原核蛋白表達(dá)與純化課件

ThekeyofProkaryoticproteinexpressionandpurification?：400-898-0321原核蛋白表達(dá)與純化原核表達(dá)概述原核表達(dá)策略選擇表達(dá)結(jié)果驗(yàn)證常見(jiàn)問(wèn)題與實(shí)驗(yàn)例上篇原核表達(dá)原核蛋白表達(dá)與純化原核表達(dá)原理概述表達(dá)載體表達(dá)菌株表達(dá)條件原核表達(dá)概述

原核蛋白表達(dá)與純化原核表達(dá)原理概述表達(dá)載體目的基因重組載體表達(dá)菌株“基因——載體——菌株——培養(yǎng)”培養(yǎng)，誘導(dǎo)構(gòu)建轉(zhuǎn)化原核蛋白表達(dá)與純化表達(dá)載體

啟動(dòng)子融合標(biāo)簽常用表達(dá)載體系統(tǒng)原核蛋白表達(dá)與純化常見(jiàn)啟動(dòng)子

λpL啟動(dòng)子： 熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子

trp啟動(dòng)子： 化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子

trc啟動(dòng)子： trp+lac雜交啟動(dòng)子

tac啟動(dòng)子： trp+lacUV5雜交啟動(dòng)子；

pGEX（Pharmacia）、pMal（NEB）T7/T7lac啟動(dòng)子： pET（Novagen）、pEASY-E1/E2（Transgen）原核蛋白表達(dá)與純化T7啟動(dòng)子原核蛋白表達(dá)與純化T7lac啟動(dòng)子原核蛋白表達(dá)與純化融合標(biāo)簽

常用于蛋白檢測(cè)與純化。有時(shí)也可增加蛋白可溶性、將蛋白運(yùn)轉(zhuǎn)至特定位置。原核蛋白表達(dá)與純化N端融合： 易于構(gòu)建。終止密碼子來(lái)自載體/基因

表達(dá)量高

提前終止會(huì)干擾純化

二級(jí)翻譯起始不影響純化原核蛋白表達(dá)與純化C端融合： 構(gòu)建時(shí)注意避免移碼

基因不能自帶終止密碼子

提前終止不影響純化

二級(jí)翻譯起始會(huì)干擾純化原核蛋白表達(dá)與純化常用融合標(biāo)簽

His·Tag pET系統(tǒng)

GST·Tag pGEX系統(tǒng)

MBP·Tag pMal系統(tǒng)原核蛋白表達(dá)與純化系統(tǒng)名稱(chēng)公司啟動(dòng)子抗性常用標(biāo)簽特點(diǎn)pGEXGE

(Pharmacia)tacAmpGST·Tag可溶性表達(dá)，純化難以控制，谷胱甘肽一步洗脫，得到的蛋白純度較低,通常需要去掉GST·TagpMalNEBtacAmpMBP·Tag可溶性表達(dá)，純化難以控制，麥芽糖一步洗脫，得到的蛋白純度較低,通常需要去掉MBP·TagpETMerck

(Novagen)T7

T7lacAmp

KanHis·Tag種類(lèi)豐富。標(biāo)簽小，無(wú)需切割，一般來(lái)說(shuō)，對(duì)蛋白活性無(wú)影響。純化及其方便。pEASYTransgenT7lacAmpHis·Tag同pET系統(tǒng)常用表達(dá)載體系統(tǒng)原核蛋白表達(dá)與純化表達(dá)菌株考慮因素細(xì)胞特性蛋白穩(wěn)定性蛋白酶缺陷型——B型菌株，缺失lon、ompT蛋白酶

多種常用表達(dá)菌株均為此類(lèi)，如BL21、Origami、Rosetta等啟動(dòng)子tac啟動(dòng)子需要大腸桿菌自身的RNA聚合酶即可：BL21

T7啟動(dòng)子需要能夠提供T7RNA聚合酶的細(xì)胞：DE3溶源菌抗性細(xì)胞不能與載體帶有相同的抗性：

pET-28a+OrigamiB(DE3) No！

pET-21b+OrigamiB(DE3) Yes！嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控BL21(DE3)pLysS/BL21(DE3)pLysE稀有密碼子Rosetta系列溶解性O(shè)rigami系列稀有密碼子不同生物使用密碼子存在偏愛(ài)性。某種或某幾種tRNA的缺乏，會(huì)導(dǎo)致外源目的基因的mRNA無(wú)法正常在E.coli里表達(dá)，是為“稀有”密碼子。原核蛋白表達(dá)與純化表達(dá)條件

