拮抗菌生物有機(jī)肥對(duì)番茄根結(jié)線蟲(chóng)病的防治作用

拮抗菌生物有機(jī)肥對(duì)番茄根結(jié)線蟲(chóng)病的防治作用

根結(jié)線蟲(chóng)是一種對(duì)各種作物造成嚴(yán)重危害的寄生蟲(chóng)線蟲(chóng)。每年根結(jié)線蟲(chóng)的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)1000多億美元。根結(jié)線蟲(chóng)以各種作物的形式廣泛，它可以污染大多數(shù)常見(jiàn)的植物和雜草。傳統(tǒng)的管理方法（如農(nóng)業(yè)輪作、抗病育種和化學(xué)農(nóng)藥的使用等）在一定程度上減少了線蟲(chóng)的風(fēng)險(xiǎn)，但作物產(chǎn)量仍然很大。因此，有效控制根結(jié)線蟲(chóng)的危害已經(jīng)成為控制土壤傳染疾病的研究熱點(diǎn)之一。過(guò)去對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的寄生真菌和寄生細(xì)菌研究較多.一些能有效防治根結(jié)線蟲(chóng)的拮抗菌尚需要進(jìn)一步研究其應(yīng)用技術(shù).例如淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)為根結(jié)線蟲(chóng)和根腐線蟲(chóng)兼性寄生真菌,能寄生在蟲(chóng)卵內(nèi)、破壞結(jié)構(gòu)和同化蟲(chóng)卵物質(zhì),使蟲(chóng)卵不能正常孵化,但對(duì)人體健康有潛在的威脅.穿刺巴氏桿菌(Pasteuriapenetrans)為根結(jié)線蟲(chóng)專(zhuān)性寄生細(xì)菌,能寄生在蟲(chóng)體內(nèi)、破壞組織細(xì)胞,吸取其營(yíng)養(yǎng),使根結(jié)線蟲(chóng)死亡,但該菌不能離體培養(yǎng),繁殖成本高,推廣應(yīng)用受到很大限制.近年來(lái)的研究表明,一些促進(jìn)植物生長(zhǎng)的根際細(xì)菌和菌根真菌能通過(guò)產(chǎn)生殺線蟲(chóng)的次生代謝產(chǎn)物,誘導(dǎo)作物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性,從而達(dá)到防治線蟲(chóng)病害的效果.線蟲(chóng)的外表皮主要由膠原蛋白質(zhì)組成,線蟲(chóng)卵殼通常由外層卵黃層(含蛋白質(zhì))、中層幾丁質(zhì)層和內(nèi)層脂質(zhì)層組成,能夠利用膠原蛋白質(zhì)的根際細(xì)菌對(duì)線蟲(chóng)外表皮可能有損壞作用,從而對(duì)線蟲(chóng)的繁殖和種群數(shù)量起到顯著的控制作用.然而,從分解線蟲(chóng)外表皮膠原蛋白的角度,篩選功能微生物用于防治線蟲(chóng)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道.此外,微生物菌劑劑型對(duì)功能菌在土壤中的存活和功能發(fā)揮也有影響.而將功能菌與有機(jī)肥進(jìn)行混合發(fā)酵,制成具有一定功能的生物有機(jī)肥,應(yīng)用于防治土傳病害的研究工作仍然十分有限.本文選擇能以膠原蛋白為唯一氮源生長(zhǎng),并能大量產(chǎn)生脂肽類(lèi)表面活性劑的3株根際細(xì)菌,在實(shí)驗(yàn)室條件下研究了菌懸液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)的致死率和對(duì)蟲(chóng)卵孵化率的影響,并通過(guò)溫室盆栽試驗(yàn),研究了利用3株菌及其等比例混合菌制成的生物有機(jī)肥對(duì)番茄根結(jié)線蟲(chóng)的防治效果.1材料和方法1.1ymixaymixa試驗(yàn)用菌株XZ-173、SL-25和KS-62分別屬于解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、吉氏芽孢桿菌(B.gibsonii)和多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa),分離自健康的番茄植株根際土壤,全部由江蘇省固體有機(jī)廢棄物資源化高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供.