植物抗線蟲(chóng)基因工程的分子標(biāo)記

植物抗線蟲(chóng)基因工程的分子標(biāo)記

植物線蟲(chóng)是植物的一個(gè)重要領(lǐng)域。根據(jù)美國(guó)科學(xué)家的統(tǒng)計(jì)，世界每年的損失可達(dá)1000億美元。解決植物線蟲(chóng)危害的主要途徑之一是培育抗線蟲(chóng)植物新品種。研究發(fā)現(xiàn),自然界一些植物中存在抗線蟲(chóng)基因,如番茄、甜菜和小麥等,目前一部分抗線蟲(chóng)基因已被克隆,一部分不久將會(huì)被克隆和鑒定。標(biāo)記和克隆這些基因,并在分子水平上對(duì)其進(jìn)行遺傳操作與以利用,能大大加速育種的進(jìn)程,具有廣闊的應(yīng)用前景。1種植物的寄生蟲(chóng)嚴(yán)重危害植物的線蟲(chóng)類(lèi)群較多,如根結(jié)線蟲(chóng)、胞囊線蟲(chóng)、滑刃線蟲(chóng)、莖線蟲(chóng)、粒線蟲(chóng)及短體(根腐)線蟲(chóng)等,而根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogynespp)和胞囊線蟲(chóng)(Heterodera和Globodera)是危害最嚴(yán)重的兩大類(lèi)。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上危害最重的根結(jié)線蟲(chóng)有4個(gè)種,即南方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogynincognita)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)(M.javanica)、北方根結(jié)線蟲(chóng)(M.hapla)和花生根結(jié)線蟲(chóng)(M.arenaria)。它們的寄生范圍很廣,主要危害茄科、葫蘆科、花生等多種植物。胞囊線蟲(chóng)是另一類(lèi)危害較重的線蟲(chóng),主要有大豆胞囊線蟲(chóng)(Heteroderaglycines)、甜菜胞囊線蟲(chóng)(H.schachtii)、燕麥胞囊線蟲(chóng)(H.avenae)、馬鈴薯金線蟲(chóng)(Globoderarostochiensis)、馬鈴薯白囊線蟲(chóng)(G.pallida)。它們的共同點(diǎn)是都危害根系,造成根系衰弱,發(fā)育不良,甚至腐爛,導(dǎo)致地上部生長(zhǎng)衰弱、矮化、葉片變黃、開(kāi)花少,甚至全株枯死,嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。隨著人們環(huán)保意識(shí)的加強(qiáng),應(yīng)用化學(xué)農(nóng)藥防治作物的線蟲(chóng)病愈來(lái)愈受到限制,提高作物自身的抗病性防治病害是一種既經(jīng)濟(jì)又有效的措施,倍受人們的關(guān)注。2抗線蟲(chóng)基因的分子標(biāo)記、定位和克隆2.1抗作體體中的基因表達(dá)德國(guó)科學(xué)家對(duì)甜菜的抗病育種做出了巨大的貢獻(xiàn),尤其是在抗甜菜胞囊線蟲(chóng)(H.schachtiiSchm.)研究方面成績(jī)顯著。1992年,Jung等用抗線蟲(chóng)野生甜菜(Betapatellaris)和栽培品種進(jìn)行雜交,對(duì)抗性基因進(jìn)行了分子標(biāo)記;采用染色體特異性質(zhì)粒文庫(kù)方法,建立一種高密度不連續(xù)RFLP植物基因組圖譜。通過(guò)幾年不斷的努力,在1997年Cai等克隆出了第1個(gè)抗甜菜胞囊線蟲(chóng)基因-Hs1pro-1,通過(guò)特異基因組衛(wèi)星標(biāo)記和基因組斷裂點(diǎn)分析進(jìn)行克隆。相應(yīng)的cDNA通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)和CaMV35s啟動(dòng)子控制下在甜菜根中進(jìn)行了表達(dá)。在這種抗性品種中很少觀察到線蟲(chóng)的雌蟲(chóng)。其對(duì)線蟲(chóng)的抗性主要表現(xiàn)為雌蟲(chóng)不能完成生活史,也不能產(chǎn)卵,被線蟲(chóng)取食的合胞體很小,與正常的合胞體明顯不同。Hslpro-1基因在根中表達(dá)產(chǎn)物是282個(gè)氨基酸序列,不完全富含亮氨酸重復(fù)序列跨膜片段,這和以前克隆的抗病基因的特征相似。