乳糖操縱子與誘導(dǎo)物常用表達(dá)條件的優(yōu)化原核蛋白表達(dá)與純化乳糖操縱子與誘導(dǎo)物1980年，GuaranteL等構(gòu)建了以乳糖操縱子為基礎(chǔ)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

GuaranteL,RobertsTM,PtashneM.Atechniqueforexpressioneukaryoticgenesinbacteria.Science,1980,209:1428~1430

啟動(dòng)子Plac+操縱基因lacO+結(jié)構(gòu)基因

lacI負(fù)調(diào)控：

阻遏物lacI與操縱基因lacO結(jié)合，抑制表達(dá)

IPTG：半乳糖苷類(lèi)似物，結(jié)合阻遏物lacI使其失活，啟動(dòng)誘導(dǎo)表達(dá)

cAMP-CAP正調(diào)控

cAMP結(jié)合并激活CAP，起始轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)正調(diào)控

葡萄糖抑制腺苷酸環(huán)化酶，ATP不能轉(zhuǎn)化為cAMP，無(wú)cAMP-CAP，無(wú)轉(zhuǎn)錄原核蛋白表達(dá)與純化常用表達(dá)條件的優(yōu)化

培養(yǎng)基組分溫度

IPTG濃度

OD值培養(yǎng)體積與溶氧量原核蛋白表達(dá)與純化根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇表達(dá)策略載體選擇感受態(tài)細(xì)胞選擇表達(dá)條件原核表達(dá)策略選擇原核蛋白表達(dá)與純化根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇表達(dá)策略明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇表達(dá)載體選擇表達(dá)菌株優(yōu)化表達(dá)條件原核蛋白表達(dá)與純化實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 表達(dá)策略

活性分析 可溶表達(dá)制備抗原 包涵體高純度 融合標(biāo)簽結(jié)構(gòu)研究 天然蛋白…… ……原核蛋白表達(dá)與純化選擇表達(dá)載體系統(tǒng)名稱(chēng)公司啟動(dòng)子抗性常用標(biāo)簽特點(diǎn)pGEXGE

(Pharmacia)tacAmpGST·Tag可溶性表達(dá)，純化難以控制，谷胱甘肽一步洗脫，得到的蛋白純度較低,通常需要去掉GST·TagpMalNEBtacAmpMBP·Tag可溶性表達(dá)，純化難以控制，麥芽糖一步洗脫，得到的蛋白純度較低,通常需要去掉MBP·TagpETMerck

(Novagen)T7

T7lacAmp

KanHis·Tag種類(lèi)豐富。標(biāo)簽小，無(wú)需切割，一般來(lái)說(shuō)，對(duì)蛋白活性無(wú)影響。純化及其方便。pEASYTransgenT7lacAmpHis·Tag同pET系統(tǒng)原核蛋白表達(dá)與純化選擇表達(dá)菌株菌株適合啟動(dòng)子特性BL21tac、trc……(pGEX、pMal)適用于非T7啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)BL21(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)適用于T7、T7lac的表達(dá)系統(tǒng)，適用于非毒基因的表達(dá)BL21(DE3)pLysST7/T7lac(pET，pEASY)質(zhì)粒pLysS含有表達(dá)T7溶菌酶的基因，可結(jié)合T7RNA聚合酶，降低本底表達(dá)水平。適用于嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控毒基因的表達(dá)Rosetta(DE3)

Transetta(DE3)

T7/T7lac(pET，pEASY)補(bǔ)充6種稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA，提高外源基因，特別是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平OrigamiB(DE3)

TransB(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)具有thioredoxinreductase/glutathionereductase雙突變，有助于形成更多的二硫鍵，增加蛋白的可溶性。毒基因：基因表達(dá)產(chǎn)物——即目的蛋白，影響宿主生長(zhǎng)（“毒性”）PageDown原核蛋白表達(dá)與純化PageUpBL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE利用T7溶菌酶的嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控機(jī)制原核蛋白表達(dá)與純化優(yōu)化表達(dá)條件葡萄糖： 抑制cAMP形成，進(jìn)而抑制表達(dá)，嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控

