切片標(biāo)本的制作

2/7切片標(biāo)本的制作本次試驗(yàn)承受的是石蠟切片法。石蠟切片法的程序如下：TT沖洗〔洗滌〕TTTTTTT脫蠟TTTT封藏。上述每個(gè)程序的要求和方法可歸納為透蠟制片和染色兩大步驟，現(xiàn)簡(jiǎn)潔介紹如下：脫水步驟為：將組織塊浸入系列酒精70%>80%>95%>100%>100%30min。脫水的實(shí)際時(shí)間長(zhǎng)短視組織塊的大小而定，但不宜過(guò)長(zhǎng)。透亮步驟為：將組織塊浸入二甲苯與無(wú)水乙醇〔1:1〕的混合液30min—二甲苯30min—30min。透蠟步驟為：將組織塊浸入二甲苯與石蠟〔1:1〕30min30min-石蠟30min。脫蠟程序?yàn)?純二甲苯〔脫蠟〕15min—純二甲苯15min—二甲苯：純乙醇〔11〕3min復(fù)水程序?yàn)椋杭円掖?min—95%乙醇3min—90%乙醇3min—80%乙醇3min—70%乙醇3min60%3min50%3min30%3min—蒸餾水H、E染色程序?yàn)?將已復(fù)水的切片放入蘇木精染液中〔30分鐘以上〕，水洗2分鐘，在0．5%的鹽酸水中分色3秒〔當(dāng)在顯微鏡下檢查時(shí)，核褪至淡紅色，細(xì)胞質(zhì)及結(jié)締組織幾近無(wú)色即可〕蒸餾水洗1分鐘，0．1%氨水中藍(lán)化〔1~3分鐘，核呈藍(lán)紫色〕，蒸餾水洗〔1分鐘〕，切片由低至高濃度的系列酒精中脫水〔每級(jí)3~5分鐘〕95%乙醇-切片入0.5%伊紅中復(fù)染〔3分鐘〕〔95%乙醇配制的〕-95%乙醇中分色〔顯微鏡檢查呈藍(lán)紫色，胞質(zhì)及結(jié)締組織為粉紅色〕-95%乙醇輕洗〔除去玻片上多余的伊紅染液。動(dòng)作要快速，否則組織上的伊紅要脫下來(lái)〕。透亮程序?yàn)椋簩⒁衙撍那衅来畏湃爰円掖迹憾妆健?:1〕—15分鐘。.2.1透蠟制片1.2.、取材從試驗(yàn)羅非魚(yú)最終一根背鰭下方用解剖刀取下

3X3X4m左右的穎肌肉塊取材時(shí)要留意組織塊方向與肌纖維走向要全都。同時(shí)，取材時(shí)動(dòng)作快速，保持組織的穎，取材所用的解剖刀要銳利。1.2.1.2、固定把取下的肌肉組織塊快速投入已預(yù)先配制好的 Bouin,s固定劑中固定。固定劑中的藥品可以使構(gòu)成組織的蛋白質(zhì)變性分散，組織塊硬化，從而保持組織及細(xì)胞的原來(lái)形態(tài)構(gòu)造。Bouin,s固定劑配方如下：苦味酸飽和溶液75mlxx25ml5ml1．2．、沖洗〔洗滌〕肌肉塊經(jīng)固定劑的處理，會(huì)在肌肉的外表或內(nèi)部殘留著組織液，這些殘留的藥品假設(shè)不除去，將會(huì)對(duì)以后的制片過(guò)程產(chǎn)生不良影響，所以肌肉從固定劑中取出后，必需經(jīng)流水沖洗或數(shù)次的乙醇洗滌，使得組織中殘留的固定劑全部除去為止。1．2．、脫水的目的在于去除肌肉中的水分。在石蠟制片法中所用的滲透和包埋劑就是石蠟，由于石蠟和水是不相溶的。因此為了使石蠟?zāi)芎芎玫貪B透進(jìn)肌肉組織的每個(gè)局部，就必需先把肌纖維細(xì)胞中的水分除去，在脫水時(shí)要用從低濃度到高濃度的系列酒精逐步脫水，這樣可避開(kāi)肌纖維因脫水而過(guò)分地收縮。脫水需徹底。脫水步驟為：將組織塊浸入系列酒精70%>80%>95%>100%>100%30min。脫水的實(shí)際時(shí)間長(zhǎng)短視組織塊的大小而定，但不宜過(guò)長(zhǎng)。1．2．1．5、透亮肌肉組織經(jīng)脫水后，石蠟也不能直接滲透進(jìn)肌肉組織。此時(shí)還必需將肌肉塊中所含的乙醇除去，除去乙醇的藥品必需既能很好的與乙醇相溶，又能與石蠟相溶。經(jīng)這種藥品處理過(guò)的肌肉，使肌肉呈現(xiàn)透亮狀，所以稱為透亮劑。因此，這種處理程序就叫透亮。這里承受的透亮劑是二甲苯。當(dāng)肌肉組織中的乙醇被透亮劑替代后，肌肉組織才能透蠟包埋。透亮步驟為：將組織塊浸入二甲苯與無(wú)水乙醇〔1:1〕30min30min—二30min。1．2．、透蠟是使包埋劑透入進(jìn)肌肉組織的各個(gè)局部的過(guò)程。透蠟是肌肉組織可在切片機(jī)上制作切片的需要。