有關(guān)抗性基因在栽培品種中的檢測(cè)技術(shù)和抗性基因在植物中高效表達(dá)的規(guī)律也有了深入的研究。不久,抗線蟲(chóng)甜菜將會(huì)應(yīng)用于生產(chǎn)。2003年Cai等從甜薯的塊根中分離出一種貯存蛋白基因(SpTI-1),它是一種Kunitz型胰蛋白抑制劑,具有抗昆蟲(chóng)取食的能力,并已在轉(zhuǎn)基因煙草和花椰菜中得到驗(yàn)證。為了證實(shí)它是否對(duì)甜菜胞囊線蟲(chóng)具有抗性,他們采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系,將其轉(zhuǎn)入到栽培甜菜(BetavulgarisL.)中,通過(guò)Northern和Western雜交分析在所有的轉(zhuǎn)化體中都有SpTI-1基因存在,12個(gè)轉(zhuǎn)化的發(fā)根中有8個(gè)表現(xiàn)出對(duì)甜菜胞囊線蟲(chóng)有強(qiáng)烈的抑制作用。這種抑制不與表達(dá)的蛋白量有關(guān)、而和胰蛋白抑制劑的作用機(jī)理有關(guān),但也不完全相同。相關(guān)的數(shù)據(jù)表明,胰蛋白抑制劑的活性是抑制甜菜胞囊線蟲(chóng)的關(guān)鍵因子,這一研究為甜菜胞囊線蟲(chóng)的治理提供了新的有效的抗取食的基因類(lèi)型。2.2抗其他抗種基因番茄中的抗線蟲(chóng)基因—Mi是通過(guò)種間雜交胚胎挽救法(embryorescue)從野生種(Lycoperisiconperuvianum)導(dǎo)入栽培番茄種(L.esculentum)中的。Mi基因是單個(gè)顯性或半顯性的抗性基因。Aarts等通過(guò)染色體步查法對(duì)來(lái)源于野生番茄抗根結(jié)線蟲(chóng)(M.incognita)基因Mi進(jìn)行了分子標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)與編碼酸性磷酸酯酶(acidphosphatase)的Aps-1基因相連鎖并定位在6號(hào)染色體。Tanaka等對(duì)Aps-1基因進(jìn)行克隆,并鑒定了部分序列。由于Aps-1與Mi基因連鎖,Cap等用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)測(cè)定酸性磷酸同功酶的活性篩選抗線蟲(chóng)基因Mi。1998年,對(duì)抗線蟲(chóng)基因的研究有了重大突破,Kaloshian等和Milligan等用定位克隆得到Mi基因,與其他已克隆的植物抗病基因具有相似性,即Mi編碼的蛋白具有NBS(nucleotidebindingsite)和LRR(leucinerichrepeat)結(jié)構(gòu)。Mi-1是廣譜抗性基因,既抗根結(jié)線蟲(chóng)又抗馬鈴薯蚜蟲(chóng)(Macrosiphumeuphorbiae),同樣位于6號(hào)染色體上的耐熱抗線基因Mi-9也被定位和鑒定。番茄中的另一個(gè)抗線蟲(chóng)基因Hero定位在番茄的4號(hào)染色體上。它也是一個(gè)廣譜抗性的基因,既抗馬鈴薯金線蟲(chóng)又抗馬鈴薯白胞囊線蟲(chóng)。2002年,Ernst等克隆了此基因,并對(duì)編碼的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)也具有NBS和LRR結(jié)構(gòu),與其它抗性基因的產(chǎn)物相似。Nombela等研究發(fā)現(xiàn)Mi-1.2是多抗性基因。我們知道它抗根結(jié)線蟲(chóng)的同時(shí)還抗馬鈴薯蚜蟲(chóng),現(xiàn)又顯示出抗煙粉虱(Bemisiatabaci)的特性,是唯一的具有同時(shí)抗3種不同生物的基因。故而Mi基因在有害生物的綜合治理中有重要的應(yīng)用價(jià)值。2.3iii染色體上的工商型及遺傳距離的確定抗馬鈴薯金線蟲(chóng)基因Gro1位點(diǎn)用限制長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)進(jìn)行了分子標(biāo)記。1996年Ballvora用RFLP、AFLP和RAPD對(duì)位于VII染色體上Gro1位點(diǎn)進(jìn)行了精確定位,獲得3個(gè)RFLP標(biāo)記和1個(gè)RADP標(biāo)記,在Gro1附近2個(gè)AFLP標(biāo)記的遺傳距離分別是0.6cM和0.8cM?？