無(wú)其他嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控手段（pLysS）且毒基因時(shí)，至關(guān)重要！溫度： 影響表達(dá)速率、蛋白可溶性與活性IPTG濃度： 影響表達(dá)速率、蛋白可溶性與活性

lac透性酶(lacY1)突變使IPTG均一滲透，獲得濃度依賴(lài) 的誘導(dǎo)：Tuner，OrigamiB，Rosetta其他因素： 菌體密度

Mg2+

培養(yǎng)體積與通氣

……原核蛋白表達(dá)與純化ArtMediaTMProteinExpression（AMPE）

葡萄糖抑制cAMP形成，無(wú)cAMP-CAP，不能正調(diào)控乳糖操縱子，因而無(wú)法利用乳糖，使得大腸桿菌優(yōu)先利用葡萄糖

AMPE中含有特定配比的葡萄糖與乳糖，利用該機(jī)理，使得葡萄糖耗盡開(kāi)始攝入乳糖時(shí)，控制細(xì)菌恰好生長(zhǎng)到適合誘導(dǎo)的階段（對(duì)數(shù)期），利用乳糖代謝，啟動(dòng)自動(dòng)誘導(dǎo)！無(wú)需監(jiān)控菌體生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)誘導(dǎo)無(wú)需加入IPTG，對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)無(wú)抑制細(xì)胞密度高，蛋白產(chǎn)量高應(yīng)用于一切乳糖操縱子表達(dá)系統(tǒng)：pET、pGEX、pMal、pEASY……原核蛋白表達(dá)與純化4123pET28a,30kDa1：ArtMedia2：LB3：LB+0.2%Glucose4：SOB原核蛋白表達(dá)與純化載體：pEASY-E1

蛋白：70kDa

菌株：Transetta(DE3)Lane1:LB培養(yǎng)基，對(duì)照

Lane2:LB培養(yǎng)基，IPTG誘導(dǎo)

Lane3:AM-PE自動(dòng)誘導(dǎo)載體：pGEX-5X-3蛋白：70kDa

蛋白：30kDa

菌株：BL21Lane1:LB培養(yǎng)基，IPTG誘導(dǎo)

Lane2:AM-PE自動(dòng)誘導(dǎo)

Lane3:LB培養(yǎng)基，對(duì)照123123原核蛋白表達(dá)與純化表達(dá)定位表達(dá)結(jié)果驗(yàn)證溶解性信號(hào)肽活性免疫原性產(chǎn)量純化難度胞內(nèi)表達(dá)可溶/包涵體不需要有/無(wú)有最高≤50%蛋白種類(lèi)多，需裂解菌體，復(fù)雜周質(zhì)表達(dá)多為可溶需要有有較少≤4%蛋白種類(lèi)少，需滲透壓休克，相對(duì)容易胞外分泌完全可溶需要有有變化較大純化簡(jiǎn)單。但機(jī)理不詳，成功先例少表面展示融合膜蛋白/嵌合于膜上需要-有-適用于疫苗開(kāi)發(fā)、抗體制備，前景廣闊。原核蛋白表達(dá)與純化表達(dá)定位菌液離心菌體細(xì)胞總蛋白培養(yǎng)基組分懸菌，滲透壓休克菌體細(xì)胞周質(zhì)組分懸菌，裂解，離心胞質(zhì)可溶組分沉淀溶解，離心胞質(zhì)不溶組分沉淀原核蛋白表達(dá)與純化沉淀上清全菌可溶表達(dá)沉淀上清全菌包涵體原核蛋白表達(dá)與純化常見(jiàn)問(wèn)題與實(shí)驗(yàn)例無(wú)表達(dá)或表達(dá)量低蛋白不可溶蛋白純化障礙原核蛋白表達(dá)與純化無(wú)表達(dá)或表達(dá)量低載體-菌株搭配不當(dāng)摸索最佳的組合載體啟動(dòng)子菌株pGEXtacBL21pMaltacBL21pETT7/T7lacBL21(DE3)BL21(DE3)pLysSRosetta(DE3)OrigamiB(DE3)pEASYT7lac同上原核蛋白表達(dá)與純化無(wú)表達(dá)或表達(dá)量低稀有密碼子影響： 翻譯終止，移碼突變，氨基酸序列錯(cuò)誤，表達(dá)量低或無(wú)表達(dá)應(yīng)對(duì)： 在宿主中補(bǔ)充稀有密碼子的tRNA

