免疫熒光染色方法

..--免疫熒光染色方法免疫熒光染色方法〔一〕制片〔一〕制片成適當(dāng)大小印壓于玻片上。也可承受冰凍切片或石蠟切片樣品?！捕彻潭ā捕彻潭ǔ隣幷摷?xì)胞外表抗原或不穩(wěn)定抗原可不固定外，一般均應(yīng)固定。固定的作用有三：①防止標(biāo)本從玻片上脫落；②除去防礙抗原—抗體結(jié)合的類脂，使抗原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果；③固定的標(biāo)本易于保存，如組織切片固定后在-20℃下可保存一年而不轉(zhuǎn)變其染色特性。入與抗原結(jié)合。抗原物質(zhì)常用抗原物質(zhì)的固定方法固定劑固定條件〔min〕蛋白質(zhì)抗原95%～100%乙醇3～10酶、激素丙酮4℃30免疫球蛋白四氯化碳病 毒病 毒丙酮、四氯化碳、無水乙醇5～10430～60嗜性抗原〕多糖、細(xì)菌等105～10酮4℃30～類 脂 〔異10%甲醛，10ForMol〕603～10〔三〕水洗〔三〕水洗固定后以冷的0.01Mol/LpH7.4PBS防止自發(fā)性熒光。〔四〕染色〔四〕染色染色分直接染色法與間接染色法。材料與試劑〔1〕熒光抗體，稀釋至應(yīng)用濃度?！?〕0.01Mol/LpH7.4PBS液〔3〕91份pH7.4PBS非特異性熒光的作用?！?度，加蓋，37℃30min～45min?！?〕PBS33min3×3ˊ沖洗?！?〕蒸餾水沖洗?！?〕滴甘油緩沖液一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。間接染色法〔1〕檢查抗原：①取固定標(biāo)本，加的免疫血清，37℃孵育30min；②以PBS3×3ˊ沖洗；③再加熒光標(biāo)記的抗抗體，37℃孵育30min；④PBS3×3ˊ沖洗；⑤H2O〔2〕檢查抗體：①以免疫后動物的淋巴組織涂片，自然枯燥，甲沖洗；⑥水洗，涼干；⑦加甘油緩沖液，封片、鏡檢?！参濉辰Y(jié)果顯示〔五〕結(jié)果顯示來，綜合判定。熒光強度的表示方法如下：＋＋＋～＋＋＋＋：熒光閃亮，呈明顯的亮綠色。＋＋：熒光光明，呈黃綠色。＋：熒光較弱，但清楚可見?！溃簶O弱的可疑熒光。—：無熒光?！擦硺?biāo)本保存〔六〕標(biāo)本保存光染色之后應(yīng)馬上觀看。染；②染色片實行優(yōu)質(zhì)封固劑，如特別的熒光封固劑〔Fluormount〕或保存；④可以承受拍照保存照片。熒光原位雜交〔熒光原位雜交〔FISH〕試驗步驟儀器設(shè)備1、醫(yī)用微波爐；儀器設(shè)備2、水浴鍋；3、OLYMPUSBX51熒光顯微鏡；4、OLYMPUSDP11FISH試劑〔11×PBS：10×PBS溶液稀釋而成，儲存于4℃；〔2〕20×SSC〔pH7.0〕；〔3〕2×SSC，20×SSC溶液稀釋而成；〔4〕25mg/ml蛋白酶K蒸餾水；28ml甲酰胺。每次穎配制。〔620×SSC4ml；蒸餾水16ml；甲酰胺20ml。每次穎配制。調(diào)整pH前升至室溫。試驗步驟1、脫蠟：試驗步驟1〕二甲苯脫蠟3次，每次5min；2〕100％酒精兩次，每次2min；3〕移出酒精，斜置切片，標(biāo)記末段向下，空氣枯燥。2、蛋白酶處理:140ml蛋白酶K2×SSC40mlFacal直到酶溶解。2〕37℃水浴槽中預(yù)熱染色缸和蛋白酶K37℃孵育20min。3〕×SSC在室溫下漂洗切片3次，每次1min。4〕梯度酒精脫水〔-20℃預(yù)冷〕。3、變性：1〕每一個立式染色缸配制40ml變性溶液；2〕78℃水浴槽中平衡預(yù)熱混合液染色缸；3〕788min；4〕即移入-20℃預(yù)冷70%酒精的染色缸2min，再依次移入80%、90100%的-20℃預(yù)冷酒精，每缸2min；5〕空氣枯燥。4、雜交：1〕預(yù)備探針；2〕取一個較大的濕盒，穿插放置切片；310μl探針在切片的組織上，加蓋玻片；4〕蓋上濕盒蓋，3712h～16h。雜交后的水洗：5〕鑷子留神去除蓋玻片；6〕43℃預(yù)熱雜交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7〕2×SSC(37℃)洗兩次，每次10min；81×PBS檢測：9〕從1×PBS中取出切片，除去過多的水分，防止標(biāo)本枯燥。把切片放入濕盒，同時處理41030μl～60μlFITC素，室溫下孵育20min；11〕去掉塑料蓋膜，把切片放入含1×PBS1×PBS室溫下洗32min。