柜R鈴薯白囊線蟲(chóng)基因Gpa2通過(guò)定位的策略被克隆了出來(lái)。該基因和抗馬鈴薯X病毒的基因Rx1的蛋白序列有很高的同源性,均位于XII號(hào)染色體上?？柜R鈴薯線蟲(chóng)的基因H1用RFLP標(biāo)記等位基因進(jìn)行PCR分析診斷時(shí),發(fā)現(xiàn)與Grol基因緊密相連,H1基因能導(dǎo)致馬鈴薯被取食部位的壞死。2.4小麥抗胞囊線蟲(chóng)基因的鑒定危害小麥的線蟲(chóng)有燕麥胞囊線蟲(chóng)、根腐線蟲(chóng)(Pratylenchusneglectus)和小麥粒癭線蟲(chóng)(Anguinatritici)等。對(duì)小麥抗線蟲(chóng)基因研究較多的是澳大利亞和美國(guó)。1996年,Williams等通過(guò)標(biāo)簽Tag605探針鑒定出小麥抗胞囊線蟲(chóng)的基因位于品種AUS10894染色體2B上7cM處?？剐←湴揖€蟲(chóng)基因Cre-3是通過(guò)作圖法克隆的,它位于小麥染色體2D的長(zhǎng)臂上,物理圖譜距離為0.06cM。它編碼的氨基酸有NBS和LRR結(jié)構(gòu),屬于抗病基因的成員且在根中特異表達(dá)。在小麥中尋找抗性基因一直是抗病育種者的夢(mèng)想,應(yīng)用RGAs(Resistancegeneanalogs)法對(duì)抗線蟲(chóng)基因CreX在小麥中進(jìn)行了定位。小麥中的另一個(gè)抗根腐線蟲(chóng)基因Rlnn1采用AFLP進(jìn)行分子標(biāo)記并定位在7A染色體上。另外幾個(gè)抗性位點(diǎn)Cre1定位于2B染色體上。Cre2和Cre5是來(lái)自不同的抗源也分別標(biāo)記在不同的染色體上。這對(duì)今后的小麥育種有重要的意義。2.5ssr標(biāo)記的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)和基因連鎖大豆胞囊線蟲(chóng)(H.glycines)是大豆生產(chǎn)上的一種主要病原物,運(yùn)用大豆抗性基因的分子標(biāo)記和克隆技術(shù)極大地促進(jìn)了大豆抗病育種的進(jìn)程。Mahalingam等以Excess×Peking的F2為材料,利用3個(gè)形態(tài)標(biāo)記、108個(gè)RFLP標(biāo)記和400個(gè)RAPD標(biāo)記對(duì)大豆胞囊線蟲(chóng)3號(hào)小種抗性進(jìn)行研究。結(jié)果表明,控制顏色(黑色)的i位點(diǎn)與3號(hào)小種的抗性基因Rhg4緊密連鎖,相距僅0.6cM;另2個(gè)RFLP標(biāo)記pA85a(連鎖群A)、pA136(連鎖群C)和3個(gè)RAPD標(biāo)記E01(連鎖群A)、G15d(連鎖群F)和S07a(連鎖群A)也不同程度的與抗病基因連鎖。由此推斷,3號(hào)小種的抗性受多個(gè)基因控制,屬數(shù)性狀遺傳,而且每個(gè)基因位點(diǎn)的作用程度均不相同。Conciliido等以PI209332為抗源材料,也發(fā)現(xiàn)i位點(diǎn)與3號(hào)小種的抗性位點(diǎn)連鎖。Concibido等通過(guò)對(duì)4個(gè)最廣泛使用的抗源PI209332、PI90763、PI88788和Peking的分析,找到了4個(gè)與抗3號(hào)生理小種有關(guān)的數(shù)量特征位點(diǎn)(QRL),其中Rhg1的最為重要,因?yàn)樵谶@幾個(gè)抗性品種中都有此位點(diǎn)存在。此點(diǎn)是屬于非小種抗性。這對(duì)抗線基因的克隆和大豆抗病育種有重要的意義。Meksem等將AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為STS標(biāo)記,從10個(gè)AFLP中得到6個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)標(biāo)記,與rhg1和Rhg4的位點(diǎn)相連鎖的分子標(biāo)記已被確定。Lewers用BAC文庫(kù)和PCR方法對(duì)抗大豆胞囊線蟲(chóng)的主效基因Rhg4給予了精確的定位。Rhg4與影響大豆種皮的基因位點(diǎn)i和編碼AK-HSDH(aspartokinasehomoserinedehydrogenase)的位點(diǎn)相鄰。