氨基酸多肽和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)

第十章

氨基酸、多肽因子和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)1整理課件第九章

抗生素類藥物分析與生物檢定法根本要求：掌握氨基酸定性鑒別的方法，熟悉氨基酸特殊雜質(zhì)及平安性檢查，掌握氨基酸含量測(cè)定方法，掌握多肽因子類藥物的定性鑒別方法，熟悉多肽因子類藥物的檢查方法，掌握多肽因子類藥物生物效價(jià)的測(cè)定方法，掌握蛋白質(zhì)類藥物的鑒別和檢查方法，掌握蛋白質(zhì)含量測(cè)定和效價(jià)測(cè)定方法，了解幾種氨基酸、多肽因子和蛋白質(zhì)藥物的質(zhì)量分析過程。2整理課件第九章

抗生素類藥物分析與生物檢定法根本內(nèi)容第一節(jié)氨基酸類藥品檢驗(yàn)第二節(jié)多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)第三節(jié)幾種氨基酸、多肽因子和蛋白質(zhì)藥物的質(zhì)量分析3整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)氨基酸是治療蛋白質(zhì)代謝紊亂、蛋白質(zhì)缺損所引起的一系列疾病的重要生化藥物，也是具有高度營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑，有著廣泛的生化作用和臨床療效。目前氨基酸及其衍生物臨床應(yīng)用不斷開展和擴(kuò)大，創(chuàng)制了一些新的生化藥物。如甲基酪氨酸治療嗜鉻細(xì)胞瘤氧苯丙氨酸用于類癌瘤綜合征偶氮絲氨酸治療白血病乙酰羥脯氨酸用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎4整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)氨基酸為白色晶狀體，熔點(diǎn)很高，多在熔融時(shí)分解，都能溶解在強(qiáng)酸強(qiáng)堿中，形成的鹽多能溶于水。氨基酸在等電點(diǎn)〔pI〕時(shí)溶解度最小，最穩(wěn)定。中性pI值在5～6.3左右。酸性pI值在2.8～3.2左右。堿性氨基酸的pI值在7.6～10.8左右。5整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)一、氨基酸的定性鑒別旋光度、熔點(diǎn)、溶解度、紙層析、氨基酸自動(dòng)化分析、氣相色譜等均可作為氨基酸鑒別的依據(jù)。1、化學(xué)鑒別法氨基酸的鑒別最常用的方法是根據(jù)所有氨基酸均能與茚三酮顯藍(lán)紫色。采用茚三酮顯色法，中國(guó)藥典〔2021年〕二部對(duì)所收載的氨基酸類藥物大多采用此方法進(jìn)行鑒別。如要對(duì)某種氨基酸加以鑒別，可借助于一些特定的顯色反響。6整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)〔1〕茚三酮反響茚三酮在酸性溶液中與α-氨基酸共熱，引起氨基酸氧化脫氫、脫羧反響，最后生成紫色物質(zhì)。7整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)〔2〕在室溫下氨基酸與亞硝酸反響，生成氮?dú)?。在?biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定生成氮?dú)怏w積，即可計(jì)算氨基酸的量。注：生成的氮?dú)庵挥幸话雭碜园被帷?整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)〔3〕9整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)〔4〕10整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)〔5〕11整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)〔6〕12整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)〔7〕13整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)〔8〕乙醛蒸氣接觸亞硝基鐵氰化鈉和二乙胺時(shí)藍(lán)紫色14整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)〔9〕組氨酸的側(cè)鏈咪唑基也能與重氮苯磺酸反響形成與Pauly反響相似的化合物，呈棕紅色。15整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)〔10〕借助這些特定的顯色反響可以對(duì)氨基酸進(jìn)行鑒別。16整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)2、光譜鑒別法〔1〕紫外吸收光譜法在20種天然氨基酸中，只有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸在紫外區(qū)有最大吸收。酪氨酸的max＝275nm275=1.4x103苯丙氨酸的max＝257nm257=2.0x102色氨酸的max＝280nm280=5.6x10317整理課件1：酪氨酸2：色氨酸3：苯丙氨酸。第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)這三種氨基酸可以通過紫外吸收光譜加以鑒別。精密稱取酪氨酸、色氨酸、苯丙氫酸各適量。用水制成每1mL含20μg〔色氨酸〕、40μg〔酪氨酸〕、200μg〔苯丙氨酸〕。在波長(zhǎng)230～300nm測(cè)定各氨基酸的吸收光譜，如右圖。18整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)〔2〕紅外吸收光譜圖氨基酸在紅外區(qū)都有特性圖譜，可以通過與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸圖譜比較作為氨基酸的鑒別依據(jù)。用紅外分光光度法進(jìn)行氨基酸鑒別時(shí)，除另有規(guī)定外，通常固體供試品均采用溴化鉀片法，在400～667cm-1范圍內(nèi)測(cè)定其吸收?qǐng)D譜。所得的吸收?qǐng)D譜各主要吸收峰波長(zhǎng)和各吸收峰間的相互強(qiáng)度關(guān)系均應(yīng)與對(duì)照的圖譜一致。19整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)3、薄層色譜鑒別法在薄層板上點(diǎn)樣，通過與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸對(duì)照而鑒別氨基酸?！?〕薄層板的制備20整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)〔2〕十一種氨基酸混合液〔色、蛋、亮、異亮、甘、賴、蘇、纈、苯丙、組、精〕與對(duì)照液的制備。21整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)〔3〕點(diǎn)樣、展開和顯色吸取混合液和對(duì)照液各3μL，分別點(diǎn)于同一薄層板上。以正丁醇-水-異丁酸-醋酸〔50︰50︰5︰7〕之上層作展開劑，進(jìn)行單向三次展開，展開約15cm，每次必須待溶劑揮發(fā)盡后，再進(jìn)行下一次展開。噴以顯色劑〔吲哚醌1g，溶于100mL無水乙醇和10mL冰醋酸中〕置100℃枯燥5～10min至顯色完全為止。22整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)本層析系統(tǒng)中，由于別離的程度與各種氨基酸顯出不同的顏色，可以區(qū)別十一種氨基酸。用茚三酮-硝酸鈉試劑亦能顯出不同顏色的色斑，且靈敏度較高。用E.Merck規(guī)格微晶纖維素比其他規(guī)格的微晶纖維素的別離效果和重現(xiàn)性較好。23整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)〔3〕點(diǎn)樣、展開和顯色吸取混合液和對(duì)照液各3μL，分別點(diǎn)于同一薄層板上。以正丁醇-水-異丁酸-醋酸〔50︰50︰5︰7〕之上層作展開劑，進(jìn)行單向三次展開，展開約15cm，每次必須待溶劑揮發(fā)盡后，再進(jìn)行下一次展開。噴以顯色劑〔吲哚醌1g，溶于100mL無水乙醇和10mL冰醋酸中〕置100℃枯燥5～10min至顯色完全為止。24整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)二、氨基酸特殊雜質(zhì)及平安性檢查1、特殊雜質(zhì)檢查氨基酸原料藥所含有的特殊雜質(zhì)一般為一些其他種類的氨基酸。用薄層色譜法進(jìn)行限量檢查：將樣品配成一定濃度的供試品液，取一定量供試品液稀釋后作為對(duì)照液，在同一硅膠G薄板上，一般用正丁醇︰水︰冰醋酸〔3︰1︰1〕展開晾干后，噴茚三酮的丙酮溶液顯色，規(guī)定供試品所顯雜質(zhì)斑點(diǎn)的顏色不得深于對(duì)照液主斑點(diǎn)，以此限制其他氨基酸的含量。25整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)氨基酸和有些小分子多肽藥物是經(jīng)過酶解或化學(xué)方法裂解大分子蛋白后經(jīng)層析或超濾等方法得到的小分子物質(zhì)，因此檢查是否存在大分子蛋白質(zhì)非常重要。方法：取適宜濃度的樣品溶液，加等體積的20％磺基水楊酸溶液，溶液不發(fā)生渾濁那么判定無蛋白質(zhì)。26整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)2、平安性檢查影響氨基酸平安用藥的因素除其中的一般雜質(zhì)，主要為熱原的含量。中國(guó)藥典所收載的氨基酸根本上都規(guī)定了熱原檢查。采用家兔法，將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。27整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)三、氨基酸含量測(cè)定1、茚三酮法茚三酮法是氨基酸定量測(cè)定應(yīng)用最廣泛的方法之一。當(dāng)茚三酮在酸性條件下和氨基酸反響時(shí)，氨基酸被氧化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮那么成復(fù)原型水合茚三酮。然后復(fù)原型茚三酮與氨，另一分子茚三酮進(jìn)一步縮合生成藍(lán)紫色物，最大吸收值的波長(zhǎng)為570nm。