擴增：121×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出；1330μl～60μl孵育20min；14〕去掉塑料蓋膜，把切片放人含1×PBS1×PBS室溫下洗32min；151×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出；1630μl～60μl孵育20min；17〕1×PBS32min。5、細(xì)胞核染色：110μl～20μlDAPI，掩蓋蓋玻片并在室溫下孵育2～5ml；2〕盡可能快的在熒光顯微鏡下觀看或封閉盒保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h可以在顯微鏡下觀看。PRINS1、常規(guī)脫蠟浸入0.01mol/LPBS；2PRINS3、蛋白酶K(25μg/m1)消化37℃15min；480％，95100％酒精脫水，室溫干片；5、加PCR混合液25μL(10mmol/LTris-HCl，50mmol/LKCl，1.5mmol/LMgCl2，各加200μmol/LdATP，dCTP，dGTP，1.5mmol/Ldig-11-dUTPl.5μl，引物250ng，TaqDNA2U)，加蓋片；6、945min后置入655min；70.1×SSC液，655min；865℃10s～20s4×SSC-0.1％吐溫20液42℃洗5min，29、經(jīng)BufferI液洗后滴加20％羊血清封閉30min；10、加地高辛抗體復(fù)合物(1:500)室溫下2h；11、Buffer5min；12、用BCIP-NBT顯色1h～2h，在鏡下把握，終止顯色；片。FISH-熒光原位雜交試驗〔原位雜交〕1.FISH-熒光原位雜交試驗〔原位雜交〕1.試驗?zāi)康牡氖褂梅椒ā?.2.試驗原理熒光原位雜交〔FluorescenceinsituhybridizationFISH〕是一門2080基因組進化爭論等很多領(lǐng)域。FISHDNA學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。雜交所用的探針大致可以分為三類：1〕染色體特異重復(fù)序列探針，例如aIII1Mb，2〕全染色體或染色體區(qū)域特異性探針，其由一條染色體或染色體和質(zhì)粒中的染色體特異大片段獲得；3〕特異性位置探針，由dUTP(biotin-dUTP)500bp接標(biāo)記的方法。3.3.試驗用具及材料YNikonE-400、熒光顯微鏡、蓋玻片、封口膜、200mL20mL氯化鈉、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、吐溫20。4.4.試驗方法及步驟1175℃怛溫水浴中溫5min0℃，5～10min，使雙鏈DNA2〕標(biāo)本變性①將制備好的染色體玻片標(biāo)本于50℃培育箱中烤片2～3hGiemsa②取出玻片標(biāo)本，將其浸在70～7570%甲酰胺/2×SSC2～3min。③馬上按挨次將標(biāo)本經(jīng)體積7090100%冰乙醇系列脫水，每5min，然后空氣枯燥。2DNA10mL18×18Parafilm37℃要交過夜〔約15～17h此過程在濕盒中進展。3〔137℃溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉242～50℃的體積50%甲酰胺/2×SSC3次，每次5min3〕在已預(yù)熱42～501×SSC中洗滌35min4〕在室溫下，將玻片標(biāo)本2×SSC中輕洗一下。4〕雜交信號的放大20min2150mLavidin-FITC于標(biāo)本上，用保鮮膜掩蓋，3740min3〕取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～5035min4〕在玻片標(biāo)本的雜交部位加150mL封閉液II，掩蓋保鮮膜，37℃溫育20min5150mLantiavidin于標(biāo)本上，掩蓋42～50℃的洗脫液中，洗滌35min?！?〕重復(fù)步驟〔1232×SSC中室溫清洗一下?！?9200mLPI/antifade染液滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。5〕封片5〕封片可承受不同類型的封片液。假設(shè)封片中不含有Mowiol〔可使封使用指甲油將蓋片四周封閉。