微生物飼料添加劑對肉仔雞營養(yǎng)代謝和免疫調(diào)控的調(diào)控機(jī)理

微生物飼料添加劑對肉仔雞營養(yǎng)代謝和免疫調(diào)控的調(diào)控機(jī)理

20世紀(jì)中葉，抗生素被廣泛用于人類，并被廣泛用于動物飼料添加劑，以發(fā)揮健康和改善生產(chǎn)力的作用。人們曾錯(cuò)誤地一味強(qiáng)調(diào)“抑制或殺滅有害微生物”,忽視了腸道微生態(tài)系統(tǒng)在促進(jìn)健康和營養(yǎng)調(diào)控上的重要作用,并大量使用抗生素以至于出現(xiàn)目前抗生素所致的一系列后患,如藥物殘留、耐藥性和環(huán)境污染。當(dāng)今,畜牧業(yè)迫切需要無毒副作用、無藥殘的綠色微生物添加劑以替代抗生素,因此,全面認(rèn)識動物微生態(tài)系統(tǒng)對營養(yǎng)代謝和免疫功能的調(diào)控作用就顯得十分重要。在豬、禽等單胃動物的消化道中寄居著大量的活細(xì)菌,其每g濕糞便中含有5×109~5×1010的細(xì)菌。近年有零散報(bào)道,動物腸道微生態(tài)菌群對宿主具有促進(jìn)營養(yǎng)消化吸收、動物生長和生物拮抗等生理作用,并能刺激免疫功能,降低膽固醇,降低動物腹瀉率,促進(jìn)各種養(yǎng)分的利用和提高飼料轉(zhuǎn)化效率;但關(guān)于腸道微生物對畜禽營養(yǎng)代謝和免疫調(diào)控的機(jī)理卻少有報(bào)道,對畜產(chǎn)品品質(zhì)(如腹脂/體重)的影響也未見報(bào)道。本試驗(yàn)旨在系統(tǒng)研究由動物腸道中的優(yōu)勢菌群芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌組成的益生康微生物添加劑對宿主的生物學(xué)效應(yīng)和作用機(jī)理,為微生態(tài)營養(yǎng)理論和微生物飼料添加劑研發(fā)提供理論根據(jù)。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1只0只只2只2.試驗(yàn)雞用1日齡AA商品代肉用公母混合雛雞1000只;試驗(yàn)日糧參照美國國家研究委員會標(biāo)準(zhǔn)(NRC,1994)和AA雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn),自配飼料,基礎(chǔ)日糧配方和營養(yǎng)水平見表1。1.1.2抽樣混合物活菌1)益生康(Yishengkang)微生物飼料添加劑,由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室研制,6批產(chǎn)品抽樣混合物活菌含量為2×109?cfu/g,已登記國家發(fā)明專利;2)抗生素對照用黃霉素-80,德國赫斯特公司生產(chǎn),有效成分8%。1.2測試方法1.2.1日糧和日糧對試驗(yàn)將1000只試驗(yàn)用雞隨機(jī)分成5組,每組200只,5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)40只,自由飲水和采食。CK空組:空白對照組,飼喂基礎(chǔ)日糧(BD);CK抗組:抗生素對照,BD+黃霉素(有效)10mg/kg;Y0.05組:BD+0.05%益生康(YSK);Y0.1組:BD+0.1%YSK;Y0.2組:BD+0.2%YSK。1.2.2動物體內(nèi)免疫組化試驗(yàn)雞分3層籠養(yǎng),按肉雞常規(guī)飼養(yǎng)規(guī)程進(jìn)行,自動控溫,試驗(yàn)期6周,第7周為停藥期。1日齡頸部皮下注射馬立克疫苗(MB株,SOLVAY動物保健品公司)0.2mL/只,滴鼻點(diǎn)眼傳染性法氏囊(IBV)疫苗(以色列ABIC公司)各1滴,7日齡接種新城疫(NDV)凍干苗(cloe-30,LNTERVET公司)點(diǎn)眼、滴鼻各式各1滴。免疫試驗(yàn)各組雞左右大腿肌肉各注射0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的牛血清白蛋白(SBA)0.5mL(折合2.5mg/只);14日齡同前法進(jìn)行SBA強(qiáng)化免疫,以測定抗體。