28整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)茚三酮反響為一切α-氨基酸所共有，反響靈敏，根據(jù)反響所生成的藍(lán)紫色深淺，可以測(cè)定氨基酸含量。本法可允許的測(cè)定范圍是0.5～50μg氨基酸。該法又分為Yemm法、Rosen法和Hydrindantin法。29整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)〔1〕Yemm法取樣品1.0mL〔含0.02～0.5μmol/L氨基酸〕，加枸櫞酸緩沖液〔枸櫞酸21g溶于100ml水中，加1.0mol/L氫氧化鈉溶液200mL，加水至500mL〕0.5mL，茚三酮溶液〔茚三酮2.5g溶于50mL甲基溶纖劑中〕0.2mL，氰化鉀溶液〔0.01mol/L氰化鉀溶液5mL與25mL甲基溶纖劑混合〕1.0mL，充分混勻，沸水浴加熱15min，冷卻。參加稀釋劑3～5mL，于570nm波長(zhǎng)處測(cè)定。按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出含氨基酸的量。如所測(cè)氨基酸種類不明時(shí)，可用亮氨酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線。30整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)〔2〕Rosen法該法是Yemm法的改進(jìn)。取樣品1.0mL，加茚三酮溶液〔茚三酮3g溶于100mL甲基溶纖劑中〕及氰化鈉溶液〔氰化鈉490mg溶于1L水中，取該溶液20mL，加醋酸緩沖液至1L〕各0.5mL，充分混勻，沸水浴加熱15min，立即加50％〔V/V〕異丙醇，充分?jǐn)嚢?，放冷，比色，?jì)算。〔3〕Hydrindantin法取茚三酮20g及茚烷酮〔Hydrindantin〕3g溶于750mL甲基溶纖劑及4mol/L醋酸緩沖液〔醋酸鈉272g溶于適量水中，加冰醋酸50mL，加水至500mL〕250mL中，混合作為顯色指示劑。取樣品1～2mL，加等量顯色指示劑，以下操作同上法。31整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)2、三硝基苯磺酸〔TNBS〕法三硝基苯磺酸〔TNBS〕是定量測(cè)定氨基酸的重要試劑之一。TNBS在偏堿性的條件下與氨基酸反響，先形成中間絡(luò)合物〔帶有等摩爾〕，如下式。32整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)中間絡(luò)合物在光譜下有兩個(gè)吸收值相近的頂峰，分別位于355nm和420nm附近。溶液一旦酸化，中間絡(luò)合物轉(zhuǎn)化成三硝基苯氨基酸〔TNP氨基酸〕，420nm處的吸收值顯著下降，而350nm附近的吸收峰那么移至340nm處。33整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)利用TNBS與氨基酸反響的這一特性，可在420nm處〔偏堿性溶液中〕或在340nm〔偏酸性溶液中〕對(duì)氨基酸進(jìn)行定量測(cè)定。本法允許的測(cè)定范圍是0.05～0.4μmol氨基酸。34整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)3、銅復(fù)合物紫外吸收法在適宜的pH值條件下，2molα-氨基酸與1mol銅離子形成氨基酸-銅復(fù)合物：35整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)此復(fù)合物呈藍(lán)色，除了在620nm有吸收峰外，在230nm有最大吸收，其摩爾吸收系數(shù)在230nm處為620nm處的100倍左右，因此利用氨基酸-銅復(fù)合物的紫外吸收以進(jìn)行氨基酸的微量測(cè)定。本法可允許測(cè)定范圍是50～500μmol/mL的氨基酸。適用于蛋白質(zhì)水解速率和水解程度的測(cè)定。36整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)4、甲醛滴定法氨基酸的NH3+基的pK值常在9.0以上，不能用一般指示劑作酸堿滴定測(cè)定。但甲醛可與氨基酸中不帶電荷的氨基相互作用，促使NH3+上的氫離子釋放。37整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)在pH值中性和常溫條件下，甲醛迅速與氨基酸上的氨基〔或亞氨基〕結(jié)合，使下述平衡向右移動(dòng)，促進(jìn)氫離子釋放，使溶液酸度增加。即可用酚酞作指示劑，以氫氧化鈉來滴定。每釋放出一個(gè)氫離子，就相當(dāng)有一個(gè)氨基氮，從滴定所用氫氧化鈉量可以計(jì)算樣品中氨基氮含量以及氨基酸含量。38整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)5、非水溶液滴定法中國(guó)藥典、美國(guó)藥典和英國(guó)藥典對(duì)所收載氨基酸類藥物，除谷氨酸用氫氧化鈉為標(biāo)準(zhǔn)溶液的酸堿滴定法，其余均根據(jù)其結(jié)構(gòu)特性，采用了非水酸堿滴定法。用冰醋酸作溶劑，高氯酸作標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，電位法或指示劑法確定終點(diǎn)。適用于常量氨基酸的含量測(cè)定。39整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)40整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)〔1〕直接滴定法適用于能溶于冰醋酸的氨基酸。精密稱定氨基酸樣品約50mg，溶于20ml冰醋酸中，加2滴甲基紫指示劑，用高氯酸標(biāo)準(zhǔn)液滴定。終點(diǎn)為紫色消失，呈現(xiàn)藍(lán)色，計(jì)算，即得。用直接法測(cè)定的氨基酸有丙氨酸、精氨酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸等。谷氨酸和門冬氨酸在高氯酸中不溶解，可將樣品溶于2mL甲酸中，再加20mL冰醋酸，直接用標(biāo)準(zhǔn)高氯酸溶液滴定。41整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)〔2〕回滴法適用于不易溶于冰醋酸而能溶于高氯酸的氨基酸。精密稱定氨基酸樣品約30-40mg，溶于5mL高氯酸標(biāo)準(zhǔn)液中，加2滴甲基紫指示劑，用醋酸鈉溶液滴定剩余的酸，顏色由黃至綠至藍(lán)至初次呈現(xiàn)不褪色的紫色為終點(diǎn)，計(jì)算，即得。用回滴法測(cè)定的氨基酸有賴氨酸、絲氨酸、半胱氨酸等。42整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)6、雙波長(zhǎng)分光度法雙波長(zhǎng)分光光度法的理論根底是差吸光度和等吸收波長(zhǎng)。它采用測(cè)量波長(zhǎng)〔主波長(zhǎng)λp,PrimaryWavelength〕和參比波長(zhǎng)〔次波長(zhǎng)λs,SecondWavelength〕兩個(gè)不同波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定一個(gè)樣品溶液，可以克服單波長(zhǎng)測(cè)定的缺點(diǎn)，提高了測(cè)定結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度。待測(cè)溶液在λp與λs兩個(gè)波長(zhǎng)處測(cè)定的差吸光度ΔA與試樣中待測(cè)物質(zhì)的濃度C成正比。43整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)復(fù)方氨基酸注射液中，采用雙波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定氨基酸的含量，可消除共存組分干擾原理，不經(jīng)別離直接測(cè)定，操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確。色氨酸測(cè)定波長(zhǎng)280nm，酪氨酸等吸收波長(zhǎng)303nm。酪氨酸測(cè)定波長(zhǎng)240nm，色氨酸等吸收波長(zhǎng)292nm。44整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)7、導(dǎo)數(shù)分光光度法在一定條件下，溶液組分的吸光度對(duì)波長(zhǎng)的微分值與組分濃度仍保持線性關(guān)系，利用吸光度導(dǎo)數(shù)光譜可以定量測(cè)定組分含量，稱為導(dǎo)數(shù)分光光度法。導(dǎo)數(shù)光譜數(shù)值測(cè)定有三種方法：切線法，峰谷法，峰零法。45整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)①根據(jù)紫外吸收光譜選定導(dǎo)數(shù)光譜波長(zhǎng)范圍〔應(yīng)包含被測(cè)組分的最大吸收波長(zhǎng)〕。②按導(dǎo)數(shù)分光光度法測(cè)定被測(cè)混合組分的一階、二階和三階導(dǎo)數(shù)光譜。③選取其中能排除干擾組分干擾的導(dǎo)數(shù)光譜。④在被測(cè)組分的最大吸收波長(zhǎng)處用切線法〔或峰谷法、峰零法〕量得的振幅值D與標(biāo)準(zhǔn)品濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。⑤測(cè)定樣品在最大吸收波長(zhǎng)下的振幅值D，代入回歸方程，計(jì)算樣品濃度。46整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)用二階導(dǎo)數(shù)光譜法測(cè)定復(fù)方氨基酸中色氨酸含量，濃度范圍在9-45μg·ml-1時(shí),呈良好線性。平均回收率100.43%,RSD為0.44%。47整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)8、酰胺氮測(cè)定法雙羧基氨基酸〔谷氨酰胺、天〔門〕冬酰胺〕的側(cè)鏈上含有酰胺基。酰胺基上的氮比較容易釋放，在較溫和或短時(shí)間的水解條件下，即可釋放完全。RCONH2+2H2ORCOOH+NH4OH氨被釋放出來，經(jīng)過彌散，吸收于中央室含有指示劑的酸溶液中。反響完全后，直接在中央室用標(biāo)定過的鹽酸滴定，即可標(biāo)出酰胺氮的含量，間接可求出氨基酸的含量。