養(yǎng)溫度硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基,置30~35℃培養(yǎng)。改良馬丁培養(yǎng)基,置23~28℃培養(yǎng)。12無菌檢驗12.1如產(chǎn)品注冊標準中明確“產(chǎn)品應經(jīng)過一個確認過的滅菌過程”,則執(zhí)行12.1項下各項。12.1.1放樣每個滅菌批次按已驗證的滅菌工藝,在滅菌柜內(nèi)相應的位置放置適量菌片,滅菌后對菌片進行無菌檢驗。12.1.2菌片貯存滅菌前、后菌片應按菌片說明書規(guī)定條件保存。12.1.3接種開啟生物安全柜,在此環(huán)境下,分別將滅菌后的菌片成對放入已滅菌的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中。同時以未滅菌的菌片作陽性對照,以未接種的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和未接種的改良馬丁培養(yǎng)基作為陰性對照。12.1.4培養(yǎng)陽性對照管于30~35℃細菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)48~72小時。其余硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基于30~35℃培養(yǎng)7天。改良馬丁培養(yǎng)基于23~28℃培養(yǎng)7天。12.1.5結果判定培養(yǎng)后,陽性對照應有菌生長,陰性對照和被檢樣品未見需氣菌、厭氣菌和霉菌生長的為合格。12.2如產(chǎn)品注冊標準中明確產(chǎn)品應進行無菌檢驗,則執(zhí)行12.2.1~12.2.5。12.2.1抽樣根據(jù)各自的產(chǎn)品注冊標準和相應產(chǎn)品出廠檢驗規(guī)程的規(guī)定,對成品庫內(nèi)的產(chǎn)品進行抽樣。一般同一個滅菌批產(chǎn)品檢驗3~11個單位供試品。12.2.2供試液準備優(yōu)先采用將供試品或其有代表性的各部分直接投放入培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的方法,如供試品不適宜直接投放,可按下列方法制備供試液,應使浸提介質(zhì)充分洗提供試品的浸提表面,供試液制備應按無菌操作法進行,在制備后2小時內(nèi)使用。根據(jù)供試品具體特性選擇下列方法:a管類器具：按管內(nèi)表面積每10cm2流過管內(nèi)腔1ml浸提介質(zhì)，流量約為10ml/min，收集到無菌的容器內(nèi)。b容器類器具：按容器內(nèi)表面積每10cm2加入浸提介質(zhì)1ml的比例，振搖數(shù)c實體類器具：實體類器具按表面及每10cm2加入浸提介質(zhì)1ml，振搖數(shù)次。收集上述沖洗液或浸提介質(zhì)于無菌容器中。12.2.3接種12.2.3.1薄膜過濾法：優(yōu)先采用封閉式薄膜過濾器（集菌器），也可使用開放式薄膜過濾器。濾膜孔經(jīng)不大于0.45μｍ。濾器和濾膜使用前應采用適宜的方法滅菌，或直接采用無菌集菌器。a、如采用封閉式薄膜過濾器，取一副三聯(lián)式集菌器，將供試液經(jīng)過集菌儀過濾，使經(jīng)過每只培養(yǎng)管的量基本均勻。然后經(jīng)過集菌儀一只加120ml改良馬丁培養(yǎng)基，另兩只分別加入120ml硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（其中一只做陽性對照，內(nèi)加金黃色葡萄球菌液1ml）。另取一副二聯(lián)集菌器，用同批的沖洗液或浸提介質(zhì)120ml經(jīng)過集菌儀過濾（每只約50ml），同法一只加硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基120ml，另一只加改良馬丁培養(yǎng)基120ml分別作陰性對照。b、如用一般薄膜過濾器，將供試液過濾后取出濾膜，將其剪成3等份，分別置于含50ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基的容器中，其中兩份作檢驗，一份作陽性對照。12.2.3.2直接接種法：適用于一次性使用注射針、一次性使用靜脈輸液針（包括輸液器、輸血器、注射器配套使用注射針）。a、敷料供試品：取規(guī)定數(shù)量，每個包裝以無菌操作拆開，于不同部位剪取約120mg或1cm×3cm的供試品，接種于各管足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。b、無菌針頭：直接投入含15ml以上硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基的容器中。c、一次性使用的材料：拆散或切成小碎斷，接種于各管足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。供試品按規(guī)定量分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基的容器中，其中一份作陽性對照。每個容器中培養(yǎng)基的用量應符合：接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，或培養(yǎng)基的裝量足以浸沒供試品。每管培養(yǎng)基的最低用量——硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml.12.2.4培養(yǎng)、觀察上述含培養(yǎng)基的容器分別置規(guī)定溫度的恒溫培養(yǎng)箱中，除陽性對照管培養(yǎng)48～72小時外，其余管培養(yǎng)14天。培養(yǎng)期間應逐日觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后、或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生產(chǎn)，可取該培養(yǎng)液適量轉種至同種新鮮培養(yǎng)基中或劃線接種于斜面培養(yǎng)基上，細菌培養(yǎng)2天，真菌培養(yǎng)3天，觀察是否再出現(xiàn)渾濁或斜面有無菌生長；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。12.2.5結果判斷培養(yǎng)結束后，陽性對照管應有菌生長，陰性對管應澄清。否則，就判結果無效。所有供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定。若供試品管中任何1管顯渾濁并確證有菌生長判供試品不符合規(guī)定。以一次檢出為準，不得復試。當符合下列至少一個條件時，可判試驗結果無