中華蚊母樹自然居群和遷地居群遺傳多樣性及遺傳結構分析

中華蚊母樹自然居群和遷地居群遺傳多樣性及遺傳結構分析

河岸帶作為一個重要的過渡帶，具有明顯的環(huán)境因素、生態(tài)過程和植物群落梯度。它是調(diào)整水和陸地之間的主要系統(tǒng)。河岸生態(tài)系統(tǒng)豐富，對維持區(qū)域生物多樣性有重要影響。河岸帶植物中華蚊母樹(Distyliumchinense(Fr.)Diels)為金縷梅科(Hamamelidaceae)蚊母屬(DistyliumSieb)植物,俗稱水漿柯子,常綠灌木,根系發(fā)達、盤根錯節(jié)、硬如鐵絲,能在水下生存數(shù)月,是三峽庫區(qū)河岸帶固土護岸的良好樹種,對維持庫區(qū)河岸帶物種多樣性具有重要作用,同時也是上好的觀賞盆景樹種。野生的中華蚊母樹除了貴州茂蘭有少量分布外,主要分布于烏江流域及長江三峽庫區(qū)湖北區(qū)域(宜昌、巴東、秭歸、長陽)和重慶區(qū)域(巫山、黔江、酉陽、豐都、武隆、江津)長江三峽兩岸海拔200m以下干流消落帶中上部,平均高0.8～1.2m。隨著水電工程的興建,烏江流域和長江流域大部分野生中華蚊母樹群落伴隨著原有消落帶的消失其原生境也被淹沒,再加上人類的過度采伐,導致野生資源數(shù)量和遺傳多樣性遭到破壞,大面積分布的中華蚊母樹已經(jīng)很少見,現(xiàn)存的中華蚊母樹僅零星分布在烏江及長江兩岸的河谷及溪流兩側。因此對其遺傳資源的研究及保護工作已十分必要。宜昌三峽植物園自2002年開始對中華蚊母樹進行搶救性的保護,建立了中華蚊母樹的遷地保護居群。為使中華蚊母樹資源長期得到可持續(xù)利用,有必要對中華蚊母樹的遺傳多樣性進行分析和評價。目前國內(nèi)外對中華蚊母樹的研究主要集中在水淹機制、染色體結構及ISSR種群結構分析等方面的研究,利用SRAP(sequence-relatedamplifiedpolymorphism)分子標記技術研究中華蚊母樹種群的遺傳多樣性迄今未見報道。SRAP標記是一種新型的基于PCR的分子標記系統(tǒng),由美國加州大學蔬菜作物系Li與Quiros博士于2001年提出。該標記多態(tài)性好、操作簡單、重復性好、高效、顯性(20%共顯性)、可檢測基因的可讀框(ORFs)區(qū)域,它具備了RFLP、RAPD、SSR和AFLP等分子標記的優(yōu)點,克服了它們的缺點,已廣泛應用于物種遺傳多樣性和遺傳結構的分析。本研究采用SRAP分子標記技術,對分布于三峽庫區(qū)的中華蚊母樹的遺傳多樣性和居群遺傳結構進行分析,比較和評價遷地保護居群和自然居群的遺傳多樣性水平,為進一步制定保護和群體恢復重建的策略提供科學依據(jù)。1材料和方法1.1中華蚊母樹群落調(diào)查于2008年3～4月對野生中華蚊母樹在湖北省境內(nèi)的分布范圍進行實地考察,發(fā)現(xiàn)在三峽庫區(qū)長江兩岸的中華蚊母樹群落基本已經(jīng)被淹沒,在長江的支流河谷兩岸的一些小群落由于中華蚊母樹可作為觀賞盆景被大量采挖,生境遭到極大破壞,只有零星分布。由此確定了有代表性的4個自然居群(巴東縣沿渡河鎮(zhèn)、秭歸縣香溪鎮(zhèn)、宜昌市樂天溪鎮(zhèn)及長陽縣高家堰鎮(zhèn))和1個遷地居群(宜昌市三峽植物園)進行采樣分析,其中遷地居群的樣本收集保護主要來自巴東縣沿渡河鎮(zhèn)。根據(jù)初步調(diào)查結果發(fā)現(xiàn)中華蚊母樹5個居群的大小為58～65株,由此每個居群隨機采集8～10株幼嫩葉片,采樣的樣本之間的間距在10米以上,共48個樣本(5個居群生境資料見圖1和表1)。樣品用硅膠干燥保存,帶回實驗室置于4℃冰箱保存至1個月內(nèi)完成電泳實驗。1.2方法1.2.1dna的制備采用DoyleandDoyle的CTAB法提取DNA,其濃度和純度用BioPhotometerplus核酸蛋白測定儀檢測,260nm/280nm的OD比值在1.8～1.9之間的DNA用于SRAP擴增反應。