1.2.3生化指標(biāo)的測定1)生產(chǎn)性能、生長均勻度和臨床觀察指標(biāo):a.21和42d晨空腹稱雞活重、稱料,計(jì)算耗料、各組平均體重和飼料轉(zhuǎn)化效率;b.各組抽樣30只雞,個(gè)體稱重,計(jì)算平均體重的標(biāo)準(zhǔn)差,以其表示均勻度;c.試驗(yàn)期間每天觀察雞只的精神狀態(tài)、飲食欲和糞便狀態(tài),記錄各組死亡雞數(shù)。2)免疫學(xué)指標(biāo):a.胸腺、脾臟和法氏囊指數(shù)測定是在21和42d,每組隨機(jī)抽取15只雞,無菌心臟采血后屠宰,摘取脾臟、法氏囊以及左側(cè)胸腺,剔除脂肪后用電子天平稱鮮重,計(jì)算免疫器官重與體重的相對重量得到胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、法氏囊指數(shù),免疫器官指數(shù)=免疫器官重/體重。b.T或B淋巴細(xì)胞功能測定(又稱淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn))參見張日俊。c.BSA特異性抗體效價(jià)測定用ELISA方法經(jīng)方陣試驗(yàn)測得牛血清白蛋白(BSA)的最佳包被含量為10μg/mL,血清最佳稀釋倍數(shù)為1∶40。測定方法和程序參照張日俊進(jìn)行,以3個(gè)平行樣的平均OD值表示該樣品的抗體效價(jià),抗體效價(jià)=測樣OD值-陰性對照OD值。3)營養(yǎng)生化指標(biāo),包括血清中總蛋白(g/L)、球蛋白(g/L)、白蛋白(g/L)、脂肪酶活性(U/mgProt)、膽固醇(mmol/L)、甘油三醇含量(mmol/L):收集全血于試管,DL-4000型水平離心機(jī)3000r·min×30min,4℃分離血清,-20℃冷藏,用OLYMPUSAU-600全自動生化儀測定。4)腸道微生物學(xué)檢測:a.腸內(nèi)容物pH測定。屠宰后,用便攜式pH計(jì)測定每只雞十二指腸、空腸和回腸的pH值,用平均值表示。b.肉仔雞直腸、空腸每g內(nèi)容物所含大腸桿菌數(shù)和乳酸桿菌數(shù),參照陳天壽等方法進(jìn)行。于21日齡從每組隨機(jī)取15只雞處死,在3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))醫(yī)用甲酚皂液消毒液中浸泡10min以上,無菌解剖,取直腸及空腸中部(卵黃蒂前后2cm)貼近腸壁的內(nèi)容物放入無菌離心管內(nèi),準(zhǔn)確稱取內(nèi)容物重量,倍比稀釋。準(zhǔn)確吸取10μL稀釋后的樣本,滴入選擇性培養(yǎng)基,用滅菌曲玻棒推勻后培養(yǎng)。大腸桿菌在有氧培養(yǎng)箱中,乳酸桿菌在厭氧罐中37℃恒溫培養(yǎng)48h,然后進(jìn)行微生物菌落計(jì)數(shù),求其均值并計(jì)算每g內(nèi)容物所含細(xì)菌數(shù)。1.3數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析用SAS統(tǒng)計(jì)程序軟件包(V8.02)進(jìn)行方差分析和鄧肯氏多重比較。2結(jié)果與分析2.1臨床觀察的結(jié)果與空白對照組和抗生素對照組相比,益生康組雞體重大小均勻,成活率高(表2),羽毛干凈,飲水稍多,糞便較黑,臭味很小。2.2益生康對飼料轉(zhuǎn)化效率的改善力度畜禽的生產(chǎn)性能包括增重、飼料轉(zhuǎn)化效率和成活率,這是反映飼料添加劑有效性、安全性和經(jīng)濟(jì)性的重要指標(biāo)。試驗(yàn)表明(表2),CK空組雞的成活率顯著低于其他各組(P<0.05),且Y0.2組顯著高于CK抗組和Y0.05組(P<0.05),與Y0.1組相近;Y0.1組和Y0.2組42日齡的平均活體重和增重均顯著高于其他各組(P<0.05),平均總增重比CK空組分別增加6.6%(119.1g/只)和7.0%(127.4g/只),差異顯著(P<0.05)。益生康對飼料轉(zhuǎn)化效率的改善幅度較大,其中,添加Y0.05組、Y0.1組、Y0.2組分別比CK空組提高8.8%、10.5%和11.6%,差異極顯著(P<0.01),其中Y0.1組和Y0.2組顯著高于CK抗組(P<0.05)。