Rosetta系列菌株（Novagen公司）原核蛋白表達(dá)與純化1：BL21(DE3)；2：Rosetta(DE3)；3：BL21(DE3)pLysS目的蛋白M123原核蛋白表達(dá)與純化無(wú)表達(dá)或表達(dá)量低毒基因影響：宿主中質(zhì)粒不穩(wěn)定、抑制生長(zhǎng)或殺死宿主（溶菌）、表達(dá)量低或無(wú) 表達(dá)應(yīng)對(duì)：嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控啟動(dòng)子，抑制本底表達(dá) 選擇特殊的載體（pETcoco） 選擇特定的宿主菌（BL21(DE3)pLysS，BL21(DE3)pLysE） 優(yōu)化培養(yǎng)條件與誘導(dǎo)表達(dá)條件 包涵體表達(dá)原核蛋白表達(dá)與純化123pET28aLane1：Rosetta(DE3)Lane2：BL21(DE3)pLysSLane3：BL21(DE3)原核蛋白表達(dá)與純化蛋白不可溶

成因：蛋白質(zhì)正確折疊，形成有活性、有功能的天然構(gòu)象的程度。定位：可溶蛋白 胞質(zhì)，細(xì)胞周質(zhì)，胞外（培養(yǎng)基） 包涵體 胞質(zhì)，細(xì)胞周質(zhì)特點(diǎn)：可溶蛋白 天然構(gòu)象，正確折疊，具有生物活性 包涵體 高濃度，高純度，無(wú)活性，具免疫原性，不易水解原核蛋白表達(dá)與純化增加可溶表達(dá)原理 手段促進(jìn)正確折疊融合催化二硫鍵形成酶的標(biāo)簽選擇促二硫鍵形成的細(xì)胞（Origami系列菌株）分泌表達(dá)細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)，胞外分泌融合表達(dá)融合溶解性高的標(biāo)簽（GST，MBP）控制表達(dá)水平誘導(dǎo)溫度IPTG濃度“假”包涵體

（疏水區(qū)域，膜結(jié)合等）特殊裂解緩沖液（去垢劑，鹽，核酸酶……） 原核蛋白表達(dá)與純化123Lane1：37℃Lane2：30℃Lane3：25℃12pETpGEX原核蛋白表達(dá)與純化促進(jìn)包涵體形成目的 高濃度，高純度 毒基因表達(dá) 免受蛋白酶水解（小蛋白，多肽）手段 胞質(zhì)表達(dá) 提升表達(dá)速率（誘導(dǎo)溫度，IPTG濃度，etc） 特定的表達(dá)載體（pET-17xb，pET-31b(+)） 原核蛋白表達(dá)與純化蛋白純化障礙

表達(dá)——純化是一個(gè)完整的、密切聯(lián)系的過(guò)程，蛋白純化過(guò)程中，很多問(wèn)題的根源來(lái)自上游表達(dá)蛋白不結(jié)合，洗脫雜帶多，包涵體不易溶解……下篇詳述原核蛋白表達(dá)與純化

純化策略選擇親和層析與離子交換層析層析方法的組合與順序包涵體純化與復(fù)性下篇蛋白純化原核蛋白表達(dá)與純化根據(jù)蛋白自身特點(diǎn)選擇純化方案常用實(shí)驗(yàn)流程純化策略選擇原核蛋白表達(dá)與純化蛋白自身特點(diǎn)可溶/包涵體融合標(biāo)簽表面凈電荷分子量其它特點(diǎn)原核蛋白表達(dá)與純化可溶/包涵體可溶蛋白無(wú)需變性步驟適用于親和層析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析等方法包涵體需要洗滌、變性、復(fù)性（如有需要）等步驟適用于某些親和層析方法（6×His·Tag）、離子交換層析不適用于某些親和層析方法（GST·Tag、MBP·Tag）不適用于凝膠過(guò)濾層析等方法原核蛋白表達(dá)與純化融合標(biāo)簽6×His·TagGST·TagMBP·Tag標(biāo)簽大小6aa26kDa42kDa原理金屬螯合層析酶-底物特異結(jié)合酶-底物特異結(jié)合溶解性可溶/包涵體有助可溶表達(dá)有助可溶表達(dá)純化條件天然/變性條件下純化僅天然條件下純化僅天然條件下純化洗脫條件咪唑，低pH還原型谷胱甘肽麥芽糖是否去除通常不需要依實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ㄒ缹?shí)驗(yàn)?zāi)康亩ㄔ说鞍妆磉_(dá)與純化表面凈電荷與蛋白質(zhì)等電點(diǎn)、溶液pH值密切相關(guān)離子交換層析的重要標(biāo)準(zhǔn)分子量天然構(gòu)象下，蛋白分子正確折疊，近似球形，大小與分子量成正比凝膠過(guò)濾層析的重要標(biāo)準(zhǔn)其他特點(diǎn)利用蛋白質(zhì)本身的特點(diǎn)進(jìn)行親和層析耐熱蛋白可用熱變性法進(jìn)行純化原核蛋白表達(dá)與純化常用實(shí)驗(yàn)流程菌體裂解蛋白預(yù)處理層析純化原核蛋白表達(dá)與純化菌體裂解凍融去垢劑溶菌酶超聲破碎原理冰晶+溶脹化學(xué)酶解細(xì)胞壁機(jī)械作用優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)便溫和溫和徹底打斷分子（DNA）缺點(diǎn)活性略有損傷容易起泡需要合適條件傷害活性發(fā)熱避免蛋白質(zhì)降解低溫蛋白酶抑制劑原核蛋白表達(dá)與純化蛋白質(zhì)預(yù)處理(可溶)初分離/粗純

