rhoa、sshr2在宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變及宮頸癌組織中的表達(dá)及意義

rhoa、sshr2在宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變及宮頸癌組織中的表達(dá)及意義

腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移首先與主細(xì)胞表面相連，然后通過血液循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)方。這個(gè)過程涉及多種基因產(chǎn)物之間的相互協(xié)調(diào)作用,其中調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、移動(dòng)、黏附的細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白起著重要的作用。小分子G蛋白R(shí)ho是參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要蛋白質(zhì),可調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)黏附、細(xì)胞增殖、基因表達(dá),與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn),Rho家族蛋白與腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)方面均有聯(lián)系,包括腫瘤的生長和增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移細(xì)胞凋亡、腫瘤新生血管的形成等。Rho家族成員特別是RhoA及其下游效應(yīng)器Rho激酶2(Rho-associatedkinase,ROCK2)在多種腫瘤組織中表達(dá)增加并和腫瘤惡性程度相關(guān),提示其在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中具有重要作用,可能成為一種新的腫瘤標(biāo)志物,用于判斷良惡性及判斷腫瘤轉(zhuǎn)移能力及估計(jì)預(yù)后,具有潛在的重要臨床價(jià)值,已成為研究熱點(diǎn)之一。RhoA/ROCK2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)及宮頸癌關(guān)系的研究尚未見報(bào)道,本研究利用免疫組化方法檢測(cè)RhoA、ROCK2蛋白在各級(jí)CIN及宮頸癌中的表達(dá),以探討其與CIN疾病及宮頸癌進(jìn)展的相關(guān)性,以期為探索新的CIN及宮頸癌治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1病例選擇及免疫組化選取無錫市婦幼保健院2002年1月～2010年12月10例宮頸炎、30例CIN宮頸、30例宮頸癌宮頸活檢包埋蠟塊,活檢前均未作化療、放療?；颊吣挲g25～68歲,平均年齡45歲,30例CIN:Ⅰ級(jí)10例,Ⅱ級(jí)12例,Ⅲ級(jí)8例;30例宮頸癌按FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)診斷:Ⅰ期17例,Ⅱ期13例,按分化程度組織學(xué)分級(jí):Ⅰ級(jí)10例,Ⅱ級(jí)9例,Ⅲ級(jí)11例,手術(shù)限于≤Ⅱb期,發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者9例。對(duì)宮頸癌病例自發(fā)現(xiàn)患病開始隨訪至今均健在。病理標(biāo)本以10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋切片,每例連續(xù)制作3張切片,厚度為5μm,分別行HE染色和RhoA、ROCK2免疫組化染色。濃縮型鼠抗人RhoA單克隆抗體和濃縮型鼠抗人ROCK2單克隆抗體為臺(tái)灣Abnova公司產(chǎn)品。鏈菌素抗生物素-過氧化物酶(S-P)免疫組化試劑盒、氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購于福州邁新技術(shù)開發(fā)有限公司。1.2方法1.2.1水化過程中dab染色采用S-P法,RhoA單克隆抗體稀釋度(1∶2000)、鼠抗人ROCK2單克隆抗體稀釋度(1∶800)。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟和水化后,以檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)進(jìn)行抗原修復(fù)。依次滴加過氧化酶阻斷液(室溫下孵育10min)、非免疫性動(dòng)物血清(室溫下孵育10min)、第一抗體100μl(室溫1h)、生物素標(biāo)記的第二抗體(室溫下孵育10min)、S-P溶液(室溫下孵育10min),最后滴加新鮮配制的DAB顯色劑顯色5min,顯微鏡下觀察染色情況。自來水沖洗、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片。1.2.2染色強(qiáng)度的評(píng)估RhoA、ROCK2主要分布于細(xì)胞漿,染色呈淺黃色-棕黃色,小片狀或彌漫性分布。以陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)及染色強(qiáng)度來判定。根據(jù)著色細(xì)胞的陽性百分比可分別評(píng)為0分(<5%,陰性)、1分(5%～25%,散發(fā))、2分(26%～50%,局部)、3分(51%～75%,彌漫)和4分(>75%)。根據(jù)染色的強(qiáng)度可分別評(píng)為0分(不著色)、1分(弱著色)、2分(中度著色)和3分(強(qiáng)著色)。將著色細(xì)胞的陽性百分比和染色強(qiáng)度的評(píng)分相乘,最后RhoA、ROCK2的評(píng)分(0～12)分別對(duì)應(yīng)的4種表達(dá)強(qiáng)度:陰性(-):0～1分、弱陽性(+):2～4分、中度陽性(++):5～8分和強(qiáng)陽性(+++):9～12分。