從各項(xiàng)指標(biāo)看,Y0.2組>Y0.1組>Y0.05組>CK抗>CK空,說明益生康能極顯著提高飼料利用率(P<0.01)、增重和成活率(P<0.05),添加0.1%~0.2%益生康的效果好于抗生素。肉雞的均勻度是指活體重個(gè)體大小的差異,其大小直接影響雞群整體的生產(chǎn)性能、出肉率和經(jīng)濟(jì)效益。試驗(yàn)表明(圖1),在21和42日齡,CK抗組、Y0.05組、Y0.1組和Y0.2組肉仔雞的體重均勻度均極顯著高于CK空組(P<0.01),且0.2%組極顯著高于抗生素組。說明益生康能極顯著提高肉雞生長的整齊度,且隨益生康用量的增加,其均勻度也越來越好,這有助于提高肉雞的產(chǎn)品檔次和質(zhì)量。2.3各組大鼠免疫器官指數(shù)比較在21和42日齡,Y0.05、Y0.1和Y0.2組的胸腺、脾臟和法氏囊指數(shù)均極顯著高于CK空組和CK抗組(P<0.01),并隨益生康用量的增加,各免疫器官指數(shù)也增加。雖然添加0.2%益生康的各免疫器官指數(shù)均高于與Y0.1組,但無顯著差異(P>0.05),均顯著高于Y0.05組(P<0.05)(表3),這說明在肉仔雞飼料中添加0.1%的益生康即可明顯刺激免疫器官發(fā)育。2.4黃素對雞t或b細(xì)胞免疫功能的影響對于肉仔雞來說,生長期短,通常前3周的抗病力和生理狀態(tài)對其成活率和生產(chǎn)性能起著決定性作用。圖2顯示,肉仔雞21日齡時(shí),Y0.05組、Y0.1組、Y0.2組的T或B淋巴細(xì)胞對絲裂原的反應(yīng)性均顯著高于空白對照組(P<0.05),也極顯著高于抗生素組(P<0.01),且隨著益生康添加量的增加對T或B淋巴細(xì)胞激活的強(qiáng)度也愈加強(qiáng)烈。黃霉素組雞的淋轉(zhuǎn)率與空白對照組差異不顯著(P>0.05),并對T或B細(xì)胞免疫功能有一定的抑制。這表明益生康對T淋巴細(xì)胞接受絲裂原ConA和B淋巴細(xì)胞接受絲裂原LPS刺激的反應(yīng)性有極明顯的增強(qiáng)作用(P<0.01)。2.5抗體生素對p>0.1圖3結(jié)果表明,益生康各組的BSA抗體效價(jià)均顯著高于空白對照組(P<0.05),并極顯著高于抗體生素組(P<0.01)。BSA抗體水平隨益生康添加量的增加而增加,但0.1%和0.2%的益生康添加組間差異不顯著(P>0.05),說明添加0.1%益生康既經(jīng)濟(jì)又能增強(qiáng)體液免疫,而黃霉素沒有免疫刺激作用。2.6各組雞血清高爾夫球場的指標(biāo)血清總蛋白由血清白蛋白和球蛋白組成,其中球蛋白中的γ-球蛋白是血漿抗體活性的絕大部分。表4表明,益生康添加組血清中的總蛋白含量均顯著高于空白對照組(P<0.05),黃霉素組雖高于空白對照組,但差異不顯著(P<0.05)。另外,益生康各組雞的血清球蛋白含量均顯著高于空白對照組和黃霉素組(P<0.05),而空白對照組和黃霉素組間差異非常小(P>0.05)。同時(shí),益生康各組的白蛋白含量和白/球比明顯低于空白對照和黃霉素組,差異顯著(P<0.05),兩對照組間差異不顯著(P>0.05)。2.7黃素對大鼠血清生化指標(biāo)的影響在肉雞生產(chǎn)中不期望有較多的脂肪,特別是腹部脂肪。肉仔雞飼用益生康后,腹脂率(表5)顯著降低(P<0.05),同時(shí),血清中的脂肪酶的活性顯著高于對照組(P<0.05),總膽固醇、甘油三酯和腹脂率顯著低于對照組(P<0.05)。黃霉素對照組和空白對照組的各項(xiàng)指標(biāo)差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)還表明,隨益生康用量的增加,血清中的脂肪酶活性愈高,而總膽固醇、甘油三酯和腹脂率愈低,但添加0.1%和0.2%的益生康差異不顯著,表明益生康的最佳用量為0.1%。腹脂率的減少可改善肉雞產(chǎn)品的品質(zhì),并能提高出肉率,這在肉雞生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。2.8益生康對肉仔雞飼料營養(yǎng)的影響胃腸道的pH會影響胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、淀粉酶、脂肪酶、麥芽糖酶和乳糖酶等許多消化酶的活性,進(jìn)而影響日糧的總消化率和動物的生長速率。試驗(yàn)表明,肉仔雞飼用益生康能顯著降低十二指腸、空腸和回腸的pH值(P<0.05)(表6),酸化腸道環(huán)境。