48整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)9、酸堿滴定法賴氨酸〔lysine〕片中賴氨酸的測(cè)定取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量〔約相當(dāng)于賴氨酸0.15g〕置燒杯中，加水25mL，滴加氫氧化鈉滴定液〔0.1mol/L〕，用酸度計(jì)調(diào)節(jié)至pH值為7.0，參加預(yù)先調(diào)節(jié)至pH值9.0的甲醛溶液15mL，攪勻，再用氫氧化鈉滴定液〔0.1mol/L〕滴定至pH值為9.0，并持續(xù)30s。按參加甲醛液后所耗用氫氧化鈉滴定液〔0.1mol/L〕體積計(jì)算，每毫升氫氧化鈉滴定液〔0.1mol/L〕相當(dāng)于9.132mg的C6H14N2O2·HCl。49整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)10、HPLC對(duì)于各種復(fù)方氨基酸制劑中氨基酸的含量測(cè)定，目前較多地采用了高效液相色譜法〔HPLC〕。因大多數(shù)氨基酸沒有紫外吸收，不能用紫外檢測(cè)器測(cè)定。為改善被測(cè)物的檢測(cè)特性，提高檢測(cè)靈敏度，需進(jìn)行化學(xué)衍生化。衍生方式包括柱后衍生法和柱前衍生法。柱后衍生法是將樣品經(jīng)離子交換柱別離后進(jìn)行衍生；柱前衍生法是將樣品制成適當(dāng)?shù)难苌镌龠M(jìn)行HPLC別離。50整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)衍生可改善被測(cè)物的檢測(cè)特性，且可改變別離選擇特性，經(jīng)衍生化的氨基酸可用紫外或熒光檢測(cè)器檢測(cè)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，用鄰苯二甲醛柱前衍生和熒光檢測(cè)的反相高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方氨基酸注射劑中氨基酸含量，檢測(cè)限為pg水平。用異硫氰酸苯酯柱前衍生紫外檢測(cè)反相HPLC定量測(cè)定植物中氨基酸含量，檢測(cè)限8.11-13.3pmol/μL。用亞硝酸衍生化，紫外檢測(cè)的反相HPLC定量測(cè)定人體內(nèi)的乙酰半胱氨酸，檢測(cè)限為170nmol。用N-芘基馬來酰亞胺修飾N-乙酰半胱氨酸，用熒光檢測(cè)的反相HPLC測(cè)定，定量限為32nmol。51整理課件第一節(jié)

氨基酸類藥品檢驗(yàn)11、其他儀器分析方法其他一些儀器分析方法也可用于氨基酸的含量測(cè)定。如杜鳴等在熒光計(jì)上附加互相垂直的偏振片消除溶劑散射光的影響和苯丙氨酸的干擾，用偏振熒光光度法同時(shí)測(cè)定氨基酸注射液及動(dòng)植物浸出液中酪氨酸和色氨酸的含量。52整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)蛋白質(zhì)和多肽因子是生物體內(nèi)廣泛存在的生化物質(zhì)，具多種生理功能，是一大類非常重要的生化藥物。蛋白質(zhì)是呈兩性解離的電解質(zhì)，其離子基因除末端氨基和末端羧基外，還有側(cè)鏈上的酸性或堿性基團(tuán)，各種蛋白質(zhì)分子有各自的等電點(diǎn)，在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度最小，穩(wěn)定性差，易從溶液中沉淀析出。蛋白質(zhì)對(duì)水親和力很大，在可水溶液中形成親水膠體。蛋白質(zhì)分子構(gòu)象受熱、超聲波、紫外光照射等物理因素和酸、堿、重金屬、有機(jī)溶劑等因素的影響而變化。蛋白質(zhì)變性后失去生物活性和結(jié)晶能力，同時(shí)黏度、溶解度、沉降系數(shù)和擴(kuò)散系數(shù)也會(huì)發(fā)生變化。53整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)多肽因子類藥物指分子量不算太大的，在體內(nèi)含量極微，但卻發(fā)揮極大生理作用的一類生物活性物質(zhì)。其中包括天然動(dòng)物體內(nèi)提取的藥物如干擾素、白細(xì)胞介素、胸腺肽、轉(zhuǎn)移因子等和通過現(xiàn)代基因工程技術(shù)生產(chǎn)的藥品如重組人干擾素、重組白細(xì)胞介素、重組乙肝疫苗等。天然來源的多肽因子藥物〔如胸腺肽、轉(zhuǎn)移因子等〕其分析方法與蛋白質(zhì)類藥物的分析方法根本相同。以基因工程重組技術(shù)生產(chǎn)的多肽因子類藥物分析方法與蛋白質(zhì)類藥物的分析方法差異較大。54整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)一、多肽因子類藥物的定性鑒別基因重組多肽因子類藥物的鑒別主要采用SDS法和免疫印跡法。1、SDS法用SDS鑒別生物樣品必須是該品有極純的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，通過電泳結(jié)果的比照，確定所測(cè)樣品是否與標(biāo)準(zhǔn)品有相同的遷移率，從而鑒別該品。缺點(diǎn)：必須有標(biāo)準(zhǔn)品；凝膠中多肽需保存生物活性，或能夠復(fù)性，或電泳前可將檢測(cè)配基與待測(cè)多肽共價(jià)交聯(lián)。55整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)2、蛋白質(zhì)免疫印跡電泳法〔轉(zhuǎn)移電泳、westernblot〕原理：借助聚丙烯酰胺凝膠技術(shù)，將生物活性物質(zhì)高效別離，別離后的樣品可以原位、定量驅(qū)動(dòng)或吸印在另一種固相載體〔通常用醋酸纖維素薄膜，簡(jiǎn)稱NC膜〕上，能保持原有的生物活性，可以進(jìn)行各種生物檢測(cè)、免疫識(shí)別、掃描、積分和保存。56整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)〔1〕根本操作分3個(gè)局部：聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉(zhuǎn)移電泳〔即將凝膠中的多肽條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素紙上〕；檢測(cè)或鑒定薄膜上的多肽條帶。①聚丙烯酰胺凝膠電泳先將待別離樣品進(jìn)行凝膠電泳別離。凝膠可用瓊脂糖凝膠，也可用聚丙烯酰胺凝膠，可以是均一的，也可用梯度凝膠，凝膠緩沖體系中可含有各種變性劑，如SDS、LDS、尿素等，可進(jìn)行單向或雙向電泳，也可用等電聚焦電泳。57整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)②轉(zhuǎn)移電泳將濕醋酸纖維素〔NC〕薄膜緊貼凝膠，凝膠與薄膜之間不能有氣泡，否那么在氣泡所在部位的條帶將不能轉(zhuǎn)移，在NC膜和凝膠的另一側(cè)放上兩層濕濾紙，也不能有氣泡，再在兩邊貼上海綿，最后用塑料網(wǎng)框架夾緊，插入電泳槽，根據(jù)凝膠中樣品所帶電荷的性質(zhì)，決定有NC膜的一邊是靠近正極還是靠近負(fù)極一側(cè)。電泳條件取決于凝膠類型、轉(zhuǎn)移裝置和蛋白質(zhì)本身性質(zhì)等。一般采用低電壓和低電流〔2mA/cm2以內(nèi)〕。緩沖液中一般含有20％的甲醇或乙醇，其作用主要是保持凝膠的幾何形狀。58整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)③檢測(cè)或鑒定NC膜借助非共價(jià)鍵吸附蛋白質(zhì)，經(jīng)轉(zhuǎn)移后蛋白質(zhì)條帶就固定在NC膜上，完全保存凝膠中的蛋白譜，可直接用考馬斯亮藍(lán)、氨基黑10B等染色。如果利用蛋白質(zhì)生物活性，或用蛋白質(zhì)生物探針來檢測(cè)，就要先用1％～3％的牛血清蛋白或血紅蛋白，或非離子去垢劑〔0.3％吐溫-20〕等處理NC紙，以封閉NC紙上未吸附蛋白質(zhì)區(qū)域，使其不再能吸附蛋白質(zhì)。使用非離子去垢劑比較經(jīng)濟(jì)，但有可能把NC紙上的某些蛋白質(zhì)洗掉，同時(shí)還要將NC紙反復(fù)洗滌以去除變性劑，59整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)使蛋白質(zhì)恢復(fù)到天然態(tài)或生物活性，然后再與檢測(cè)探針保溫。如用ConA〔伴刀豆球蛋白A〕檢測(cè)糖蛋白，用抗體檢測(cè)其特異性的抗原，用激素檢測(cè)其特異受體，用底物檢測(cè)特異的酶等。如探針本身具有放射性〔如125I標(biāo)志ConA〕，或連有酶〔如酶標(biāo)抗體〕，或熒光探針，那么反響后應(yīng)徹底洗滌，可立即進(jìn)行放射自顯影，或與底物來反響，或紫外燈下觀察熒光。60整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)二、多肽因子類藥物的檢查1、分子量檢查常用復(fù)原型SDS法檢查分子量，用量約1μg。也可采用凝膠過濾法，例如Sephadecx系列〔G-75，-100〕；waters1～60，125，250；BackmanTSK2000SW，3000SW，4000SW。凝膠過濾是測(cè)定完整蛋白質(zhì)分子的分子量，而SDS是測(cè)定蛋白質(zhì)亞基的分子量，同時(shí)用這二種方法測(cè)定同一蛋白質(zhì)的分子量，可以方便地判斷樣品蛋白質(zhì)是否是寡聚蛋白質(zhì)。61整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)2、肽圖分析肽圖分析是指用酶解或化學(xué)降解蛋白質(zhì)后，對(duì)生成的肽段進(jìn)行別離、分析的技術(shù)。〔1〕蛋白質(zhì)的裂解方法①酶解法應(yīng)用蛋白酶裂解蛋白質(zhì)，利用各種蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)分子肽鍵作用的特異性。如胰蛋白酶作用于堿性氨基酸〔精氨酸和賴氨酸〕的羧基端，酶解有時(shí)不完全，在此情況下，可加一些變性劑〔4mol尿素〕；或用復(fù)原劑DTT復(fù)原，再用烷化劑〔碘代乙酸〕烷化成羧甲基半胱氨酸，它能很好地和方便地進(jìn)行氨基酸定量分析。62整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)②化學(xué)裂解法最常用的是溴化氰裂解法。溴化氰作用于Met羧基端和其次一個(gè)氨基酸形成的肽鍵，如γ-干擾素含4個(gè)Met，經(jīng)溴化氰作用后生成5個(gè)肽段。其他化學(xué)裂解法還有BNPs-3-甲基吲哚，N-氰代琥珀酸亞胺等作用于Try-x鍵；2-硝基-5-硫氰基苯甲酸作用于x-Cys鍵；羥胺作用于Asp-Glu鍵；稀酸〔吡唑醋酸〕作用于Asp-Pro鍵。63整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)〔2〕肽圖分析最早稱為Fingerprinting〔指紋術(shù)〕，用在鐮形細(xì)胞貧血癥研究中。