南方根結(jié)線蟲(chóng)活性放線菌的篩選與活性鑒定

南方根結(jié)線蟲(chóng)活性放線菌的篩選與活性鑒定

根結(jié)線蟲(chóng)是一種破壞各種作物根系的堅(jiān)固內(nèi)生植物致病性線蟲(chóng)。由于其廣泛的內(nèi)生植物寄生蟲(chóng)類型，且易于傳播和傳播，已成為世界上最具破壞力的土壤傳遞源之一，給許多國(guó)家的林業(yè)、園藝等行業(yè)帶來(lái)了巨大的破壞。在我國(guó)的溫帶及寒冷地區(qū)的溫室中都有根結(jié)線蟲(chóng)的發(fā)生,特別在熱帶、亞熱帶地區(qū),蟲(chóng)卵無(wú)需休眠越冬,根結(jié)線蟲(chóng)的危害十分普遍。在根結(jié)線蟲(chóng)病害的防治方法中,化學(xué)防治一直占據(jù)著主要地位,但大量高毒高殘留殺線蟲(chóng)藥劑長(zhǎng)期使用所帶來(lái)的人畜中毒及環(huán)境污染等一系列負(fù)面效應(yīng)正日趨明顯,生物防治線蟲(chóng)病害已成為符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略理念的首選措施。在眾多的線蟲(chóng)生防資源中,篩選線蟲(chóng)生防菌,開(kāi)發(fā)利用高活性的生防菌株是根結(jié)線蟲(chóng)生物防治的一個(gè)重要環(huán)節(jié),對(duì)線蟲(chóng)防控具有十分重要的意義。目前世界各國(guó)研究較多的根結(jié)線蟲(chóng)生防菌主要有真菌、細(xì)菌和放線菌。在生物防治研究領(lǐng)域,利用生物源天然物質(zhì)控制抑殺線蟲(chóng)被證明是一種有效的防治途徑,從微生物代謝產(chǎn)物中開(kāi)發(fā)具有殺線蟲(chóng)活性的物質(zhì)是國(guó)內(nèi)外都很重視的一個(gè)研究課題。本課題組從海南東寨港紅樹(shù)林海泥和五指山原始森林等地的土壤中采集樣品,從中分離篩選具有抗根結(jié)線蟲(chóng)活性的放線菌,本文報(bào)道了高效菌株HA10002分離篩選、分類鑒定及其活性物質(zhì)的研究結(jié)果。1材料和方法1.1培養(yǎng)基的制備從海南東寨港紅樹(shù)林采集海泥樣品9份,從五指山原始森林、儋州熱帶植物園、瓊海及定安根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病胡椒園采集土壤樣品51份。放線菌分離采用高氏1號(hào)合成培養(yǎng)基,添加0.005%的K2Cr2O7作為真菌、細(xì)菌抑制劑;放線菌發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:玉米粉10.0g,大豆粉10.0g,可溶性淀粉5.0g,K2HPO40.5g,蒸餾水1000mL,pH7.2。由于海洋微生物長(zhǎng)期生活在含鹽的海水環(huán)境中,為提高分離效果,對(duì)于紅樹(shù)林樣品,培養(yǎng)基中的蒸餾水改用750mL陳海水+250mL蒸餾水。1.2南方根結(jié)線蟲(chóng)的誘導(dǎo)養(yǎng)殖南方根結(jié)線蟲(chóng)(M.incognita)由本室盆栽保存。保存方法:從海南省農(nóng)科院植保所獲得經(jīng)鑒定純化保存的南方根結(jié)線蟲(chóng),在寄主根部挑取純種卵囊孵化出2齡幼蟲(chóng)(J2)水溶液,接種于用滅菌土培育的盆栽番茄根部,溫室內(nèi)繁殖保存。需要靶標(biāo)線蟲(chóng)時(shí),從感染根部挑取卵囊,消毒清洗后置于淺盤濾紙上恒溫遮光孵化,制備2齡線蟲(chóng)液。1.3單菌落純化將土壤及海泥樣品經(jīng)處理制成的水懸液作梯度稀釋,分別涂布于分離培養(yǎng)基平板,28℃倒置培養(yǎng)。5~7d后,經(jīng)肉眼觀察判斷菌落的差異,挑取單菌落純化、保存。菌株分別接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,200r/min、28℃搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng),7d后離心,取發(fā)酵液上清,用于活性檢測(cè)。1.4線蟲(chóng)主長(zhǎng)線的確定初篩取0.2mL(約200條J2)線蟲(chóng)液和1mL發(fā)酵液分別加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,混勻,25~28℃靜置24h后倒置顯微鏡下觀察,蟲(chóng)體僵直不動(dòng)視作被擊倒,計(jì)算校正擊倒率;將被擊倒的線蟲(chóng)吸入清水中24h后鏡檢,不能復(fù)活的算作死亡,計(jì)算線蟲(chóng)校正死亡率。每處理3次重復(fù),并設(shè)立無(wú)菌空白發(fā)酵培養(yǎng)基處理作為對(duì)照。復(fù)篩選取線蟲(chóng)校正死亡率在80%以上的菌株,并將發(fā)酵液分別作2、5、10倍和20倍稀釋后再處理線蟲(chóng),方法同1.4.1,觀察記錄活性情況。