石蠟在常溫下呈固體狀，它是具有確定的熔點(diǎn)，透蠟時(shí)必需使石蠟熔化為液體狀態(tài)才能使石蠟滲入肌肉組織，所以透蠟過(guò)程必需在恒溫箱中進(jìn)展。透蠟步驟為：將組織塊浸入二甲苯與石蠟〔1:1〕30min30min-石蠟30min。1．2．及制作薄的石蠟切片。包埋時(shí)把熔化的石蠟倒入小容器內(nèi)，然后快速夾取肌肉組織放入小容器中，并適當(dāng)調(diào)整肌肉組織塊的位置和方向，待容器中的石蠟快速凝成蠟塊。1．2．支撐，經(jīng)修整后便可以放在切片機(jī)上切成極薄的石蠟切片。切片的厚度為8um。1．2．放在均勻涂過(guò)蛋白質(zhì)的載玻片上，滴上蒸餾水使其在展片臺(tái)上加熱，在加熱過(guò)程中使蠟條適當(dāng)?shù)厣扉_(kāi)放，以此使組織伸展平正，然后把玻片上多余的水分去掉。1．2．1、烘片把貼好蠟片的載玻片置于3C 的恒溫箱中烘烤24小時(shí)以上,使片枯燥。122染色上系列標(biāo)簽并參與相應(yīng)的藥品。1．2．、脫蠟通過(guò)切片、貼片及烘片后，肌肉組織仍埋藏在蠟中，為了使肌肉組織順當(dāng)染上色，必需先將肌肉組織切片上的蠟去掉，因此要把貼片烘干后的的玻片放入含有二甲苯的染色缸內(nèi)，使蠟溶解在二甲苯中。脫蠟程序?yàn)椋杭兌妆?脫蠟)15min—純二甲苯15min—二甲苯：1：1)3min1．2．、復(fù)水在肌肉組織透蠟包埋前已把肌肉組織中的水去除干凈了，而沒(méi)有經(jīng)過(guò)復(fù)水處理的肌肉組織切片不能放入水溶性的染料中染色，所以染色前肌肉組織切片中必需經(jīng)復(fù)水處理，也就是使得肌肉組織中含有水分。肌肉組織切片復(fù)水過(guò)程必需漸漸進(jìn)展，即從純乙醇——經(jīng)下降的各濃度系列酒精直至水，每級(jí)3~5分鐘。在水中的放置時(shí)間要稍加長(zhǎng)，大約10分鐘以上，蘇木精染液才能上色。復(fù)水程序?yàn)椋杭円掖?min—95%乙醇3min—90%乙醇3min—80%乙醇3min—70%乙醇3min60%3min—50%3min—30%3min—蒸餾水1．2．3、染色組織或細(xì)胞的很多構(gòu)造在自然狀態(tài)下是無(wú)色或具有很淡的顏色的，要區(qū)分出組織和細(xì)胞的各種構(gòu)造是極為困難的，為了更好地對(duì)組織的各種構(gòu)造進(jìn)展觀看，必需染色。染色時(shí)將切片放入預(yù)先制好的染色劑內(nèi)，依據(jù)不同的目的、不同的染色劑的要求染色確定時(shí)間后取出切片，切片再行水洗、分色或復(fù)染等程序的處理。本試驗(yàn)的染色承受蘇木精(hematoxylin)、伊紅(eosinH、E染色法。蘇木精是一種堿性染料，組織或細(xì)胞中由酸性物質(zhì)構(gòu)成的構(gòu)造，如細(xì)胞核中的核酸等可被它染成藍(lán)紫色。組織或細(xì)胞中可被堿性染料著色的構(gòu)造或成分稱為嗜堿性。依據(jù)配制方法的不同，蘇木精可配成多種蘇木精染料。伊紅是一種酸性染料，細(xì)胞中由堿性物質(zhì)構(gòu)成的構(gòu)造可被染成紅色或粉紅色〔如細(xì)胞質(zhì)〕，這種構(gòu)造或成分稱為嗜酸性物質(zhì)。H、E染色程序?yàn)椋?/7將已復(fù)水的切片放入蘇木精染液中〔30分鐘以上〕，水洗2分鐘，在0．5%的鹽酸水中分色3秒〔當(dāng)在顯微鏡下檢查時(shí)，核褪至淡紅色，細(xì)胞質(zhì)及結(jié)締組織幾近無(wú)色即可〕1分鐘，0．1%氨水中藍(lán)化〔1~3分鐘，核呈藍(lán)紫色〕，蒸餾水洗〔1分鐘〕，切片由低至高濃度的系列酒精中脫水〔每級(jí)3~5分鐘〕95%乙醇-切片入0.5%伊紅中復(fù)染〔3分鐘〕〔95%乙醇配制的〕-95%乙醇中分色〔顯微鏡檢查呈藍(lán)紫色，胞質(zhì)及結(jié)締組織為粉紅色〕-95%乙醇輕洗〔除去玻片上多余的伊紅染液。動(dòng)作要快速，否則組織上的伊紅要脫下來(lái)〕。I. 2.2. 4、脫水為了長(zhǎng)期保存切片，已染色的切片必需脫水才能封藏。所以切片再入純乙醇中脫水兩次。脫水程序?yàn)椋杭円掖饥?純乙醇⑵1.2.2. 5、透亮為了更有利于對(duì)組織和細(xì)胞的內(nèi)部構(gòu)造進(jìn)展觀看分析，還必需對(duì)組