將HbA〔血紅蛋白A〕和HbS〔血紅蛋白S〕的分別用胰蛋白酶酶解，然后將它們分別進(jìn)行電泳，再轉(zhuǎn)動(dòng)90°進(jìn)行紙層析。Ingram用此法觀察到HbA和HbS之間有一個(gè)肽斑點(diǎn)上的差異，進(jìn)一步的肽順序分析指出這僅是β珠蛋白鏈第6位上一個(gè)氨基酸殘基的差異，HbA中為Glu〔谷氨酸〕，HbS中為Val〔纈氨酸〕。64整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)肽圖分析最常用的方法有SDS電泳法、高效液相色譜法〔HPLC〕和毛細(xì)管電泳法〔CE〕。HPLC主要是用反相柱，根據(jù)肽段的長(zhǎng)短和疏水性來別離，如果親水性太強(qiáng)，那么難于在柱上滯留而達(dá)不到別離效果；如果肽的疏水性很強(qiáng)，又難于洗脫下來，而CE法那么可防止這些缺點(diǎn)。65整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)3、等電點(diǎn)測(cè)定等電點(diǎn)是蛋白質(zhì)的物理化學(xué)常數(shù)，它表示蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)。一般采用凝膠等電聚焦電泳技術(shù)測(cè)定等電點(diǎn)。4、紫外吸收不同的蛋白質(zhì)分子都有其特定的紫外吸收，對(duì)于某種蛋白質(zhì)或多肽來說，它的最大吸收波長(zhǎng)是固定的。紫外吸收光譜是檢查蛋白質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。66整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)5、純度基因工程產(chǎn)品蛋白質(zhì)純度是一項(xiàng)重要指標(biāo)，但它也是一項(xiàng)相對(duì)的指標(biāo)，需根據(jù)實(shí)際要求而定。蛋白質(zhì)純度一般是指是否含有其他雜蛋白，而不包括鹽、緩沖液離子、SDS等小分子在內(nèi)。目前較常用的是HPLC法〔包括凝膠過濾、各種反相HPLC、離子色譜、疏水色譜等〕、非復(fù)原SDS凝膠電泳法、毛細(xì)管電泳法〔CE〕、等電聚焦電泳，此外也應(yīng)用一些化學(xué)方法，觀察末端是否均一。67整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)至少應(yīng)用兩種以上的方法，而且是兩種不同別離機(jī)理的方法來判定蛋白質(zhì)的純度才比較可靠。常發(fā)現(xiàn)某一樣品在凝膠過濾中是純的，而在離子色譜中卻分辨為二個(gè)組分，反之亦然。又如一種樣品用凝膠過濾法和SDS電泳證明是純的，但這仍不充分，因?yàn)檫@兩者機(jī)理相同。68整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)6、N-端氨基酸序列測(cè)定測(cè)定蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸序列是鑒別蛋白質(zhì)的重要指標(biāo)。50年代初，Edman采用異硫氰苯酯〔PhenylisothioCyanate，簡(jiǎn)稱PITC，Edman試劑〕首先建立了測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸序列的方法。1968年，Edman研制成功自動(dòng)順序儀〔Secluencer〕。近年來，又有高度自動(dòng)化、微量化的精確靈敏的氣液順序儀問世。在各種測(cè)定蛋白質(zhì)氨基酸序列方法中，Edman降解法仍是最為準(zhǔn)確、可靠的方法。69整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)〔1〕原理Edman試劑的化學(xué)反響，從蛋白質(zhì)的多肽鏈的N-端進(jìn)行降解，一次只去掉一個(gè)氨基酸殘基，經(jīng)過反復(fù)循環(huán)反響，能依次得到一系列苯氨基硫甲酰氨基酸〔PTH-氨基酸〕，分析鑒定PTH-氨基酸就可得到從肽N-端開始的氨基酸序列。主要反響分為三步：①偶合蛋白質(zhì)多肽鏈N-端氨基酸與PITC在無氧條件下，在pH8-9的緩沖液中進(jìn)行偶合，生成苯基硫代氨甲酰基肽衍生物。70整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)②裂解苯基硫代氨甲?；牡难苌锱c無水三氟醋酸反響，釋放出N-端的氨基酸，產(chǎn)生苯胺噻唑啉酮〔anilinothiazolinone，ATZ〕衍生物和減少一個(gè)殘基的多肽鏈。③轉(zhuǎn)位生成的ATZ衍生物極不穩(wěn)定，必須迅速轉(zhuǎn)化成苯基乙內(nèi)酰硫脲-氨基酸〔Phenylthiohydantion，簡(jiǎn)稱PTH〕后，進(jìn)行鑒定。71整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)〔2〕樣品的處理①首先必須將蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行解聚成一條多肽長(zhǎng)鏈分子。如果測(cè)定的樣品分子中含有二硫鍵，必須將二硫鍵用氧化復(fù)原法拆開，得到含半胱氨酸的肽鏈還必須加以保護(hù)，防止二硫鍵重新聚合。含亞基的蛋白質(zhì)分子，需將亞基拆開、純化、分別測(cè)量。72整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)②蛋白質(zhì)多肽鏈的N-端必須是游離基團(tuán)。有些蛋白質(zhì)N-端被乙?；睠H3CO－〕封閉，如乙酰細(xì)胞色素C、乙酰煙草花葉病毒等。有的蛋白質(zhì)N-端為環(huán)谷氨酸〔pyroglutamicacid〕，如兔IgG的重鏈、許多活性多肽等，都不能直接用Edman法降解。73整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)③影響偶合反響的因素必須嚴(yán)格控制pH在8-9；過堿會(huì)導(dǎo)致PITC與一級(jí)胺、二級(jí)胺反響，從而影響PTH-氨基酸鑒定；偏酸將導(dǎo)致偶合反響不完全。嚴(yán)格控制在無氧條件下進(jìn)行；氧化將導(dǎo)致二硫磺酸副產(chǎn)物的生成，及色氨酸被氧化而使反響終止。用高純度緩沖液，各種試劑也必須經(jīng)過再純化；雜質(zhì)中含醛會(huì)造成氨基被反響，以及形成Sehiff堿使蛋白質(zhì)多肽鏈產(chǎn)生不純的聯(lián)結(jié)肽，而造成肽鏈氨基酸序列測(cè)定中斷?？刂品错憰r(shí)間及溫度；延長(zhǎng)反響時(shí)間和提高溫度，都將導(dǎo)致副反響增加而影響測(cè)定。74整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)〔3〕檢測(cè)過去常用薄層層析法進(jìn)行鑒定檢查，但該法操作非常復(fù)雜，時(shí)間長(zhǎng)，靈敏度和精確度都很差。近年來，大局部實(shí)驗(yàn)均采用高效液相法鑒定PTH-氨基酸，它既可定性又可定量，是目前最精確的方法。75整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)7、外源DNA含量測(cè)定基因工程產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中，可能會(huì)因操作不當(dāng)將DNA片段代入樣品中，所以必須對(duì)樣品進(jìn)行外源殘留DNA含量測(cè)定。一般規(guī)定剩余DNA含量每個(gè)劑量小于100pg。通常用改進(jìn)的Southern雜交法，又稱為斑點(diǎn)雜交〔Dotblot〕，即直接將被測(cè)樣品點(diǎn)于醋酸纖維素膜上使之成為斑點(diǎn)，然后與探針DNA進(jìn)行雜交，最后與標(biāo)準(zhǔn)DNA同樣操作的結(jié)果比照，以確定剩余外原DNA的含量。76整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)標(biāo)記DNA常用放射性核素標(biāo)記，利用放射自顯影技術(shù)進(jìn)行定量測(cè)定。近年來，試劑盒為實(shí)驗(yàn)帶來了更大的方便。例如，BOEHTINGERMANNHEIM公司出品的地高辛標(biāo)記的DNA標(biāo)記檢測(cè)試劑盒，它是通過無放射標(biāo)記的地高辛與標(biāo)記的DNA結(jié)合經(jīng)雜交而形成的有顏色或熒光的檢測(cè)物質(zhì)。地高辛與dUTP經(jīng)強(qiáng)堿作用形成新的復(fù)合物DIG-11-UDP標(biāo)記物，該標(biāo)記物與膜上的被檢測(cè)DNA雜交顯色而被測(cè)定。77整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)剩余DNA的測(cè)定方法：〔1〕樣品①DNA標(biāo)準(zhǔn)品〔一般采用發(fā)酵用的工程菌DNA稀釋〕：10ng/mL、1ng/mL、100pg/mL、1pg/mL。②將待測(cè)樣品用蛋白酶K，37℃消化4h?！?〕DNA變性將樣品置沸水浴中加熱2min，然后迅速置冰水中冷卻。〔3〕點(diǎn)樣將經(jīng)變性處理的樣品點(diǎn)于枯燥的醋酸纖維素膜上〔1μL/點(diǎn)〕，紫外燈下照射5min?！?〕預(yù)雜交將膜置于塑料袋內(nèi)，參加10mL標(biāo)準(zhǔn)雜交液，封口，68℃孵育過夜。78整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)〔5〕雜交塑料袋內(nèi)參加標(biāo)的探針DNA50μL，68℃孵育6h?！?〕洗膜、孵育、封閉、漂洗?！?〕在10mL檢測(cè)平衡液中平衡膜5min?！?〕在10mL新鮮配制的顯色液中，孵育至膜顯色完全為止。79整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)8、剩余IgG含量測(cè)定有些基因工程蛋白質(zhì)在工業(yè)生產(chǎn)中用單克隆抗體親和層析法進(jìn)行純化，而在層析過程中，可能會(huì)有少量單克隆抗體被洗脫下來而混在純化液中。這些單克隆抗體為異體大分子蛋白，如果混入樣品，會(huì)給患者使用造成強(qiáng)烈過敏反響，因此必須進(jìn)行單克隆抗體檢查〔一般規(guī)定應(yīng)小于100ng/支〕。免疫球蛋白〔IgG〕的測(cè)定方法有多種。用于定性分析的有SDS、等電聚焦電泳和免疫學(xué)方法；用于定量分析的有蛋白定量〔抗原定量〕。