封好的玻片標(biāo)本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久。66FISHFITC的激發(fā)波長為490nmPIFITCY附錄I附錄IFISH1〕20×SSC：175.3gNaCl,882.g檸檬酸鈉，加水至1000mL〔用10mol/LNaOH調(diào)pH7.0〕。2DF10g100mL甲酰胺中。電磁攪拌30min，用Whatmanl號濾紙過濾。370%甲酰胺/2×SSC：35mL，5mL20×SSC，10mL水。450%甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺，20mL20×SSC，80mL水。550保存。6〕雜交液：8mL體積分?jǐn)?shù)25%DS，20mL20×SSC混合?！不?0mL50%DS，20mL20×SSC，40mLddH2O50mL，與5mLDF10%DS2×SSC，體積分?jǐn)?shù)50%DF。7〕PI/antifade溶液PI100mg/mL，取出1mL，39mL雙蒸水，使終濃度為2.5mg/mL。AntifadePBS10mg/mL，0.5mmol/L的NaHCO3調(diào)pH8.01mL，加9mLPI/antifadePI與antifade原液按體積比19比例充分混勻，-20℃保存?zhèn)溆谩?〕DAPI/antifade溶液：用去離子水配制1mL/mgDAPI儲存液，按體積比1:300antifade溶液稀釋成工作液。Tween205mL混合。250mL,ddH2O750mL,Tween205mL混合。ddH2O3mL,Tween205mL混合。12100mL20×SSC，加水于500mL，加Tween20500mL。13〕TEpH8.0:10mmol/LTris,HCl,1mmol/LEDTA；pH7.6:10mmol/LTris,HCl,1mmol/LEDTA；pH7.4:10mmol/LTris,HCl,1mmol/LEDTA。14〕溶液I：25mmol/LTrisHCl(pH7.4),10mmol/LEDTA。15〕溶液II：10%SDS，0.2MNaOH。16〕溶液III：Kac14.7g,HAc5.8mL,加水至50mL。17LB10g5g,NaCl10g,加水1000mL5mmol/LNaOH調(diào)pH7.0。附錄II附錄IIDNA探針的制備DNA1〕用接種環(huán)挑取一小塊-705mLLB基中，37℃猛烈震蕩過夜。2〕將收集到的菌液3000r/min離心10min，棄掉上清液。3〕向菌體沉淀中參與溶液I300mL,溶液II350mL，混勻后將其III350mL1：1〕500mL后充分混勻。4〕12023r/min離心10min。5600mL12023r/min離心15～30min，棄掉上清液。61500mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌沉淀2～37〕用TE緩沖液溶解DNA8〕加水至200mL，以Rnase200mg/mL50℃水浴中消化30min。9〕參與酚、氯仿和異丙醇〔三者體積比25：24：1〕溶液200mL混勻，12023r/min離心2min。10混勻，12023r/min離心2min。1120mL3MNaAc500mL100%乙醇沉淀DNA。12-7030min1hDNA，然后用12023r/min離心15min。131.5mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇輕洗，自然晾干。14〕用TE緩沖液溶解DNA。151～2mLDNA8.0g/L/TBE緩沖液凝膠電泳鑒定DNA并檢測濃度。/mL37℃水浴中酶解2～4h。17DNA片段大小。III探針的生物素標(biāo)記探針的標(biāo)記可承受PCR缺口平移法來制備。該過程包括以DNaseI在DNAId-NTP承受缺口平移法，按GIBCObiotin-14-dATP標(biāo)記探針。標(biāo)記好的探針可以在-20℃下長期保存?？偡从丑w積50mL，DNA1mg,10×dNTP5mL,10×EnzymeMix5mL。10×dNTP：500mmol/LTris·HCl(pH7.8)50mmol/LMgCl2100mmol/Lβ-硫基乙醇100mg/ml去除核酸酶的牛血清白蛋白0.2mmol/LdCTP,0.2mmol/LdGTP,0.2mmol/LdTTP0.1mmol/LdATP,