1.2.2pcr擴增檢測按照Li和Quiros等提出的原則設計SRAP引物,由上海生工生物技術有限公司合成,所用的引物組合見表2。從90對引物中篩選出7對擴增條帶較多、亮度清晰的引物。PCR反應體系為:總反應體積為20μL,包含1×PCRbuffer,2.5mmol·L-1MgCl2,0.15mmol·L-1dNTPs,1.5UTag酶,正向和反向引物各0.4μmol·L-1,50ng模板DNA,不足部分用ddH2O補足,PCR反應于PTC-100擴增儀上進行。熱循環(huán)程序為:94℃預變性1min;94℃1min,33℃1min,72℃1min,共5個循環(huán);94℃1min,52℃1min,72℃1min,共30個循環(huán);72℃延伸5min,4℃保存。PCR產(chǎn)物在含有EB的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳,在BIO-RAD凝膠電泳成像分析系統(tǒng)上照相。1.2.3遺傳變異分析根據(jù)電泳圖譜中DNA條帶的有無,將SRAP擴增結果轉(zhuǎn)化為二元數(shù)據(jù)(有帶的量化為1,無帶的量化為0,強帶和弱帶均賦值,擴增帶長度在150～2000bp),構建二元數(shù)據(jù)矩陣。應用POPGENEversion1.32軟件對全部居群和各單個居群分別進行遺傳多樣性指數(shù)分析:多態(tài)位點百分率(PPF)、Shannon信息多樣性指數(shù)(I)、等位基因數(shù)(A)、有效等位基因數(shù)(Ae)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(Hp)、種群總遺傳變異(Ht)、種群內(nèi)遺傳變異(Hs)、種群遺傳距離和遺傳相似度、居群間遺傳分化系數(shù)(Gst)、基因流(Nm)分析。將采用POPGENEversion1.32軟件計算得到的Nei(1978)的遺傳距離帶入NTSYS-pc2.10軟件對各個居群間進行UPGMA聚類分析。利用SAS9.0軟件對中華蚊母樹所有48個樣品SRAP多態(tài)性條帶進行主成分三維散點圖分析(PCA)。2結果與分析2.1豐富的遺傳多樣性采用篩選得到的多態(tài)性較高的7對SRAP引物組合對中華蚊母樹5個居群48個樣本進行PCR擴增,共得到46條帶,平均每對引物擴增出6.6條帶,片段大小為150～2000bp,其中的多態(tài)性條帶為37條,平均每對引物擴增的多態(tài)性條帶為5.3,平均多態(tài)性條帶百分率(PPF)為80.43%(表2)。結果表明該物種具有豐富的遺傳變異。圖2為引物Me2+Em1對部分參試材料擴增的電泳圖譜。2.2遺傳多樣性指數(shù)中華蚊母樹遺傳多樣性分析結果見表3,中華蚊母樹物種水平的多態(tài)性條帶百分率(PPF)為100%,等位基因數(shù)(A)為2,有效等位基因數(shù)(Ae)為1.34,Nei’s基因多樣性指數(shù)(Hp)為0.2159,Shannon信息多樣性指數(shù)(I)為0.3509,表明中華蚊母樹物種多樣性水平較高。居群多態(tài)性條帶百分率在36.96%～89.13%之間,等位基因數(shù)(A)在1.37～1.89,有效等位基因數(shù)(Ae)在1.24～1.48,Nei’s基因多樣性指數(shù)(Hp)在0.1367～0.2838之間,Shannon信息多樣性指數(shù)(I)在0.2084～0.4322之間。