80整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)測(cè)定基因工程干擾素中的剩余IgG的方法：〔1〕將羊抗鼠IgG用包被液稀釋至10μg/mL，每孔加100μL，37℃保溫2h或4℃過夜。〔2〕每孔加100μL封閉液封閉，37℃保溫30min?！?〕將標(biāo)準(zhǔn)IgG稀釋成100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.563ng/mL的溶液，每孔加100μL?！?〕樣品每孔加100μL，37℃保溫2h。81整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)〔5〕將HRP-羊抗鼠IgG以1︰800稀釋后，每孔100μL，37℃保溫30min。〔6〕將4mg鄰苯二胺溶于10mL底物緩沖液中，加30％過氧化氫15μL，搖勻，每孔100μL，37℃保溫30min?！?〕每孔加2mol/L硫酸溶液50μL，終止反響?！?〕用酶標(biāo)儀測(cè)OD492值，計(jì)算剩余IgG含量。82整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)三、多肽因子類藥物生物效價(jià)的測(cè)定生物制劑或生化制劑因受外界因素影響〔溫度、濕度、時(shí)間、生產(chǎn)過程的各環(huán)節(jié)等〕而易導(dǎo)致其生物活性降低或全部喪失而失去藥理作用，所以除要測(cè)定其含量外，還要測(cè)定其生物學(xué)活性以確定其是否具有體內(nèi)或體外作用。1、免疫學(xué)測(cè)定法主要是采用ELISA定量測(cè)定樣品的量。83整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)2、細(xì)胞病變抑制法該法主要用于干擾素的效價(jià)測(cè)定。一般采用CPE〔細(xì)胞致病效應(yīng)〕抑制為根底的抑制微量測(cè)定法?！?〕材料準(zhǔn)備①測(cè)定細(xì)胞人羊膜細(xì)胞Wish株。②攻擊病毒選用水泡性口腔炎病毒〔VSV〕作為攻擊病毒，使用前先在選定測(cè)定細(xì)胞上滴定其CCID50，以感染24h后引起測(cè)定細(xì)胞出現(xiàn)“++〞cpe的病毒稀釋度為1個(gè)CCID50，該病毒的滴度為稀釋度的倒數(shù)乘10，單位為CCID50/mL。③完全培養(yǎng)液MEM培養(yǎng)液添加10％牛血清。④測(cè)定培養(yǎng)液MEM培養(yǎng)液添加7％牛血清。⑤攻毒培養(yǎng)液MEM培養(yǎng)液添加3％牛血清。84整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)〔2〕操作①鋪板棄去Wish細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，用PBS洗2次后消化和收集細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液配成約25萬～35萬個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔100μL，37℃，5％CO2，培養(yǎng)4～6h。②制備標(biāo)準(zhǔn)溶液取1支標(biāo)準(zhǔn)品用測(cè)定培養(yǎng)液稀釋至1000U/mL。③制備樣品溶液將待測(cè)樣品用測(cè)定培養(yǎng)液稀釋至1000U/mL。85整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)④另取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板一塊，每孔參加150μL測(cè)定培養(yǎng)液。在A6、A7各孔中每孔參加50μL標(biāo)準(zhǔn)溶液，在A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11各孔中每孔參加50μL各待檢樣品，每個(gè)待檢樣品做2個(gè)復(fù)孔。自A行取50至H行作4倍稀釋，每孔留150μL余液。⑤加樣取①項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)板，將④項(xiàng)制備的溶液移入該細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，37℃，5％CO2，培養(yǎng)18～24h。86整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)⑥制備病毒液攻擊劑量為100TCID50，取保存的VSV用攻毒培養(yǎng)液稀釋至工作濃度。⑦功毒取制備好的細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去上清，參加病毒液，每孔100μL，37℃，5％CO2，培養(yǎng)24h〔鏡檢標(biāo)準(zhǔn)溶液的50％病變點(diǎn)在D或E行〕。⑧染色，脫色，以630nm為參比波長(zhǎng)，在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。87整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)〔3〕結(jié)果計(jì)算采用計(jì)算機(jī)程序或直線回歸計(jì)算法進(jìn)行計(jì)算處理。分別計(jì)算各試驗(yàn)樣品的半效稀釋倍數(shù)〔即從樣品溶液至相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品50％最大效應(yīng)點(diǎn)的稀釋倍數(shù)〕，并按下式計(jì)算：88整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)3、3H-TdR摻入同位素法原理：通過比較待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品之間對(duì)檢測(cè)細(xì)胞促增殖能力的強(qiáng)弱來確定待測(cè)樣品的活性。在測(cè)試液中參加由3H標(biāo)定的胸腺嘧啶〔3H-TdR，為細(xì)胞增殖過程中DNA合成的必備物質(zhì)〕，3H-TdR摻入量就代表了細(xì)胞增殖能力的強(qiáng)弱。3H-TdR用同位素液閃計(jì)數(shù)儀來測(cè)定。該方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。89整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)〔1〕CTLL-2細(xì)胞短期培養(yǎng)3H-TdR摻入法取傳代第2-3d、生長(zhǎng)旺盛的CTLL-2細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞洗兩次后，用含10％小牛血清、5×10-5mol/L2-巰基乙醇的RPMI1640培養(yǎng)液配成1×105/mL細(xì)胞懸液。用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔中參加100μL不同稀釋度的待測(cè)樣品，同時(shí)設(shè)置培養(yǎng)液對(duì)照和各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，再向各孔中參加100μL的CTLL-2細(xì)胞。90整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)置37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)18h或24h，然后每孔中參加50μL的18.5kBq3H-TdR，繼續(xù)培養(yǎng)4～6h。用多頭細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞，用液閃計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞的3H-TdR摻入值，通過比較待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品使細(xì)胞摻入3H-TdR量的多少計(jì)算樣品的活性。91整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)〔2〕鼠脾細(xì)胞增殖檢測(cè)法無菌取C57BL/6小鼠脾臟制成單細(xì)胞懸液，以〔0.5～1.0〕×107/mL細(xì)胞濃度懸浮于含有5％小牛血清、5×10-5mol/L2-巰基乙醇、2.5μg/mLConA的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)48～72h。離心〔1500r/min、10min〕，棄去上清后參加0.05mol/Lα-甲基甘露糖苷，置40℃溫育45min，然后用Hanks液將細(xì)胞洗兩次，用含10％小牛血清、5×10-5mol/L2-巰基乙醇、0.1mol/Lα-甲基甘露糖苷的RPMI1640培養(yǎng)液配制成2×106/mL細(xì)胞懸液。92整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔參加100μL不同稀釋度的待測(cè)樣品，同時(shí)設(shè)置培養(yǎng)液對(duì)照和各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，再向各孔中參加100μL的細(xì)胞懸液。置37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)18h，然后每孔中參加50μL的18.5kBq3H-TdR，繼續(xù)培養(yǎng)4～6h。用多頭細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞，用液閃計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞的3H-TdR摻入值，通過比較待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品使細(xì)胞摻入3H-TdR量的多少計(jì)算樣品的活性。93整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)〔3〕Ando氏微量測(cè)定法取肝素抗凝全血，經(jīng)Ficoll-Hypaque密度梯度離心，取單個(gè)核細(xì)胞，用含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成5×105/ml細(xì)胞懸液，置37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)10天后，用Hanks液將細(xì)胞洗兩次，用含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成2×105/mL細(xì)胞懸液。