而酸化作用能激活腸道中與蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物代謝有關(guān)的酶類,進(jìn)而提高飼料養(yǎng)分的消化利用率。黃霉素沒有酸化作用,而益生康的酸化作用隨著飼用劑量的增加而增加,但添加0.1%和0.2%沒有顯著差異(P>0.05)。2.9各組乳酸桿菌、腸道乳酸桿菌、腸道乳酸桿菌的情況試驗(yàn)表明,益生康Y0.05組、Y0.1組、Y0.2組和黃霉素組雞空腸和直腸中的大腸桿菌數(shù)量(表6)均顯著低于空白對照組(P<0.05),而乳酸桿菌顯著高于空白對照組(P<0.05),且添加益生康0.1%或0.2%,腸道中的大腸桿菌顯著低于其他組,乳酸桿菌顯著高于其他組(P<0.05);隨益生康添加量的增加,大腸桿菌愈少,而乳酸桿菌愈多,這表明益生康能顯著調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生態(tài)菌群的種類和結(jié)構(gòu),并十分有利于雞的健康和腸道有益菌群的一系列生物學(xué)效應(yīng)。3討論3.1益盛康對肉雞營養(yǎng)代謝的調(diào)節(jié)1益生康對大鼠腹脂的影響本試驗(yàn)表明益生康能顯著降低血清甘油三酯(TG)和總膽固醇以及腹脂率,揭示其顯著影響脂類代謝和沉積。飼料中的脂肪在脂肪酶的作用下分解為脂肪酸和甘油,在這個(gè)過程中,益生康中的芽孢桿菌能產(chǎn)生脂肪酶直接參與該過程。Fukushima用混合益生菌14株,飼喂大鼠4周后,益生菌增加了短鏈脂肪酸并降低了血清及肝臟中的膽固醇濃度。Endo等將與Fukushima同樣菌株組合的益生菌制劑喂飼進(jìn)食高膽固醇飼料的公雞,獲得了相似的結(jié)果。短鏈脂肪酸的增多可降低血清膽固醇和TG,提高高密度脂蛋白(HDL)與TG的比值,有效地調(diào)節(jié)血脂。本試驗(yàn)說明,肉仔雞飼用益生康能顯著提高血清中脂肪酶的活性(表5),脂肪酶具有自動尋找體內(nèi)多余脂肪并進(jìn)行分解的特性,能夠?qū)⒅窘到鉃橹舅岷透视?把多余的脂肪分解轉(zhuǎn)化為能量消耗掉,從而抑制了脂肪的合成和沉積。益生康通過上述途徑最終降低了腹脂的沉積。在現(xiàn)代肉雞生產(chǎn)中,如何減少高強(qiáng)度育肥肉仔雞的體脂過度沉積一直倍受關(guān)注,本研究觀察到的益生康微生物添加劑可顯著減少肉仔雞腹脂沉積的結(jié)果為解決這一問題提供了借鑒。2細(xì)菌代謝及蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)表明(表4),益生康各組雞血清中的總蛋白含量均顯著高于空白對照組和黃霉素組(P<0.05),說明益生康對蛋白質(zhì)代謝有調(diào)控作用。在腸道,來自飼料(外源的)和內(nèi)源的蛋白和肽經(jīng)宿主和腸道細(xì)菌蛋白酶與肽酶的雙重作用下,水解成氨基酸和小肽,大部分被動物吸收利用,少部分氨基酸經(jīng)腸道細(xì)菌作用通過以下3個(gè)途徑進(jìn)行代謝:a.產(chǎn)生H2、CO2、CH4、硫醇、硫化氫從呼吸道和胃腸氣排出;b.形成酚、吲哚、胺、氨、尿酸從糞尿排出;c.代謝成有機(jī)酸供宿主生物合成和產(chǎn)能反應(yīng)。在腸道中死亡的細(xì)菌蛋白也參與了上述全部過程,并在溶解時(shí)釋放大量蛋白酶,使大腸內(nèi)蛋白質(zhì)的分解能力大大提高,未死亡的細(xì)菌由糞便排出體外。益生康微生物通過以下3個(gè)直接或間接的途徑參與了蛋白質(zhì)代謝:a.芽孢桿菌能分泌大量胞外酶,如蛋白酶直接參與蛋白質(zhì)代謝,同時(shí)產(chǎn)生氨基化氧化酶及分解硫化物的酶類可將吲哚類化合物完全氧化成無臭無毒害和對環(huán)境無污染的物質(zhì);b.酵母菌能以蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的尿素等非蛋白氮作為氮源合成菌體蛋白,從而提高氮的利用率,減少糞氮的排放;c.乳酸菌通過產(chǎn)酸酸化腸道環(huán)境,增加蛋白酶活性來參與蛋白質(zhì)代謝過程。3.2芽孢桿菌促進(jìn)生長機(jī)理益生康中的乳酸菌是動物消化道中的優(yōu)勢菌群,可“終生為伴,終生為益”,發(fā)揮著拮抗病原微生物、啟動特異和非特異性免疫系統(tǒng)、降低膽固醇、中和腸毒素、合成營養(yǎng)物質(zhì)、產(chǎn)生消化酶類并調(diào)節(jié)畜禽營養(yǎng)代謝的功能。