其中有效等位基因數(shù)(Ae)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(Hp)與Shannon信息多樣性指數(shù)(I)分析結果基本趨勢一致,居群多樣性指數(shù)大小為:三峽植物園(R5)(Ae=1.48,Hp=0.2838,I=0.4322)>沿渡河(R4)(Ae=1.40,Hp=0.2451,I=0.3810)>香溪(R3)(Ae=1.25,Hp=0.1529,I=0.2401)>高家堰(R1)(Ae=1.27,Hp=0.1486,I=0.2159)>樂天溪(R2)(Ae=1.24,Hp=0.1367,I=0.2089)。結果表明中華蚊母樹自然居群中沿渡河居群的遺傳多樣性較高,樂天溪居群的遺傳多樣性相對較低;遷地居群三峽植物園的遺傳多樣性大于自然居群的平均遺傳多樣性。2.3居群內(nèi)的遺傳變異利用POPGENEversion1.32軟件,計算不同居群之間的遺傳分化水平。結果表明,5個居群總的遺傳變異(Ht)為0.2188,居群內(nèi)的遺傳變異Hs為0.1934。根據(jù)總的遺傳多樣性(Ht)和居群內(nèi)遺傳多樣性(Hs)估測居群間遺傳分化系數(shù)(Gst),Gst=0.1161,表明在總的遺傳變異中僅有11.61%存在于居群間,88.39%變異存在于居群內(nèi),即遺傳變異主要存在于居群內(nèi)。居群間的基因流(Nm)=3.8072,遠大于1,表明居群間遺傳分化較低,存在較頻繁的基因交流,是居群內(nèi)遺傳變異比較高的原因之一。2.4變遷地居群三大種類聚類分析用POPGENEversion1.32軟件計算了Nei’s遺傳相似度和遺傳距離,結果見表4。中華蚊母樹5個居群兩兩之間的遺傳相似度相對較高,變化范圍為0.9303～0.9925,遺傳距離的變化范圍為0.0075～0.0722。其中樂天溪和香溪居群之間的遺傳相似度最大,為0.9925。高家堰和三峽植物園之間的遺傳相似度最小,為0.9303。遺傳距離則正好相反。其中遷地居群三峽植物園與沿渡河居群遺傳相似度最高(0.9733),其次是與香溪居群(0.9488),而與高家堰居群遺傳相似度最低(0.9303),表明沿渡河居群是三峽植物園遷地保護居群的主要母體居群。利用NTSYS-pcversion2.10軟件,采用Nei’s遺傳距離對中華蚊母樹居群進行UPGMA聚類,得樹狀圖(圖3)。以0.026為閾值,5個居群分為兩大類,長江三峽沿岸香溪和樂天溪居群聚為一小類再與高家堰居群聚為一大類,而沿渡河和三峽植物園居群聚為另一大類,表明遷地保護居群三峽植物園的中華蚊母樹主要來自巴東沿渡河居群。在第一類中香溪和樂天溪居群首先聚為一小類,再與高家堰聚為一類,表明香溪和樂天溪居群遺傳距離最近、兩者親緣關系較近,香溪和樂天溪居群均位于長江邊,且地理位置相距較近,也證實了遺傳距離分化與地緣距離存在較強的相關性。沿渡河和三峽植物園居群之間的聚類關系也比較近,這表明了三峽植物園居群與沿渡河居群親緣關系最近。2.5聚類分析結果中華蚊母樹居群主成分分析(PCA)結果表明,前三個主成分所包含的信息量占總信息量59.4%,其中第一主成分包含的信息量為42.11%,第二主成分包含的信息量為11.54%,第三主成分包含的信息量為5.75%,選取前3個主成分作三維散點圖(圖4)。三維散點圖清晰地顯示,5個居群的48個個體形成了兩個較為獨立地分布區(qū),高家堰、樂天溪和香溪居群聚合為一個獨立分布區(qū),巴東沿渡河和三峽植物園居群聚為另一個獨立分布區(qū),因此主成分分析基本支持上述UPGMA聚類的結果。另外從散點圖可見,每個個體的遺傳信息沒有相互重疊,從這個層次上也證明樣品采集的合理性,同時也說明所采集的48個樣本的整體多態(tài)性比較高。3討論3.1基于rapd位點分析的物種多樣性Hamrick和Godt通過對449種植物的653例等位酶遺傳變異研究的總結,綜合分析了植物等位酶遺傳多樣性與系統(tǒng)位置、分布范圍、分布地區(qū)、生活型、繁育系統(tǒng)、種子傳播方式、生殖類型和演替階段8個特征的相互關系,指出地方特有種或狹域分布的種具有較低的遺傳多樣性,并在隨后的研究中進一步證實了這一推論。但也有報道表明有些特有種甚至瀕危種也可能保持較高水平的遺傳變異,具有較高的遺傳多樣性。