該3株菌都能夠在膠原蛋白培養(yǎng)基(膠原蛋白2g·L-1,KH2SO40.8g·L-1,CaCl20.1g·L-1,MgSO4·7H2O0.3g·L-1,Agar2%)上快速生長(zhǎng),并具較強(qiáng)的產(chǎn)脂肽和產(chǎn)蛋白酶能力,可能對(duì)線蟲(chóng)外表皮和細(xì)胞膜具有潛在的損壞作用,但該3株菌對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的生物防治作用之前尚未研究.3株菌株的實(shí)驗(yàn)室保存方法為:LB液體培養(yǎng)基(蛋白胨10g·L-1,酵母膏5g·L-1,NaCl10g·L-1,pH7.0),170r·min-1,30℃搖床培養(yǎng)24h后與20%甘油等體積混合,-70℃超低溫冰箱保藏.1.2試驗(yàn)表明的食物和土壤供試番茄(Solanumlycopersicum)品種為合作903.供試土壤取自江蘇省宜興市陸平村根結(jié)線蟲(chóng)嚴(yán)重發(fā)病的田塊.1.3根清線蟲(chóng)的制備在根結(jié)線蟲(chóng)危害嚴(yán)重的農(nóng)田土壤上種植番茄富集根結(jié)線蟲(chóng).取發(fā)病較重的根,用自來(lái)水洗凈,將根剪碎,再用1%NaClO表面消毒2~3min,劇烈振蕩5min,濕篩法收集蟲(chóng)卵,用來(lái)孵化根結(jié)線蟲(chóng).1.4室內(nèi)抗旱效果測(cè)試1.4.1e菌懸液的制備菌株采用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng),30℃170r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)24h,即得菌液.菌液在5000×g下離心5min,去培養(yǎng)基,加入一定體積的無(wú)菌水制成2×107cfu·ml-1的菌懸液.1.4.2線蟲(chóng)死亡檢測(cè)挑取50條左右已孵化的二齡幼蟲(chóng)加入到已滅菌的直徑為6cm的培養(yǎng)皿中,各加入5ml不同菌株的細(xì)胞懸浮液,于25℃培養(yǎng)箱中放置,每隔8h觀察線蟲(chóng)存活情況,觀察至24h.記錄線蟲(chóng)死亡數(shù)目(以針尖碰觸蟲(chóng)體無(wú)反應(yīng)判定為死亡),計(jì)算二齡幼蟲(chóng)死亡率.每個(gè)處理重復(fù)3次,以全加無(wú)菌水為對(duì)照.1.4.3成蟲(chóng)孵化率測(cè)定在已滅菌的直徑6cm的培養(yǎng)皿中各加入5ml不同菌株的菌懸液,再向其中添加50個(gè)左右經(jīng)過(guò)表面消毒的蟲(chóng)卵,置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔1d觀察蟲(chóng)卵孵化狀況,記錄根結(jié)線蟲(chóng)孵化數(shù),觀察至第7天,計(jì)算蟲(chóng)卵孵化率.每處理3個(gè)重復(fù),以只加無(wú)菌水為對(duì)照.1.5溫室內(nèi)的抗逆試驗(yàn)1.5.1ks-32發(fā)酵及根結(jié)特性測(cè)定分別將3種功能菌XZ-173、SL-25和KS-62的菌株懸浮液按20%(V/W)的量加入到腐熟好的有機(jī)肥(以豬糞與氨基酸有機(jī)肥按質(zhì)量比1∶1混合制成,有機(jī)質(zhì)495.7g·kg-1,N58.1g·kg-1,P2O510.8g·kg-1,K2O16.6g·kg-1)中,發(fā)酵堆肥制成生物有機(jī)肥BOF1、BOF2和BOF3.1.5.2盆栽試驗(yàn)每個(gè)盆缽裝5kg的根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病土壤,按1%(W/W)的量施入生物有機(jī)肥,試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下:以施未加入功能菌的有機(jī)肥(豬糞與氨基酸有機(jī)肥按質(zhì)量比1∶1混合)為對(duì)照(CK),處理1(T1)單加BOF1,處理2(T2)單加BOF2,處理3(T3)加入等質(zhì)量比例混合的BOF1和BOF2,處理4(T4)加入等質(zhì)量比例混合的BOF1、BOF2和BOF3,所有處理施肥總量相等.由于KS-62生長(zhǎng)速度最慢,抗生素平板檢測(cè)表明KS-62在發(fā)酵的肥料中數(shù)量較低(104~105cfu·g-1),達(dá)不到生物有機(jī)肥的功能菌數(shù)量標(biāo)準(zhǔn),加之離體培養(yǎng)對(duì)二齡幼蟲(chóng)致死率和蟲(chóng)卵孵化率影響相對(duì)較小,沒(méi)有單獨(dú)考察其防治效果,但由于該菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)酶能力,選作為混合菌成分之一.