1.3檢驗(yàn)、檢驗(yàn)方法所有數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。免疫組化結(jié)果各組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Pearsonχ2檢驗(yàn)、趨勢(shì)檢驗(yàn)、Wilcoxon秩和檢驗(yàn)),相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法。統(tǒng)計(jì)采用雙側(cè)檢驗(yàn),P<0.05認(rèn)為差異顯著,P<0.01認(rèn)為有極顯著差異。2結(jié)果2.1曲回性宮頸炎rhoa在陰宮主要組織中的表達(dá)RhoA、ROCK2蛋白在各級(jí)CIN病變及宮頸癌石蠟標(biāo)本免疫組化染色顯示:RhoA在宮頸癌標(biāo)本中高表達(dá),主要定位于細(xì)胞漿,染色呈淺黃色-棕黃色(圖1);ROCK2在宮頸癌標(biāo)本中高表達(dá),主要定位于細(xì)胞漿,免疫染色呈黃色-棕黃色顆粒(圖2)。RhoA蛋白在10例宮頸炎組織鱗狀上皮中無陽性表達(dá);在30例CIN組織中陽性表達(dá)率為36.7%(11/30),其中CINⅠ級(jí)10.0%,CINⅡ級(jí)41.7%,CINⅢ級(jí)62.5%;而30例宮頸癌組織RhoA蛋白陽性表達(dá)率為83.3%(25/30),其中宮頸癌Ⅰ期76.5%,Ⅱ期92.3%。RhoA在不同宮頸組織中的表達(dá)均具有顯著差別(組間兩兩比較,Pearsonχ2檢驗(yàn),P<0.01),隨著宮頸病變進(jìn)展,RhoA的陽性表達(dá)率呈遞增趨勢(shì)(趨勢(shì)檢驗(yàn),P<0.05,表1)。ROCK2蛋白在10例宮頸炎組織鱗狀上皮中無陽性表達(dá),在30例CIN組織中陽性表達(dá)率為30.0%(9/30),其中CINⅠ級(jí)10.0%,CINⅡ級(jí)33.3%,CINⅢ級(jí)50.0%,而30例宮頸癌組織ROCK2蛋白陽性表達(dá)率為76.7%(23/30),其中宮頸癌Ⅰ期70.6%,Ⅱ期84.6%。ROCK2在不同宮頸組織中的表達(dá)具有顯著差別(組間兩兩比較,Pearsonχ2檢驗(yàn),P<0.01),隨著宮頸病變進(jìn)展,ROCK2的陽性表達(dá)率呈遞增趨勢(shì)(趨勢(shì)檢驗(yàn),P<0.05,表2)。2.2組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)宮頸癌中RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)水平與病理組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(Wilcoxon秩和檢驗(yàn),P<0.05),與患者年齡、臨床分期無關(guān)(Wilcoxon秩和檢驗(yàn),P>0.05,表3)。2.3在所有cin病變中，rhoa和rock2之間的相關(guān)性分析Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示RhoA與ROCK2的表達(dá)有相關(guān)性(P=0.005),它們之間呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.423,表4)。3rhoa下游靶效應(yīng)分子宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,臨床上宮頸癌的發(fā)展過程為不典型增生、原位癌、微小浸潤癌至宮頸癌。CIN是與宮頸浸潤癌相關(guān)的一組癌前病變的總稱,包括宮頸不典型增生和宮頸原位癌。根據(jù)宮頸上皮細(xì)胞異常的程度可分為3級(jí):CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ。CIN的轉(zhuǎn)歸有3個(gè)方向:消退或逆轉(zhuǎn)、病變穩(wěn)定、進(jìn)展為宮頸浸潤癌。宮頸癌前病變的早期篩查和合理干預(yù)是防治宮頸癌的重要環(huán)節(jié),研究CIN疾病及宮頸癌進(jìn)展對(duì)于早期篩查宮頸癌有重要作用。Rho家族蛋白質(zhì)是小G蛋白的Ras超家族成員,是一組分子量為20000～30000的鳥苷酸結(jié)合蛋白,具有GTP酶活性。Rho家族蛋白參與調(diào)節(jié)了細(xì)胞的多種生命過程,包括肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞黏附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞分裂以及基因轉(zhuǎn)錄等。RhoA是Rho家族的重要成員,RhoA有兩種構(gòu)像,即與GDP結(jié)合的非活化態(tài)和與GTP結(jié)合的活化態(tài),在這兩種狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換使它們能夠發(fā)揮一種類似“分子開關(guān)”的作用。活性態(tài)的RhoA能激活下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,行使其功能。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的RhoA下游效應(yīng)分子包括ROCK、p21活化激酶(p21-activatedkinase,PAK)、PKN、Citron、PI3K等,這些分子介導(dǎo)了RhoA的作用。ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員,是目前功能研究最為清楚的RhoA下游靶效應(yīng)分子。在細(xì)胞內(nèi)ROCK至少有2種異構(gòu)體:ROCK1(ROCKβ或p160ROCK)和ROCK2(ROCKα或Rho激酶)。它的分子結(jié)構(gòu)包括氨基酸的催化結(jié)構(gòu)域、中間的Rho結(jié)合的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和羧基端PH結(jié)構(gòu)域。