DNA去除熱變性（對(duì)耐熱蛋白）交換Buffer(NH4)2SO4沉淀透析原核蛋白表達(dá)與純化蛋白質(zhì)預(yù)處理(包涵體)

洗滌變性溶解13Lane1：洗滌前Lane2：洗滌Lane3：洗滌后2原核蛋白表達(dá)與純化層析純化選擇適當(dāng)層析方法親和層析離子交換層析凝膠過(guò)濾層析原核蛋白表達(dá)與純化原核蛋白表達(dá)與純化親和層析

利用分子與其配體間特殊的、可逆性的親和結(jié)合作用而進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。特異性

酶——底物

抗原——抗體

配體——受體可逆性

改變條件可以使結(jié)合解除原核蛋白表達(dá)與純化金屬螯合層析——6×His·Tag純化基本原理與特點(diǎn)常用純化流程常見(jiàn)問(wèn)題與技巧原核蛋白表達(dá)與純化基本原理與特點(diǎn)

利用蛋白質(zhì)表面暴露的一些氨基酸殘基和載體之上的金屬離子之間的相互作用而進(jìn)行的親和純化。

Ni-Beads

基質(zhì)：瓊脂糖凝膠

側(cè)鏈：NTA、IDA

配基：Ni2+原核蛋白表達(dá)與純化Ni2+與組氨酸形成配位鍵原核蛋白表達(dá)與純化Ni-NTANi-IDA原核蛋白表達(dá)與純化常用純化流程

樣品處理裝柱，平衡上樣洗滌與洗脫再生原核蛋白表達(dá)與純化常見(jiàn)問(wèn)題與技巧蛋白不結(jié)合無(wú)標(biāo)簽——構(gòu)建有誤、提前終止（C端）、二級(jí)翻譯起始（N端）

測(cè)序，重新構(gòu)建標(biāo)簽未暴露——變性不充分，天然蛋白折疊

充分變性結(jié)合條件不合適——螯合劑、還原劑、咪唑、pH值……

螯合劑 EDTA≤0.1mM（忌用）

還原劑 DTT≤1mM（不推薦）

β-ME≤20mM（慎用）

咪唑 ≤20mM（因蛋白而異）原核蛋白表達(dá)與純化1-S1-FT2-S2-FT樣品1：0.5mMEDTA樣品2：無(wú)EDTA原核蛋白表達(dá)與純化蛋白雜帶多洗脫條件不合適——咪唑濃度、pH值

梯度洗脫非特異性結(jié)合

上調(diào)初始咪唑濃度

β-ME

非離子型去垢劑、甘油、NaCl……蛋白不完整——蛋白降解、提前終止（N端）、二級(jí)翻譯起始（C端）

低溫，蛋白酶抑制劑

重新構(gòu)建填料過(guò)多原核蛋白表達(dá)與純化無(wú)初始咪唑10mM初始咪唑填料過(guò)多原核蛋白表達(dá)與純化無(wú)β-ME有β-ME原核蛋白表達(dá)與純化N端融合C端融合原核蛋白表達(dá)與純化蛋白提前洗脫洗脫條件不合適——咪唑濃度、pH值