每個(gè)處理設(shè)12個(gè)重復(fù).番茄種子用0.3%H2O2表面消毒后在25℃光照培養(yǎng)箱中催芽露白,播入育苗盤(pán)中,待長(zhǎng)出3片真葉時(shí)移入盆缽中.盆栽種植40d后,小心地將番茄根系與土壤分離,根系用清水沖洗干凈,記錄各處理植株的地上部株高、鮮質(zhì)量及地下部鮮質(zhì)量與根系根結(jié)數(shù),參考Barker等和Benjumin等的方法進(jìn)行植株根結(jié)分級(jí):0~5%的根有根結(jié),0級(jí);6%~20%的根有根結(jié),1級(jí);21%~45%的根有根結(jié),2級(jí);46%~70%的根有根結(jié),3級(jí);71%~85%的根有根結(jié),4級(jí);86%~100%的根有根結(jié),5級(jí).按下式計(jì)算根結(jié)指數(shù):根結(jié)指數(shù)=Σ(各級(jí)植株數(shù)×級(jí)別)/調(diào)查總株數(shù)按Hussy等的方法,每個(gè)盆缽取500g根際土,離心濕篩法分離根結(jié)線蟲(chóng);將剪碎的病根在1%NaClO溶液中劇烈振蕩4min,分離根結(jié)線蟲(chóng)蟲(chóng)卵.分離到的根結(jié)線蟲(chóng)和蟲(chóng)卵用來(lái)測(cè)算土壤中根結(jié)線蟲(chóng)數(shù)和根系線蟲(chóng)蟲(chóng)卵數(shù)目.1.6處理數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件完成,采用鄧肯氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)各處理間差異顯著性,利用MicrosoftExcel作圖.2結(jié)果與分析2.1菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶能力由表1可知,菌株XZ-173水解膠原蛋白效果最明顯,在24h時(shí)水解圈就達(dá)到15.4mm,顯著高于菌株SL-25(3.0mm)和KS-62(8.2mm).與菌株SL-25和KS-62相比,XZ-173在流動(dòng)性和生長(zhǎng)速度方面均優(yōu)于二者,是一株具有應(yīng)用開(kāi)發(fā)潛力的細(xì)菌.菌株KS-62生長(zhǎng)雖不如XZ-173迅速,產(chǎn)酶能力卻很強(qiáng),水解圈直徑與菌落直徑的比值(即HC值)達(dá)到9.62,可見(jiàn),菌株產(chǎn)酶能力與生長(zhǎng)速度沒(méi)有正相關(guān)性.2.2菌株對(duì)j2的致病性由圖1可以看出,供試3種菌株的菌懸液對(duì)二齡幼蟲(chóng)(J2)都有致死作用.菌株XZ-173、SL-25和KS-62的菌懸液在8h時(shí)就可對(duì)J2造成34.5%、25.6%和18.2%的死亡率,對(duì)照未出現(xiàn)線蟲(chóng)死亡.隨著處理時(shí)間的增加,各菌株對(duì)J2的致死率逐漸升高,其中以XZ-173菌懸液效果最好,在24h時(shí)對(duì)二齡幼蟲(chóng)的致死率達(dá)到75.9%,而SL-25和KS-62分別為66.7%、50.0%,與對(duì)照(17.4%)相比,均能顯著提高二齡幼蟲(chóng)的死亡率.2.3對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)成蟲(chóng)的孵化由圖2可知,用3種菌株懸液處理根結(jié)線蟲(chóng)蟲(chóng)卵,7d蟲(chóng)卵孵化率均顯著低于對(duì)照,表明供試菌株能夠抑制蟲(chóng)卵正常孵化.XZ-173、SL-25和KS-62處理的蟲(chóng)卵孵化率分別比對(duì)照(53.6%)降低了35.8%、24.7%和16.0%,其中XZ-173的抑制作用最強(qiáng).菌株XZ-173對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)蟲(chóng)卵孵化也有很好的抑制作用,而其他兩菌株對(duì)二齡幼蟲(chóng)的致死率和抑制蟲(chóng)卵孵化效果均不如XZ-173.2.4對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的防治效果由圖3可以看出,利用不同菌株制成的單一或混合菌生物有機(jī)肥均能有效減少土壤中根結(jié)線蟲(chóng)的數(shù)量.處理T1(BOF1)、T2(BOF2)、T3(BOF1+BOF2)和T4(BOF1+BOF2+BOF3)的根際土壤中線蟲(chóng)數(shù)分別比對(duì)照減少了71.9%、66.7%、81.2%和84.0%,其中以3種生物有機(jī)肥混合(T4)的效果最好.