因?yàn)榇蠖箤?duì)大豆胞囊線蟲(chóng)的抗性是受多個(gè)基因位點(diǎn)控制,遺傳規(guī)律復(fù)雜,雖然有較多的研究,但沒(méi)有突破性的進(jìn)展,相信隨著研究的深入,謎底最終會(huì)被解開(kāi)。2.6抗線與rflp的分子標(biāo)記在花生中,花生根結(jié)線蟲(chóng)引起嚴(yán)重病害,來(lái)自Arachiscardenasii的兩個(gè)主效基因Mae和Mag可減少蟲(chóng)卵數(shù)量或限制結(jié)節(jié)的形成,這兩個(gè)基因已被證實(shí)與RAPD、序列特征性擴(kuò)增區(qū)域SCAR和RFLP位點(diǎn)緊密相連,這是花生中第1個(gè)有關(guān)抗線基因的分子標(biāo)記。在大麥中,抗線蟲(chóng)(H.avenae)基因Ha1和Ha2(等位基因Ha3)已經(jīng)被定位到2號(hào)染色體上。另一新的基因Ha4被定位到5號(hào)染色體上。在辣椒中,抗根結(jié)線蟲(chóng)的基因Me3和Me4也進(jìn)行了精確定位,它們緊密連鎖且具有熱穩(wěn)定性。3抗線蟲(chóng)基因的克隆依據(jù)已克隆的抗線蟲(chóng)基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)它們有一些與其它R基因(Resistancegene)所據(jù)有的共同特征。如第1個(gè)被克隆出來(lái)的抗線蟲(chóng)基因Hs1pro1有LRR和NBS結(jié)構(gòu),Mi-1和Cre3其結(jié)構(gòu)特征相似(表1)。通過(guò)大量的遺傳學(xué)分析,LRR與蛋白質(zhì)之間的相互識(shí)別有關(guān)。Hwang等對(duì)Mi編碼蛋白的LRR進(jìn)行了研究,表明這種結(jié)構(gòu)與抗病信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān),即與線蟲(chóng)的識(shí)別相關(guān),證明其有調(diào)節(jié)局部細(xì)胞程序化死亡的作用。許多蛋白質(zhì)中的NBS具有ATP或GTP結(jié)合活性,說(shuō)明其在蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸中改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象,從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的識(shí)別。已克隆的抗線蟲(chóng)基因都是用定位克隆(positionalcloning)的,如Mi-1、Cre3、Gpa2和Hs1pro1的克隆。既然它們都有共同的結(jié)構(gòu)特征,我們便可利用它來(lái)克隆新的基因。Leister等根據(jù)煙草N基因和擬南芥中RPS2基因的保守序列設(shè)計(jì)PCR引物,對(duì)馬鈴薯DNA進(jìn)行擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物是與已知抗性基因有同源性,而且與抗線蟲(chóng)基因位點(diǎn)Gro1和R7連鎖。Bakker等根據(jù)馬鈴薯抗線蟲(chóng)基因Gpa2和抗馬鈴薯X病毒基因Rx1的LRR保守序列設(shè)計(jì)特異引物,獲得9個(gè)抗性基因相似物(RGHs)均定位于在馬鈴薯XII染色體上,與Gpa2和Rx1相似率達(dá)93%~95%。Hunger等利用R基因的保守序列設(shè)計(jì)引物,從甜菜中分離出的47個(gè)抗性基因類(lèi)似物(RGAs),其中有一類(lèi)似物與Hs1pro-1相似。這種抗病基因類(lèi)似序列(resistancegeneanalogs,簡(jiǎn)稱(chēng)RGAs)法,是克隆R基因的新思路,比定位克隆法簡(jiǎn)單直接。但得到R基因類(lèi)似序列,并不等于得到了R基因,還要進(jìn)一步檢測(cè)這些序列與抗病性的共分離情況,從中得到R基因。4抗線蟲(chóng)基因的分子標(biāo)記和克隆在植物線蟲(chóng)的綜合治理中,種植抗性品種是防治植物線蟲(chóng)的一種簡(jiǎn)單而有效的措施。但是,目前許多作物中尚找不到合適的抗源材料,如葫蘆科作物。正是由于抗線蟲(chóng)基因的克隆,為無(wú)抗源的作物抗線蟲(chóng)育種提供了機(jī)遇。然而,并不是所有的抗線蟲(chóng)基因