1.5生理生化特征鑒定菌株的培養(yǎng)及形態(tài)特征的觀察參照閻遜初的方法進(jìn)行;生理生化特征鑒定參照Lechevalier等的方法進(jìn)行;以16SrDNA序列為基礎(chǔ),參照曾慶飛等的方法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。1.6活性部分的分離純化過(guò)濾收集發(fā)酵液,乙酸乙酯萃取獲得浸膏,通過(guò)硅膠柱(粗孔2CX-II)層析、SephadexLH-20柱色譜等對(duì)所得浸膏進(jìn)行分離純化。純化過(guò)程中采用1.4所述的測(cè)定方法進(jìn)行活性跟蹤以確定活性部位,對(duì)活性部分采用HSGF254高效薄層板進(jìn)行薄層層析分析,合并層析帶型相同及相似的組分,并進(jìn)行純度檢測(cè)。采用UV(使用BeckmanCoulterDu800核酸蛋白分析儀)、MS(使用MAT-4510質(zhì)譜儀)和NMR(使用AM-400、核磁共振儀)等技術(shù),結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),對(duì)分離到的活性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。2結(jié)果與分析2.1復(fù)篩和繼代培養(yǎng)在9份海泥樣品中分離得到93株菌落特征各不相同的放線菌,從51份土壤樣品中分離獲得263株菌落特征有差異的菌株。初篩獲得16株線蟲(chóng)校正死亡率在80%以上的菌株,占供試菌株的4.5%;復(fù)篩獲得3株線蟲(chóng)校正死亡率在95%以上的菌株,其中菌株HA10002的發(fā)酵液活性最高,24h內(nèi)線蟲(chóng)校正死亡率為100%,稀釋20倍后其校正死亡率仍達(dá)58.5%。采用含75%陳海水的高氏1號(hào)培養(yǎng)基對(duì)菌株連續(xù)進(jìn)行5次繼代培養(yǎng),同步進(jìn)行線蟲(chóng)拮抗活性試驗(yàn),結(jié)果表明,其產(chǎn)生殺線蟲(chóng)活性物質(zhì)的遺傳性保持穩(wěn)定。因此選取分離自東寨港紅樹(shù)林海泥樣品中的菌株HA10002作為進(jìn)一步的研究對(duì)象。2.2ha10002的識(shí)別結(jié)果2.2.1甘油天門冬素的分離和生長(zhǎng)菌株HA10002在JCM、Sauton’s、土豆汁、燕麥汁、高氏1號(hào)、甘油天門冬素等6種固體培養(yǎng)基上均生長(zhǎng)良好,形成豐富的氣生菌絲和基內(nèi)菌絲,氣絲白色、淺灰白至灰色,基絲乳白至淺棕色(圖1a),在6種培養(yǎng)基上未見(jiàn)可溶性色素生成;孢子絲成螺旋彎曲,可見(jiàn)1~2級(jí)輪生,孢子圓球形(圖1b)。2.2.2露糖和蔗糖等碳源的利用菌株HA10002能利用D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-甘露糖和蔗糖等幾種碳源,不能利用D-果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖和棉子糖。明膠不液化,對(duì)牛奶不凝固、不胨化,不產(chǎn)生類黑色素和H2S,纖維素上不生長(zhǎng),硝酸鹽反應(yīng)呈陽(yáng)性。2.2.3菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)對(duì)菌株HA10002的16SrDNA擴(kuò)增獲得了約1428bp的序列(GenBank注冊(cè)號(hào)HQ171094),將該序列在GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì),發(fā)現(xiàn)與菌株HA10002同源性高的均為鏈霉菌,其中與S.albogriseolus的序列相似性最高,達(dá)99.3%。將同源性高的模式菌株構(gòu)建包括10株相關(guān)種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),從圖2看出,菌株HA10002與S.albogriseolus和S.viridodiastaticus處于同一分支,但在形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特性方面與S.viridodiastaticus差異較大,與S.albogriseolus比較,HA10002在碳源的利用、明膠液化以及硝酸鹽還原性質(zhì)方面也存在一定差異。綜合分析,將菌株HA10002初步鑒定為白淺灰鏈霉菌(Streptomycesalbogriseolus)。2.3在ha102發(fā)酵液中，殺死線蟲(chóng)活性物質(zhì)的分離和鑒定2.3.1活性成分的分離和表征HA10002的25L發(fā)酵液經(jīng)3次乙酸乙酯萃取后50℃下減壓濃縮,得到棕褐色膏狀物質(zhì)。