轉(zhuǎn)基因果蠅系的建立及其重組蛋白PCL的表達和分析的開題報告

轉(zhuǎn)基因果蠅系的建立及其重組蛋白PCL的表達和分析的開題報告一、研究背景及意義果蠅（Drosophilamelanogaster）是經(jīng)典的模式生物，其遺傳學研究貢獻了很多重要的發(fā)現(xiàn)，如基因的顯性、隱性；同源染色體的交換；基因的突變等。近年來，果蠅轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展也為果蠅研究提供了更多的手段。PCL(Polycomb-like)是一種與Polycomb(Pc)蛋白家族密切相關(guān)的蛋白，參與了組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物學過程，但其準確的作用機制尚不清楚。因此，建立一個能夠?qū)CL進行研究的果蠅轉(zhuǎn)基因系，并通過對其表達和分析，探討PCL的功能、結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)機制等，將對生物學基礎(chǔ)研究有重要的幫助。二、研究內(nèi)容1、果蠅轉(zhuǎn)基因系的建立：采用pUAST-attB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，構(gòu)建包含PCL基因的表達載體，并通過胚胎注射的方式將其導入果蠅基因組中。2、重組蛋白PCL的表達：利用Westernblot和免疫熒光技術(shù)，檢測轉(zhuǎn)基因果蠅內(nèi)重組PCL蛋白的表達情況，獲得PCL蛋白的純化樣品。3、PCL蛋白的結(jié)構(gòu)和功能分析：通過單克隆抗體的制備、共沉淀、質(zhì)譜分析等方式，探究PCL蛋白所參與的復(fù)合物及其結(jié)構(gòu)。同時，通過RNA-seq和ChIP-seq技術(shù)，分析PCL蛋白在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用機制。三、研究方法1、分子生物學技術(shù)：PCR擴增、限制性內(nèi)切酶切割、接頭PCR構(gòu)建載體、DNA凝膠電泳、DNA測序等。2、果蠅胚胎注射：將表達載體導入果蠅胚胎中，利用GFP等熒光蛋白檢測轉(zhuǎn)基因果蠅的表達情況。3、蛋白提取和純化技術(shù)：細胞裂解、離心、酒精沉淀、薄層酶組化、尿素/SDS-聚丙烯酰胺凝膠等方法。4、Westernblot和免疫熒光技術(shù)：檢測PCL蛋白的表達情況和分布情況。5、單克隆抗體制備：包括免疫原制備、小鼠免疫、雜交瘤技術(shù)、單克隆細胞培養(yǎng)、親和層析、SDS-聚丙烯酰胺凝膠等。6、共沉淀和質(zhì)譜分析技術(shù)：分析PCL蛋白所參與的復(fù)合物及其結(jié)構(gòu)。7、RNA-seq和ChIP-seq技術(shù)：分析PCL蛋白在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用機制。四、研究預(yù)期成果1、成功建立PCL基因的果蠅轉(zhuǎn)基因系，并鑒定了重組PCL蛋白的表達情況。2、獲得了高純度的PCL蛋白樣品，為PCL的結(jié)構(gòu)和功能研究提供了堅實的基礎(chǔ)。3、揭示PCL蛋白的作用機制，對于解析果蠅基因調(diào)控機制和相關(guān)疾病的研究具有重要的意義。五、研究步驟及進度安排1、建立果蠅轉(zhuǎn)基因系：3個月2、重組PCL蛋白的表達和分析：6個月3、PCL蛋白的結(jié)構(gòu)和功能分析：12個月4、實驗結(jié)果的分析和總結(jié)：3個月六、經(jīng)費預(yù)算本項研究所需經(jīng)費主要包括耗材、動物實驗、儀器設(shè)備以及實驗室維護等，預(yù)算總金額為50萬元