用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔參加100μL不同稀釋度的待測(cè)樣品，同時(shí)設(shè)置培養(yǎng)液對(duì)照和各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，再向各孔中參加100μL的細(xì)胞懸液。置37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)4d，然后每孔中參加74kBq3H-TdR，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，收集細(xì)胞，用液閃計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞的3H-TdR摻入值，計(jì)算樣品的活性。94整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)4、微量酶檢測(cè)法〔MTT〕法該法通過比較待測(cè)樣品刺激檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的強(qiáng)弱來確定樣品的活性。細(xì)胞增殖反映能量代謝活潑，可產(chǎn)生大量的能量，供合成多種大分子物質(zhì)和細(xì)胞分裂所需，細(xì)胞能量代謝的水平與細(xì)胞合成DNA水平根本平行，因此，測(cè)定細(xì)胞能量代謝的水平可以間接地反映細(xì)胞的增殖情況。95整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)四甲基偶氮唑鹽[3-〔4,5-dimethyhhiazol-2-y1〕-2,5-di-phenyhetrazoliumbromide，MTT]是一種淡黃色的可溶性化合物，活細(xì)胞特別是增殖期的細(xì)胞可通過線粒體能量代謝過程中的琥珀酸脫氫酶的作用使淡黃色的MTT分解產(chǎn)生藍(lán)色結(jié)晶狀Formazan沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍，而且Formazan的量與細(xì)胞的增殖程度呈正比，F(xiàn)ormazan經(jīng)異丙醇作用后可溶解顯色。96整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)Mosman等〔1983〕根據(jù)上述原理首創(chuàng)了MTT比色分析法用于檢測(cè)能夠刺激細(xì)胞增殖的生物樣品的活性?！?〕主要試劑MTT溶液將MTT按5mg/mL濃度溶解于PBS中，過濾除菌后，置4℃下避光保存。酸化異丙醇含0.04mol/L鹽酸的異丙醇。97整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)〔2〕方法用含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液將檢測(cè)細(xì)胞〔例如CTLL-2或ConA活化的小鼠脾細(xì)胞〕配成5×105/mL細(xì)胞懸液。向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔參加100μL上述細(xì)胞懸液，再取100μL不同稀釋度的待測(cè)樣品和各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照品分別參加各孔中，每個(gè)稀釋度3個(gè)復(fù)孔，并同時(shí)設(shè)置培養(yǎng)液對(duì)照孔。置37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)48h。98整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)離心〔1500r/min、5min〕，從各孔中輕輕吸取100μL上清液，棄去，各孔再參加10μLMTT溶液，置37℃、5％CO2孵箱中孵育4～6h。各孔中參加100μL酸化異丙醇，并充分混合，靜置數(shù)分鐘，讓形成的Formazan充分溶解。在酶標(biāo)儀上選擇檢測(cè)波長(zhǎng)590nm、參考波長(zhǎng)630nm測(cè)定OD值，將待測(cè)上清的OD值與標(biāo)準(zhǔn)品OD值比較，即得待測(cè)樣品的活性。99整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)〔3〕MTT法的優(yōu)點(diǎn)與3H-TdR摻入法相比，MTT法操作簡(jiǎn)便，測(cè)定時(shí)間大大縮短〔特別是一次性測(cè)定大量樣品時(shí)〕，而且防止了使用放射性同位素和購(gòu)置昂貴的設(shè)備，所需試劑僅是MTT和酸化異丙醇。100整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)〔4〕應(yīng)注意的問題①酸化異丙醇后要在1h內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，如1h內(nèi)無法測(cè)定，可將未加酸化異丙醇的細(xì)胞培養(yǎng)板暫放在4℃中保存，測(cè)定前將細(xì)胞培養(yǎng)板取出，在室溫放置數(shù)分鐘后再參加酸化的異丙醇進(jìn)行測(cè)定。②在每孔中含有100～50000個(gè)檢測(cè)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞數(shù)與所測(cè)的OD值呈正相關(guān)。③因?yàn)榉蛹t可以干擾OD值的測(cè)定，所以，MTT法最好選用無酚紅的RPMI1640培養(yǎng)液，但這種培養(yǎng)液目前在我國(guó)難以購(gòu)置，可以設(shè)置RPMI1640培養(yǎng)液對(duì)照孔以排除酚紅的影響。101整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)〔5〕改進(jìn)MTT法為了能更加簡(jiǎn)便、快速地一次測(cè)定大量樣品，Tada等〔1986〕對(duì)MTT法在以下幾方面進(jìn)行了改進(jìn)：①將加MTT前的培養(yǎng)時(shí)間從48h縮短為24h；②用10％SDS-0.01mol/LHCl代替酸化異丙醇溶解Formazan結(jié)晶，防止了人工混勻和異丙醇引起的小牛血清沉淀現(xiàn)象；③省掉離心，棄上清的過程，可在溶解Formazan結(jié)晶后5天內(nèi)測(cè)定OD590值而變異值很小，而常規(guī)MTT法需在1h內(nèi)比色測(cè)定。102整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)5、紅細(xì)胞生成素〔EPO〕體外活性測(cè)定法〔ELISA測(cè)定法〕3H-TdR摻入法體外測(cè)定EPO具有簡(jiǎn)便、可靠、敏感的特點(diǎn)，可在24h內(nèi)完成，檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.002U/mL。ELISA試劑盒測(cè)定法：〔1〕檢測(cè)所用試劑盒為QUANTIKINEIVDEPOELISAR＆DSastemIncUSA?！?〕將樣品初步稀釋至活性為20～200mU/mL〔采用3步稀釋法〕。稀釋后在微量震蕩器上將樣品混勻。103整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)〔3〕按照試劑盒說明書進(jìn)行操作：①在微孔板上每孔加100μLEPO稀釋溶液。②在上述微孔中分別參加100μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品及稀釋后的樣品。③用薄膜封閉微孔，將微孔板置于室溫孵育2h。④吸去微孔中的液體，每孔加200μL結(jié)合液。⑤用薄膜封閉微孔，將微孔板置于室溫孵育2h。⑥吸去微孔中的液體，每孔加300μL清洗液清洗4次。104整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)⑦每孔加200μL基底溶液〔substrateSolution〕〔必須在配制后15min內(nèi)使用〕，注意不要加出氣泡。⑧將微孔板置于室溫孵育25min。⑨每孔加100μLSubstrateStopSolution終止反響。⑩將微孔板置于酶標(biāo)儀上，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。最后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值求標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算樣品的濃度即體外活性。105整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)6、EPO體內(nèi)生物學(xué)活性測(cè)定法〔網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法〕本法以給藥小鼠后，取血涂片計(jì)數(shù)網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算兩者的比值并經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理來計(jì)算樣品的體內(nèi)活性?！?〕選擇6～7周，體重18～20g雌性小鼠，隨機(jī)分組，每組6只?！?〕標(biāo)準(zhǔn)品和樣品各設(shè)3個(gè)劑量組，每個(gè)劑量組用2只鼠。分別做好標(biāo)志?！?〕將EPO標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品分別用生理鹽水稀釋成30U/mL，稀釋過程中加100μL白蛋白做保護(hù)劑。106整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)〔4〕連續(xù)三天給小鼠皮下注射EPO，劑量分別為2U/只、4U/只、8U/只?！?〕于第四天由每只小鼠眼眶采血，分別做涂料片。滴2～3滴鮮血于涂有煌焦油蘭〔1％乙醇染液〕的載玻片上，混勻，染色數(shù)分鐘后推片。〔6〕血涂片進(jìn)一步用瑞氏色素〔1︰600甲醇染液〕復(fù)染數(shù)分鐘?！?〕用pH6.8磷酸鹽緩沖液沖洗干凈，自然晾干?！?〕在顯微鏡油鏡下計(jì)數(shù)網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)和紅細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算兩者的比值。