北極冰雪海泥中16srdna冷適應(yīng)細(xì)菌的分離及低溫酶檢測(cè)

北極冰雪海泥中16srdna冷適應(yīng)細(xì)菌的分離及低溫酶檢測(cè)

冷適應(yīng)微生物的資源豐富。近年來，歐洲、美國(guó)和日本的科學(xué)家在應(yīng)用于極微生物的潛在應(yīng)用方面做了大量工作，取得了很大進(jìn)展。中國(guó)在這一方向上的研究相對(duì)緩慢。應(yīng)用低溫微生物具有以下優(yōu)勢(shì):有利于防止微生物污染,尤其是在連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)系統(tǒng)中同源的中溫酶不活潑;經(jīng)過溫和的熱處理即可使低溫酶的活力喪失,而且低溫或適溫處理不會(huì)影響產(chǎn)品的品質(zhì)。對(duì)北極海泥菌群的初步鑒定及研究,以期為國(guó)內(nèi)冷適應(yīng)微生物資源開發(fā)利用提供部分參考。1材料和方法1.1中心惠贈(zèng)與表采集自北極海域的海洋沉積物樣品,由中國(guó)極地研究中心惠贈(zèng):B12(2024m)、N01(3333m)、P23(2028m)、R15(1732m)、P37(2216m)。1.2水、海水、ph2216E海洋細(xì)菌培養(yǎng)基:蛋白胨5g、酵母粉1g、檸檬酸鐵0.1g、瓊脂18g、陳海水1000mL、pH8。將5個(gè)海泥樣品稀釋后涂布在2216E培養(yǎng)基上,4℃倒置培養(yǎng)7d左右挑取形態(tài)不同的單菌落,在2216E培養(yǎng)基上純化后得到8株菌,保種轉(zhuǎn)入-80℃保存。1.3菌株16srdna分析1.3.1形態(tài)觀察和生理生化試驗(yàn)菌株的生理生化特征根據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)進(jìn)行。1.3.2溫度生長(zhǎng)試驗(yàn)將8株菌接入2216E培養(yǎng)基分別放到4℃、15℃、28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)10d左右,觀察生長(zhǎng)狀況(表1)。冷適應(yīng)微生物根據(jù)其生長(zhǎng)溫度特性可細(xì)分為兩類,一類是必須生活在低溫條件下且其最高生長(zhǎng)溫度不超過20℃、最適生長(zhǎng)溫度在巧15℃、在0℃可生長(zhǎng)繁殖的微生物稱嗜冷菌;另一類其最高生長(zhǎng)溫度高于20℃、最適溫度高于15℃、在0-5℃可生長(zhǎng)繁殖的微生物稱為耐冷菌。根據(jù)此為判斷依據(jù):N011、P371、P372為耐冷菌,P231、R151、R152、N013、N014為嗜冷菌。1.3.4基因組DNA的提取和16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育分析提取細(xì)菌染色體DNA,菌株16SrDNA序列PCR擴(kuò)增參照文獻(xiàn)進(jìn)行。擴(kuò)增16SrDNA的正向引物為27F:5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′(對(duì)應(yīng)于E.coil16SrDNA序列的第8-27個(gè)堿基位置),反向引物1492R:5′-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3′(對(duì)應(yīng)于E.coli16SrDNA的第1492-1510個(gè)堿基位置)。100μL的PCR反應(yīng)體系:1×PCR緩沖液,1.5mmol/LMgC12,4×dNTP混合物各200μmol/L,引物各0.5μmol/L,TaqDNA聚合酶1μL(5U/μL),2μLDNA原液。PCR反應(yīng)條件:96℃預(yù)變性6min;94℃變性1min,50℃復(fù)性lmin,72℃延伸2min,30個(gè)循環(huán);最后72℃溫育6min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后,直接交由上海生工生物工程技術(shù)公司進(jìn)行純化和序列測(cè)定。將測(cè)定的基因序列輸入GenBank,獲得收錄號(hào)。并運(yùn)用Blast程序與數(shù)據(jù)庫中已存在的細(xì)菌16SrDNA核酸序列進(jìn)行相似性比較分析。序列的比較采用MEGA(4.0)軟件,用Neighbor-Joining法得到系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹。2結(jié)果與分析2.1低溫酶生理生化試驗(yàn)結(jié)果表明,細(xì)菌生活在高鹽高輻射的南極,其耐鹽的能力強(qiáng),并且有多株細(xì)菌產(chǎn)低溫酶類:N014產(chǎn)淀粉酶,R151產(chǎn)明膠酶,P371產(chǎn)纖維素酶(表2)。2.2srda序列的同源性5株嗜冷菌經(jīng)PCR測(cè)序分別獲得部分序列:P231(910bp)、R151(888bp)、R152(909bp)、N013(893bp)、N014(896bp)。通過與GenBank核酸序列庫中的序列進(jìn)行局部同源性比較(BLAST),結(jié)果表明,P231與Colwelliarossensis的16SrDNA序列有較高的同源性,其中與Colwelliasp.EM0379有98.8%的同源性;R151與Psychrobacterfrigidicola的16SrDNA序列有較高的同源性,其中與Psychrobactercellerstrain23有98.9%的同源性;R152與Marinobacterguineae的16SrDNA序列有較高的同源性,其中與Marinobactersp.BSi20018有99.2%的同源性;N013與Pibocellaponti的16SrDNA序列有較高的同源性,其中與Pibocellasp.MOLA312有99.7%的同源性;N014與Marinobactersegnicrescens的16SrDNA序列有較高的同源性,其中與Marinobactersp.ANT8277有99.2%的同源性。一般認(rèn)為,16SrDNA序列同源性大于99%,可以認(rèn)為屬于同一個(gè)種;16SrDNA序列同源性小于98%,可以認(rèn)為屬于不同的種;同源性小于95%,可以認(rèn)為屬于不同的屬。通過構(gòu)建五株嗜冷菌的進(jìn)化樹可以確定P231屬于科爾維爾氏菌屬(Colwellia)(圖1)、R151屬于嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)(圖2)、R152屬于海桿菌屬(Marinobacter)(圖3)、N013屬于極地桿菌屬(Pibocella)(圖4)、N014屬于海桿菌屬(Marinobacter)(圖5)。3淀粉酶的產(chǎn)酶系統(tǒng)成分冷適應(yīng)細(xì)菌由于生活環(huán)境的特殊-低溫高鹽,所產(chǎn)酶在較低溫度時(shí)具有較高的活性,由于反應(yīng)溫度較低,不但在低溫條件下可以高效反應(yīng),而且在生產(chǎn)工藝中可以通過較低溫度的熱處理使酶失活,節(jié)約能量與費(fèi)用,成為人們研究開發(fā)的熱點(diǎn)。近年來對(duì)于低溫酶結(jié)構(gòu)方面的研究普遍認(rèn)為低溫酶的結(jié)構(gòu)柔韌性強(qiáng)和分子表面的離子對(duì)含量少是其能在低溫維持高活性的主要原因。淀粉酶在食品、醫(yī)藥、洗滌、造紙、紡織方面有著非常廣泛的應(yīng)用前景,酶在較低溫度具有較高活性,具有開發(fā)的現(xiàn)實(shí)意義。明膠酶在腫瘤抑制、脫色工藝上有著良好作用,纖維素