改變洗脫條件蛋白結(jié)合能力弱

下調(diào)初始咪唑濃度原核蛋白表達(dá)與純化蛋白洗脫無(wú)檢出洗脫條件不合適——咪唑濃度、pH值

增加洗脫強(qiáng)度蛋白結(jié)合能力強(qiáng)

上調(diào)初始咪唑濃度蛋白濃度低

WesternBlot

優(yōu)化表達(dá)蛋白未結(jié)合或被提前洗滌

電泳檢查全部樣品：上樣前、流出、洗滌、洗脫原核蛋白表達(dá)與純化SFTWashElute1Elute2Elute3Elute4Elute5咪唑濃度：LaneS： 10mM

LaneWash： 20mM

LaneElute1~5： 40mM,80mM,120mM,160mM,200mM原核蛋白表達(dá)與純化GST標(biāo)簽基本原理與特點(diǎn)GST： GlutathioneS-transferase，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶填料： 固定于基質(zhì)的谷胱甘肽原理： GST與谷胱甘肽的特異性結(jié)合（酶與底物）洗脫： 還原型谷胱甘肽特點(diǎn)（以pGEX系統(tǒng)為例）

N端融合 有助正確折疊，多為可溶表達(dá) 不適用于變性條件的純化 標(biāo)簽可以切除 填料沒(méi)有理想的再生方法原核蛋白表達(dá)與純化GSTGST融合蛋白10mMGlutathione原核蛋白表達(dá)與純化離子交換層析

離子交換層析原理離子交換層析分類(lèi)離子交換層析特點(diǎn)原核蛋白表達(dá)與純化離子交換層析原理原核蛋白表達(dá)與純化原核蛋白表達(dá)與純化離子交換層析分類(lèi)按活性基團(tuán)分陰離子交換劑：DEAE、Q……

陽(yáng)離子交換劑：CM、S、P11……按基質(zhì)材料分離子交換樹(shù)脂離子交換纖維素離子交換葡聚糖：Sephadex

離子交換瓊脂糖：Sepharose原核蛋白表達(dá)與純化離子交換層析特點(diǎn)原理：待純化物質(zhì)與填料的靜電作用洗脫：離子強(qiáng)度，pH值特點(diǎn) 無(wú)需融合標(biāo)簽，理論上可純化任何蛋白 適用于天然或變性條件的純化 需要靈活調(diào)整pH值與離子強(qiáng)度 填料可用高鹽濃度簡(jiǎn)單再生原核蛋白表達(dá)與純化SFTWashElute1Elute2Elute3Elute4填料： P11目的蛋白 20kDa，pI=9.02平衡緩沖液 pH7.4,20mMKCl原核蛋白表達(dá)與純化需要結(jié)合待純化蛋白的特性，綜合考慮各種純化方法的適用條件，選擇合適的純化方法與不同純化步驟的次序。例如：His蛋白純化時(shí)，要小心Buffer中螯合劑（EDTA）與還原劑（DTT）的影響而進(jìn)行離子交換純化時(shí)，則必須考慮Buffer與樣品的pH值和離子強(qiáng)度，尤其是細(xì)菌裂解后，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放對(duì)pH值與離子強(qiáng)度的影響硫酸銨沉淀與透析的搭配使用包涵體蛋白的變、復(fù)性與純化純化方法的組合原核蛋白表達(dá)與純化以某蛋白質(zhì)為例，組合不同的純化方法pI/MW:6.31/75kDa，pET28a/BL21(DE3)方法1：確認(rèn)表達(dá)→裂解菌體、離心保留上清→His純化，確認(rèn)純化效果→合并目的蛋白，透析→DEAE純化，確認(rèn)目的蛋白→合并目的蛋白方法2：確認(rèn)表達(dá)→裂解菌體、離心保留上清→硫酸銨沉淀、溶解、透析→DEAE純化，確認(rèn)目的蛋白→His純化，確認(rèn)純化效果→合并目的蛋白，透析→合并目的蛋白原核蛋白表達(dá)與純化DEAENi-NTA原核蛋白表達(dá)與純化DEAENi-NTA原核蛋白表達(dá)與純化

包涵體洗滌包涵體變性與純化包涵體復(fù)性包涵體純化與復(fù)性原核蛋白表達(dá)與純化包涵體洗滌

目的： 去除沉淀中的雜質(zhì)，粗純化包涵體蛋白沉淀： 包涵體

細(xì)胞膜碎片+膜蛋白

雜蛋白（氫鍵/二硫鍵/疏水作用/