利用硅膠柱層析對(duì)萃取所得浸膏進(jìn)行分離,環(huán)己烷:氯仿梯度洗脫,分部收集洗脫液,共得68個(gè)組分。減壓濃縮收集各組分,并進(jìn)行活性檢測(cè),發(fā)現(xiàn)組分33對(duì)線蟲(chóng)的校正死亡率為84.7%,組分22、26的殺線蟲(chóng)活性最明顯,校正死亡率分別達(dá)97.6%和96.4%。組分22采用SephadexLH-20柱層析(甲醇與氯仿體積比1∶1為洗脫劑),得到27個(gè)組分,采用HSGF254層析板分析(展開(kāi)劑氯仿與丙酮體積比=4∶1),TLC制備,得黃色化合物A22-1。組分26采用SephadexLH-20柱層析(甲醇為洗脫劑),得到19個(gè)組分,層析分離后得到白色活性化合物A26-3。2.3.2結(jié)構(gòu)鑒定與分析化合物A26-3,白色針狀結(jié)晶;改良碘化鉍鉀顯橘紅色,提示為含氮化合物;mp192.5~194.5℃;IRυKBrmaxυΚBrmaxcm-1:3508~3110、2938、2856、1627、1551,表明仲酰胺、羥基和亞甲基的存在;ESI-MSm/z601.4[M+H]+,表明A26-3的分子量為600;經(jīng)Scifinderscholar聯(lián)機(jī)檢索分子量為600的化合物,共檢出154個(gè),在將S2的1H、13C-NMR數(shù)據(jù)與154個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)符合性比較中發(fā)現(xiàn),A26-3與諾卡胺素(nocardamine)的結(jié)構(gòu)比較相似,查閱諾卡胺素鑒定的相關(guān)文獻(xiàn),并進(jìn)行1H、13C-NMR的數(shù)據(jù)比對(duì),表明兩者數(shù)據(jù)基本一致,鑒定化合物A26-3為諾卡胺素,分子式C27H48N6O9,結(jié)構(gòu)如圖3所示?；衔顰22-1,黃色無(wú)定形粉末,紫外光譜顯示在337、340nm和320nm處有最大吸收,表明其結(jié)構(gòu)中存在較大共軛體系。紅外光譜顯示分子中可能含有羥基(3417、1066、1006cm-1),酯鍵(1723、1172、1137cm-1),共軛雙鍵(3023、1639、849cm-1),4個(gè)以上相連的亞甲基單元(721cm-1)。13CNMR和DEPT譜共顯示36個(gè)碳信號(hào)。FAB-MS圖譜顯示m/z707(M+Na),表明A22-1的分子量為684。經(jīng)Scifinderscholar聯(lián)機(jī)檢索,發(fā)現(xiàn)A22-1可能為一新化合物。由于該化合物分子量較大,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,其結(jié)構(gòu)還在進(jìn)一步的解析中。3對(duì)微生物活性的物質(zhì)分離放線菌是一類重要的抗生素產(chǎn)生菌,是微生物農(nóng)藥的重要來(lái)源,世界各國(guó)從放線菌中尋找新抗生素和為抗生素開(kāi)辟新途徑的工作一直十分活躍。放線菌中的一些種類能夠產(chǎn)生具有抗生或殺線蟲(chóng)特性的化合物,已報(bào)道的主要有鏈霉菌及其變種。本文篩選出的較高活性菌株HA10002來(lái)源于海岸紅樹(shù)林中的海泥樣品,經(jīng)鑒定為白淺灰鏈霉菌。古靜燕等研究報(bào)道,她們篩選出的海洋來(lái)源白淺灰鏈霉菌菌株A2002具有抗腫瘤活性,并鑒定出其活性成分主要為三環(huán)縮醛內(nèi)酯素類化合物,它們具有細(xì)胞周期抑制活性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞毒性作用。但尚未見(jiàn)白淺灰鏈霉菌中有線蟲(chóng)拮抗菌株的報(bào)道。本文從菌株HA10002的發(fā)酵產(chǎn)物中分離出了2個(gè)具有殺線蟲(chóng)活性的化合物A26-3和A22-1,其中A26-3為諾卡胺素,屬于大環(huán)內(nèi)酯化合物。據(jù)報(bào)道,諾卡胺素有抗菌尤其是抗四環(huán)素耐藥菌株的活性,但與鐵離子絡(luò)合成FerrioxamineE后,抗菌活性會(huì)消失;另外,諾卡胺素還能誘導(dǎo)昆蟲(chóng)BM-N4細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變,但未見(jiàn)諾卡胺素有線蟲(chóng)拮抗活性的報(bào)道,本文拓展了該活性物質(zhì)的抗性譜。另?yè)?jù)報(bào)道,Nocardiasp.、Streptomyceshygroscopicusvar.geldanus、Pseudomonasstutzeri能產(chǎn)生諾卡胺素,但也未見(jiàn)Streptomycesalbogriseolus能產(chǎn)生諾卡胺素的報(bào)道,本文同時(shí)擴(kuò)展