比較可知,T1對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的防治效率要好于T2,而混合處理T3和T4對(duì)土壤中根結(jié)線蟲(chóng)的抑制率明顯高于T1與T2,表明混合菌有機(jī)肥對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的防治效果要好于單一菌有機(jī)肥.T4比T3提高了2.8%.2.5對(duì)番茄生長(zhǎng)的影響施用不同生物有機(jī)肥一定程度上提高了作物根和地上部生物量以及冠根比,促進(jìn)了番茄植株苗期的生長(zhǎng)(表2).單一菌生物有機(jī)肥或混合菌生物有機(jī)肥都對(duì)番茄植株的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用.地上部株高以T3和T4處理最高,平均達(dá)到60.3和60.9cm,分別比對(duì)照增加了14.0%和15.1%,且顯著高于T1和T2處理.T1、T2、T3和T4處理的地上部單株鮮質(zhì)量比對(duì)照分別增加了10.0、7.1、15.1和17.1g,各處理冠根比與對(duì)照相比有所增加但無(wú)顯著差異.除T4處理的地下部根系鮮質(zhì)量顯著高于對(duì)照外,其他處理與對(duì)照差異不顯著.2.6生物有機(jī)肥對(duì)3種常用處理根結(jié)指數(shù)的影響施用生物有機(jī)肥能夠顯著減少番茄根結(jié)數(shù)、蟲(chóng)卵數(shù)和根結(jié)指數(shù),有效降低根結(jié)線蟲(chóng)對(duì)番茄根的侵染(表3).與對(duì)照相比,生物有機(jī)肥處理的根結(jié)數(shù)降低了82.2%~90.0%,蟲(chóng)卵數(shù)減少了49.6%~86.3%,其中T4處理效果最好,其次是T3處理,再次T1和T2處理.T4處理的根結(jié)指數(shù)比對(duì)照降低了91.4%,在根上幾乎觀察不到根結(jié),與其他處理間差異顯著.施用生物有機(jī)肥能夠顯著促進(jìn)根系生長(zhǎng).與對(duì)照相比,T1、T2、T3和T4處理的番茄根顯著變粗,平均根直徑分別增加了0.10、0.08、0.11和0.13cm;根顯著變長(zhǎng),須根變多,總根長(zhǎng)分別增長(zhǎng)了12.5%、8.3%、10.2%和19.9%;根總表面積顯著提高,但各生物有機(jī)肥處理之間差異不顯著.3生物有機(jī)肥的使用室內(nèi)離體試驗(yàn)結(jié)果表明,供試3種菌株的菌懸液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)均具有不同程度的殺傷作用,都可抑制根結(jié)線蟲(chóng)蟲(chóng)卵的孵化,其中以菌株XZ-173效果最好,其次是SL-25和KS-62.3種菌株都能在膠原蛋白平板上生長(zhǎng),具有較高的膠原蛋白水解酶活性,可能對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)二齡線蟲(chóng)和蟲(chóng)卵有較強(qiáng)的破壞作用,從而使根結(jié)線蟲(chóng)的生長(zhǎng)和孵化受到抑制.其中,產(chǎn)酶能力最強(qiáng)的菌株KS-62并沒(méi)有表現(xiàn)出最好的抑制效果,這可能是由于細(xì)菌對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的作用除了產(chǎn)膠原蛋白酶破壞表皮外,還包括產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)和其他酶的作用.溫室盆栽結(jié)果表明,施用3株拮抗菌發(fā)酵的生物有機(jī)肥能顯著減少土壤中根結(jié)線蟲(chóng)數(shù)量,降低植株根上根結(jié)數(shù)和蟲(chóng)卵數(shù),起到了很好的生防效果.施用生物有機(jī)肥對(duì)番茄根系的生長(zhǎng)起到了促進(jìn)作用,使得根系變粗、須根變多,營(yíng)養(yǎng)吸收更充分,長(zhǎng)勢(shì)更好,對(duì)線蟲(chóng)病害的抵御能力變強(qiáng).3種功能菌共同作用,綜合防治效果有了顯著提高,與前人研究結(jié)果一致.這可能是由于單個(gè)生防菌株對(duì)環(huán)境因子依賴(lài)性強(qiáng),不同生態(tài)環(huán)境對(duì)生防菌的定殖有不同的影響,使得單個(gè)生防菌株的防效降低.因此,運(yùn)用不同生防機(jī)制的生