ROCK是Rho/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的主要效應(yīng)分子,Rho/ROCK通路介導(dǎo)細(xì)胞骨架重組、張力絲和黏著斑形成、血管重塑、細(xì)胞分化、基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡和對(duì)鈣離子的敏感性等。ROCK接受Rho傳遞的活化信號(hào),發(fā)生多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的磷酸化而激活,并介導(dǎo)其下游一系列磷酸化/脫磷酸化反應(yīng)。肌球蛋白磷酸酶是活化ROCK的底物,接受Rho/ROCK的活化信號(hào)發(fā)生磷酸化而使自身失活,失活的肌球蛋白磷酸酶不能將肌球蛋白輕鏈(myosinlightchain,MLC)脫磷酸化,使得細(xì)胞漿內(nèi)磷酸化MLC水平提高,肌動(dòng)肌球蛋白交聯(lián)增加,從而促進(jìn)肌動(dòng)蛋白微絲骨架的聚合,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的形態(tài)、極性、細(xì)胞骨架的重建以及細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、惡性腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為。以往有關(guān)Rho家族蛋白的研究主要集中在白細(xì)胞運(yùn)動(dòng)游走方面,近年來研究發(fā)現(xiàn),Rho家族蛋白與腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)方面均有聯(lián)系,包括腫瘤的生長和增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞凋亡、腫瘤新生血管的形成等。已有不少研究證明了RhoA及其下游效應(yīng)蛋白R(shí)OCK2能夠使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,表現(xiàn)出增殖能力增強(qiáng)、抵抗凋亡、易于侵襲轉(zhuǎn)移,在某些腫瘤組織中也發(fā)現(xiàn)RhoA及其下游效應(yīng)蛋白R(shí)OCK2的表達(dá)發(fā)生了改變,而且其表達(dá)的改變與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。對(duì)結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、睪丸精原細(xì)胞瘤、卵巢癌、頭頸癌等的研究也均發(fā)現(xiàn)有RhoA表達(dá)的異常增高,其上調(diào)和(或)過表達(dá)與腫瘤惡性程度、不良預(yù)后相關(guān)。Xiao等報(bào)道RhoA/ROCK2級(jí)聯(lián)的途徑引起快速的肌動(dòng)蛋白重塑促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞骨架的運(yùn)動(dòng),從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲運(yùn)動(dòng)。于月成等發(fā)現(xiàn)RhoA/ROCK2在卵巢癌中表達(dá)升高,其高表達(dá)與腫瘤低分化、淋巴轉(zhuǎn)移和短生存期相關(guān)。目前有關(guān)RhoA/ROCK2蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義的研究未見報(bào)道。本文采用免疫組化方法檢測(cè)10例宮頸炎、30例不典型增生宮頸、30例宮頸癌組織中RhoA和ROCK2蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn),RhoA和ROCK2蛋白在宮頸炎組織不表達(dá),而在宮頸癌組織中呈高度表達(dá),RhoA和ROCK2與病理組織分級(jí)呈正相關(guān),隨分級(jí)增高,二者的表達(dá)呈逐漸增高的趨勢(shì),說明隨著宮頸癌惡性程度的增加,RhoA蛋白和ROCK2蛋白表達(dá)呈正向表現(xiàn),RhoA和ROCK2的表達(dá)可作為反映宮頸癌進(jìn)展和惡性程度的參考指標(biāo)。研究還發(fā)現(xiàn)RhoA/ROCK2的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的RhoA蛋白表達(dá)率為9/9(100%),高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的RhoA蛋白表達(dá)率16/21(76.2%),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的ROCK2蛋白表達(dá)率為9/9(100%),高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的ROCK2蛋白表達(dá)率14/21(66.7%),差異均有顯著性意義,提示RhoA/ROCK2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能在宮頸癌浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了一定的作用。在宮頸癌RhoA蛋白陽性表達(dá)病例中ROCK2蛋白陽性表達(dá)率為88.9%(32/36),大于陰性表達(dá)率11.1%(4/36),RhoA和ROCK2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。總之,RhoA和ROCK2蛋白在CIN宮頸組織中有不同程度的表達(dá),在宮頸癌組織中高表達(dá),RhoAROCK2信號(hào)在宮頸惡性病變的發(fā)展侵襲和轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮著一定的作用。RhoA/ROCK2信號(hào)通