〔9〕將上述所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)算EPO體內(nèi)活性。107整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)四、蛋白質(zhì)類藥物的鑒別和檢查1、蛋白質(zhì)類藥物的鑒別蛋白質(zhì)類藥物可根據(jù)其各自的物理、化學(xué)性質(zhì)、生理作用等采用不同的方法進(jìn)行鑒別?！?〕茚三酮反響組成蛋白質(zhì)的氨基酸都能與茚三酮反響生成紫色化合物，因此蛋白質(zhì)也有此反響，這是蛋白質(zhì)鑒別的最常用方法?！?〕福林酚反響或雙縮脲反響這兩種常用來測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，但有時(shí)也用于蛋白質(zhì)的鑒別。〔3〕紫外吸收由于組成蛋白質(zhì)的氨基酸中，酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸在紫外區(qū)的光吸收特性，因此可利用此種特性鑒別蛋白質(zhì)。108整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)五、蛋白質(zhì)含量測(cè)定和效價(jià)測(cè)定1、蛋白質(zhì)含量測(cè)定蛋白質(zhì)的定量可用化學(xué)方法如凱氏定氮法、雙縮脲法、福林酚法、紫外光吸收法來測(cè)定；也可用染色法，如氨基黑、考馬斯亮藍(lán)測(cè)定；此外還可用熒光激發(fā)、氯胺T、放射性核素計(jì)數(shù)等靈敏度較高方法。上述方法中凱氏定氮法、福林酚法、紫外光吸收法最為常用，它們操作簡(jiǎn)單、設(shè)備廉價(jià)。109整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)〔1〕凱氏定氮法凱氏定氮法常用來測(cè)定有機(jī)物的含氮量。①原理：A、含氮有機(jī)物的消化當(dāng)含氮有機(jī)物與硫酸共熱時(shí)，分解出氮、二氧化碳、水。氮轉(zhuǎn)變出的氨與硫酸化合生成硫酸銨。分解反響進(jìn)行得很慢，可參加硫酸銅及硫酸鉀或硫酸鈉促進(jìn)反響，其中硫酸銅為催化劑，硫酸鉀或硫酸鈉可提高沸點(diǎn)。過氧化氫也能加速反響。110整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)B、銨離子的生成消化完了以后，在凱氏定氮瓶中參加強(qiáng)堿〔氫氧化鈉溶液〕消化液，使硫酸銨分解，放出氨。用水蒸汽蒸餾法，將氨蒸入過量的硼酸溶液中，氨與溶液中的氫離子結(jié)合，生成銨離子，使溶液中氫離子濃度降低。C、測(cè)定用強(qiáng)酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來的氫離子濃度為止。所用強(qiáng)酸的摩爾數(shù)即相當(dāng)于被測(cè)樣品中氨的摩爾數(shù)。111整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)112整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)②操作方法常用的凱氏定氮法分為常量法和半微量法兩種。A、常量法取被測(cè)樣品適量〔含氮量約25～30mg〕，精密稱定，樣品如為固體或半固體，可用濾紙稱取，并連同濾紙置于燥的500mL凱氏燒瓶中；113整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)依次參加硫酸鉀〔或無水硫酸鈉〕10g和硫酸銅粉末0.5g，再沿瓶壁緩緩加硫酸20mL；在凱氏燒瓶口放一小漏斗并使燒瓶成45°斜置，用直火緩緩加熱，使溶液的溫度保持在沸點(diǎn)以下，等泡沸停止，強(qiáng)熱至沸騰，待溶液成澄明的綠色后，繼續(xù)加熱30min，放冷。114整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)沿瓶壁緩緩加水250mL，振搖混合，放冷后加40％氫氧化鈉溶液75mL，注意使沿瓶壁流至底部，自成一液層，加鋅粒數(shù)粒，用氮?dú)馇驅(qū)P氏燒瓶與冷凝管連接；另取2％硼酸溶液50mL，置500mL錐形瓶中，加甲基紅-溴甲酚綠混合指示液10滴；115整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)將冷凝管下端插入硼酸溶液中，輕輕擺動(dòng)凱氏燒瓶使溶液混合均勻，加熱蒸餾，至接收液總體積為250mL時(shí)，將冷凝管尖端提出液面，使蒸汽沖洗1min，用水淋洗尖端后停止蒸餾；餾出液用鹽酸滴定液〔0.1mol/L〕滴定至溶液由藍(lán)綠色變?yōu)榛易仙?，并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1mL鹽酸滴定液〔0.1mol/L〕相當(dāng)于1.401mg的N。116整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)B、半微量法圖中A為1000mL圓底燒瓶，B為平安瓶，C為連有氮?dú)馇虻恼麴s器，D為漏斗，E為直形冷凝管，F(xiàn)為100mL錐形瓶，G、H為橡皮夾。連接裝置，A瓶中加水適量與甲基紅指示液數(shù)滴，加稀硫酸使成酸性，加玻璃珠或沸石數(shù)粒。117整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)從D漏斗加水約50mL，關(guān)閉G夾，開放冷凝水，煮沸A瓶中的水，當(dāng)蒸汽從冷凝管尖端冷凝而出時(shí)，移去火源，關(guān)H夾，使C瓶中的水反抽到B瓶中，開G夾，放出B瓶中的水，關(guān)B瓶及G夾，將冷凝管尖端插入50mL水中，使水自冷凝管尖端反抽至C瓶，再抽至B瓶，如上法放出。如此將儀器洗滌2～3次。118整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)取被測(cè)樣品適量〔含氮量約1～2mg〕，精密稱定，置枯燥的30～50mL凱氏燒瓶中，加硫酸鉀〔或無水硫酸鈉〕0.3g與30％硫酸銅溶液5滴，再沿瓶壁滴加硫酸2.0mL；在凱氏燒瓶口放一漏斗，并使燒瓶成45°斜置，用小火緩緩加熱使溶液保持在沸點(diǎn)以下，等泡沸停止，逐步加大火力，沸騰至溶液成澄明的綠色后，繼續(xù)加熱10min，放冷，加水2mL。119整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)取2％硼酸溶液10mL，置100mL錐形瓶中，加甲基紅-溴甲酚綠混合指示液5滴，將冷凝管尖端插入液面下；將凱氏燒瓶中內(nèi)容物經(jīng)由D漏斗轉(zhuǎn)入C蒸餾瓶中，用水少量淋洗凱氏燒瓶及漏斗數(shù)次；參加40％氫氧化鈉溶液10mL，用少量水再洗漏斗數(shù)次；120整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)關(guān)G夾，加熱A瓶進(jìn)行蒸汽蒸餾，至硼酸液開始由酒紅色變?yōu)樗{(lán)綠色時(shí)起，繼續(xù)蒸餾約10min，將冷凝管尖端提出液面，使蒸汽繼續(xù)沖洗約1min，用水淋洗尖端后停止蒸餾。121整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)餾出液用鹽酸滴定液〔0.01mol/L〕滴定至溶液由藍(lán)綠色變?yōu)榛易仙?，并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正〔空白和供試品所得餾出液的容積應(yīng)根本相同，約70～75mL〕。每1mL鹽酸滴定液〔0.01mo1/L〕相當(dāng)于0.1401mg的N。122整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)〔2〕雙縮脲法雙縮脲法分為常量法和微量法。①常量雙縮脲法蛋白質(zhì)含有多個(gè)肽鍵，因此有雙縮脲反響，在堿性溶液中蛋白質(zhì)與銅離子形成紫紅色化合物，可在540nm比色測(cè)定，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸組成無關(guān)，該法測(cè)定范圍為1～10mg蛋白質(zhì)/mL。雙縮脲法常用于需要快速的測(cè)定，硫酸銨不干擾此顯色反響，使其有利于對(duì)蛋白質(zhì)純化早期步驟的測(cè)定。干擾此測(cè)定的物質(zhì)有Tris及含氨基酸、多肽的緩沖液，以及蔗糖、甘油等。123整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)A、溶液的配制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確量取經(jīng)真空枯燥的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)〔牛血清白蛋白〕，用水配制成10mg/mL的溶液，如果蛋白質(zhì)不易溶解，可用0.05mol/L氫氧化鈉溶液配制，也可稍微加熱或放置過夜以助溶。雙縮脲試劑稱取1.5g硫酸銅〔CuSO4·5H2O〕，6g酒石酸鉀鈉〔NaKC4H4O6·H2O〕，依次溶于500mL水中，在攪拌下參加300mL10％氫氧化鈉溶液，用水稀釋1000mL。通?？梢詤⒓?g碘化鉀以防止銅離子自動(dòng)復(fù)原形成一價(jià)氧化銅沉淀。124整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)所用的蒸餾水應(yīng)在臨用前煮沸以除去所溶解的二氧化碳，待冷卻后配制。配好的雙縮脲試劑應(yīng)貯存于塑料瓶中〔或內(nèi)壁涂以石蠟的玻璃瓶中〕。此試劑可長(zhǎng)期保存，假設(shè)瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，那么應(yīng)重配。125整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)B、標(biāo)準(zhǔn)曲線取6支試管，分別參加標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0、0.06、0.12、0.24、0.36、0.48、0.60mL，用水補(bǔ)足至0.60mL，然一每管各加雙縮脲試劑2.4mL，混勻后在室溫〔20～25℃〕保溫15min，然后在540nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色測(cè)定。以溶液中蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，以A540為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。5mg牛血清白蛋白/mL溶液A540約為0.27。該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性及重復(fù)性較好，一般要求每次測(cè)定樣品都要作一次標(biāo)準(zhǔn)曲線以保持標(biāo)準(zhǔn)品和樣品測(cè)定系統(tǒng)的一致性，消除操作誤差。126整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)C、樣品測(cè)定取樣品0.6mL，同上法操作于540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，然后在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品的濃度，即得。注意樣品濃度假設(shè)超過10mg/mL應(yīng)做適當(dāng)稀釋。假設(shè)樣品中脂類含量過高，那么在30min后會(huì)有霧狀沉淀產(chǎn)生，故測(cè)定須控制在30min內(nèi)完成。127整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)②微量雙縮脲法