酵母菌不僅能幫助動物消化,還能促進(jìn)消化道內(nèi)源有益微生物的活力和數(shù)量增加,補(bǔ)充B族維生素,其細(xì)胞壁多糖還具有刺激動物免疫力,提高抗病力的功效。益生型芽孢桿菌可產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶等活性物質(zhì),對蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和利用發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。因此,益生康的促進(jìn)生長的機(jī)理可概括為:一是通過微生物分泌的消化酶或酸化作用(表6)激活消化酶來提高飼料營養(yǎng)素的吸收利用率;二是通過刺激免疫力和優(yōu)化腸道菌群(表6),提高肉仔雞的健康狀況和生理活性來發(fā)揮促生長作用;三是通過微生物產(chǎn)生的B族維生素、有機(jī)酸等營養(yǎng)物質(zhì)來提高生長性能。3.3菌種和培養(yǎng)基益生康含有乳酸菌、芽孢桿菌和酵母等有益微生物,每種微生物本身是一種抗原,能激活免疫系統(tǒng),刺激免疫器官的生長發(fā)育(表3),也能激活T或B細(xì)胞(圖2),使產(chǎn)生免疫球蛋白的能力增加(表4),表現(xiàn)為雞體的BSA抗體效價(jià)(圖3)升高,這就是益生康調(diào)控免疫功能的根本機(jī)制。益生康中的芽孢桿菌和乳酸桿菌是G+菌,其細(xì)胞壁除有肽聚糖(peptidoglycan,PG)和多糖(polysaccharide,PS)外還有脂磷壁酸(lipoteichoicacid,LTA),酵母的細(xì)胞壁含有大量多糖(PS),PG和PS能直接活化宿主的巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫系統(tǒng),進(jìn)而促進(jìn)免疫器官的生長發(fā)育。Hamann報(bào)道,被活化的巨噬細(xì)胞可釋放NTF-α、IFN-α、IL-1、IL-6、IL-8和IL-12,這些細(xì)胞因子是發(fā)揮免疫調(diào)控的重要成員。此外,乳酸桿菌還產(chǎn)生一氧化氮合成酶1,一氧化氮(NO)是機(jī)體內(nèi)細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)信息傳遞的免疫調(diào)節(jié)分子、信使分子和效應(yīng)分子,在動物和人的神經(jīng)、心血管和免疫系統(tǒng)中參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、信號傳遞、血管舒張(松馳因子)、抗血小板聚集和記憶的生理過程。Fuller報(bào)道,直接飼用微生物可以提高畜禽抗體水平或提高巨噬細(xì)胞的活性,增強(qiáng)免疫功能,它們能刺激腸道免疫組織或機(jī)體免疫器官生長,激發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫。3.4短鏈脂肪酸的降解肉仔雞飼用益生康能明顯酸化腸道環(huán)境(表6),并抑制大腸桿菌等有害微生物的生長,刺激乳酸菌等有益菌的生長,從而改變腸道菌群結(jié)構(gòu)和比例。酸化作用還可補(bǔ)充胃中的限制酸,對能量代謝產(chǎn)生有利影響。微生物代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸主要是乙酸、丙酸、丁酸和乳酸,在腸道上皮細(xì)胞代謝中具有重要的意義,其中丁酸是這些細(xì)胞的特別重要的能量來源,約60%~70%的能量來自于細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)物。短鏈脂肪酸(SCFA)產(chǎn)生的二氧化碳和酮體是黏膜脂類合成的前體。丁酸可促進(jìn)細(xì)胞分化,抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長。丁酸對細(xì)胞分化的影響與控制基因表達(dá)有關(guān),丁酸可改變多種基因的表