有些樣品中蛋白質(zhì)含量很少，在常量雙縮脲法測(cè)定范圍之外，可選用微量法進(jìn)行測(cè)定。該法顯色原理與雙縮脲法相同，由于銅與蛋白質(zhì)復(fù)合物的最大吸收峰260～280nm，但在此區(qū)域干擾因素及空白吸收都很大，而選在310～330nm測(cè)定干擾因素少一些，但仍比540nm測(cè)定靈敏10倍以上，因此可選用310nm進(jìn)行比色測(cè)定，測(cè)定范圍為0.1～1.0mg/mL；或用330nm測(cè)定，測(cè)定范圍為0.2～2.0mg/mL。干擾此測(cè)定的物質(zhì)包括組氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、Tris、乙醇胺、硫酸銨、尿素、去垢劑等。128整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)A、溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液1.0或2.0mg/mL牛血清白蛋白溶液。微量雙縮脲試劑稱取173g枸櫞酸三鈉〔Na3C6H5O7·2H2O〕、100g無水碳酸鈉一起溶于溫水中，稱取17.3g硫酸銅〔CuSO4·5H2O〕溶于100mL水中，兩者合并用水稀釋至1000mL。該試劑可長(zhǎng)期保存，假設(shè)出現(xiàn)黑色沉淀需重配。129整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)B、標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品測(cè)定取7支試管分別參加標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液0、0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mL，用水補(bǔ)足至1.5mL，加6％氫氧化鈉溶液1.5mL混勻，再加0.15mL微量雙縮脲試劑，混勻后在室溫〔20～25℃〕保溫15min，然后在310nm或330nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色測(cè)定，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.0mg/mL的牛血清白蛋白溶液的A310約為1.04，A330約為0.67。C、樣品測(cè)定取1.5mL樣品同上操作，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得其濃度。130整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)〔3〕福林酚試劑法蛋白質(zhì)與福林酚試劑反響后形成的化合物可在750nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，計(jì)算蛋白質(zhì)的含量,測(cè)定范圍為0.03～0.3mg/mL；或500nm波長(zhǎng)處測(cè)定，范圍為0.05～0.5mg/mL。該法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較差，樣品濃度需按標(biāo)準(zhǔn)曲線校正。131整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)福林酚試劑的干擾因素包括Tris、HEPES、MOPS、MES、CAPSTES、CHES、枸櫞酸、琥珀酸、谷氨酸、組氨酸、甘氨酸、N-二〔羥乙基〕甘氨酸、甘氨酰甘氨酸等緩沖液；EDTA、EGTA等鰲合劑；蔗糖、甘油、氨基葡萄糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、木糖類山梨醇等糖類；酚、二巰基蘇糖醇、巰基乙醇、谷胱甘肽、半胱氨酸等復(fù)原劑；汞、錳、鈷等二價(jià)金屬離子；Triton、Tween、Lubrol等去垢劑以及乙烯、乙二醇、聚乙烯、吡咯烷酮、載體兩性電解質(zhì)等。高濃度的尿素、鹽酸胍、硫酸銨、硫酸鈉、鉀鹽、三氯醋酸、乙醇、乙醚、丙酮、脂類等化合物也對(duì)測(cè)定有影響。132整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)A、溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0.3或0.5mg/mL牛血清白蛋白溶液。福林試劑

試劑甲由下述三種溶液配制：稱取20g無水碳酸鈉、4g氫氧化鈉溶解于1000mL水中；稱取0.2g硫酸銅溶于20mL水中；稱取0.4g酒石酸鉀鈉溶于20mL水中。測(cè)定前將三種溶液按100︰1︰1混合均勻，即得。混合30min后使用，混合液只能當(dāng)天配制。三種溶液分開可長(zhǎng)期保存。133整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)試劑乙〔福林試劑〕：試劑商店有售。配制：在2L的磨口回流裝置內(nèi)參加100g鎢酸鈉，25g鉬酸鈉，700mL蒸餾水。50mL85％磷酸及100mL濃鹽酸充分混勻后，以小火回流10h，再參加150g硫酸鋰，50mL蒸餾水及數(shù)滴液體溴，然后開口繼續(xù)沸騰15min，以驅(qū)逐過量的溴，冷卻后定容到1000mL，過濾，溶液呈黃綠色。以酚酞為指示劑，用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，使酸度為1mol/L即得。置于棕色瓶中冰箱保存。134整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)B、標(biāo)準(zhǔn)曲線在試管中分別參加標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0、0.025、0.05、0.075、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50mL，用水補(bǔ)足到0.50mL，加試劑甲2.5mL混勻后在室溫〔20～25℃〕放置10min，再參加0.25mL試劑乙，立即混勻，室溫放置30min，然后在500nm或750nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸收度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。135整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)C、樣品測(cè)定

把稀釋至適宜濃度的樣品按上述操作進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定吸收度通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得樣品濃度。該法顯色時(shí)間受溫度影響較大，要注意控制在同一條件下進(jìn)行。0.2mg/mL牛血清白蛋白溶液的A550約為0.33，A750約為0.56。136整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)〔4〕紫外吸收法①280nm光吸收法由于蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)在275～280nm波長(zhǎng)處有一個(gè)紫外吸收頂峰，在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在280nm波長(zhǎng)處的光吸收度值〔A280〕與其濃度成正比，因此可作定量測(cè)定。該法測(cè)定范圍為0.01～0.1mg/mL。該法簡(jiǎn)單、靈敏、快速、不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測(cè)定，因此在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中廣泛應(yīng)用。137整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)由于不同蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸的含量不同、所處的微環(huán)境也不同，因此不同蛋白質(zhì)溶液在280nm的光吸收值也不同。據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，濃度為1mg/mL的溶液的1800種蛋白質(zhì)在280nm的光吸收值在0.3～3.0之間，平均值為1.25±0.51。138整理課件第二節(jié)

多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)測(cè)定方法：取3mL蛋白質(zhì)溶液，以緩沖液作空白對(duì)照，用光徑為1cm的石英比色杯，在280nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度值。通常以濃度為1mg/mL的蛋白質(zhì)溶液的A280為1.0作為估算。假設(shè)該蛋白質(zhì)的文獻(xiàn)值，可直接計(jì)算出樣品溶液中蛋白質(zhì)的濃度。該方法適用于一般的半定量測(cè)定，也可用于純蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。由于蛋白質(zhì)的紫外吸收頂峰常因pH的改變而有變化，故用紫外吸收法時(shí)要注意溶液的pH值。139