本研究結果顯示,中華蚊母樹作為三峽庫區(qū)區(qū)域特有的地方性物種其多態(tài)性條帶百分率(PPF)為100.00%,Nei’s基因多樣性指數(shù)(Hp)為0.2159,Shannon信息多樣性指數(shù)(I)為0.3509,表明中華蚊母樹在物種水平上具有較豐富的遺傳變異。Nybom通過比較不同分子標記評價植物物種內(nèi)遺傳多樣性的差異發(fā)現(xiàn)顯性分子標記具有可比性,可直接比較。因此,中華蚊母樹的遺傳多樣性水平與Nybom統(tǒng)計的基于RAPD位點分析的所有物種平均多樣性(Hp=0.2118)相持平,高于7個地方特有種(Hp=0.2000)、17個多年生短命植物種(Hp=0.2000)、27個雙子葉植物(Hp=0.1910)及10個自交物種(Hp=0.12)和8個混交物種(Hp=0.18)的多樣性水平,低于20個廣布種(Hp=0.2200)、38個異交物種(Hp=0.2700)、7個風媒或水媒傳播種子的物種(Hp=0.2700)、16個進化較晚的物種(Hp=0.3000)和同科近緣屬楓香屬植物楓香(Hp=0.3122)的多樣性水平。Hamrick和Loveless指出,物種的遺傳多樣性水平及其結構與其生物學特性、生境以及起源進化密不可分,其中繁育系統(tǒng)、分布范圍、生活型以及花粉和種子傳播方式的影響最大,其中廣布、異交和動物傳播種子都會使得物種具有較高的遺傳多樣性。中華蚊母樹作為區(qū)域地方性物種具有較高遺傳多樣性可能是以下幾方面的原因所致。首先,中華蚊母樹為金縷梅科蚊母樹屬植物,曾分布在北美和東亞,由于新第三紀以后氣候變化以及第四紀冰期的作用,氣候劇變及嚴寒惡劣的環(huán)境對金縷梅科這樣一個亞熱帶和熱帶類群極為不利,很多類群在中緯度和高緯度地區(qū)逐漸滅絕,其分布區(qū)明顯向南收縮,只有在一些局部地區(qū)形成該類群的“避難所”。曾分布于北美地區(qū)的該物種已全部滅絕,現(xiàn)存中華蚊母樹僅分布于東亞,而中國主要分布于三峽庫區(qū)一帶。三峽庫區(qū)屬于歐亞古大陸的南緣,由于喜馬拉雅山運動,該地區(qū)河谷不斷下切和高原不斷上升,群山起伏、河谷交錯,氣候類型豐富多樣,是分布于該地區(qū)的物種遺傳變異豐富的原因之一;其次,中華蚊母樹為多年生灌木,個體生命周期長,世代重疊,傳粉方式以蟲媒和風媒為主(資料未發(fā)表),種子為蒴果,成熟后自然炸裂落地,隨波逐流,遇阻于石縫,水退,便落地生根,故多生長在亂石夾縫中,在不同的選擇壓力下保留了各自的適宜基因,因而在漫長的進化過程中積累了較高水平的遺傳變異;第三,本研究的分子標記結果也表明中華蚊母樹物種具有較高的基因雜合度(Hp=0.2159),推測其交配系統(tǒng)為異交,同時中華蚊母樹種子千粒重僅為2.256～2.390g,傳播距離較遠,有利于基因交流,而且主成分三維散點圖顯示在每一個獨立分布區(qū)內(nèi),不是每個居群的個體各自聚在一起,而是幾個居群的個體相互聚在一起,表明這些居群間基因交流比較頻繁(Nm=3.8072),居群遺傳分化較低,居群內(nèi)遺傳多樣性水平較高。中華蚊母樹這些特殊的生物學特性、歷史進化起源和對生境的適應可能是其具有較高遺傳多樣性的重要原因。3.2中華蚊母樹系的遺傳多樣性正確的取樣策略對遺傳多樣性的有效保護至關重要,樣本量應該包含能代表某一居群的總體遺傳多樣性水平。雖然采集的樣本量越大所包含的遺傳多樣性越豐富,但由于人力、財力、時間、樣本儲藏空間以及居群的實際條件等因素的限制,最佳的選擇是樣本量盡可能小,但包含遺傳多樣性盡可能豐富的樣本(最適合樣本)。趙茹等在100株野生大豆群體中選取10～15個樣本,采樣比例為10%～15%,采用AFLP、ISSR和SSR分子標記對野生大豆群體進行了遺傳多樣性分析,所獲得的位點的預期雜合度(He)和Shannon多樣性指數(shù)(I)值達到總體樣本遺傳多樣性的90%,雖然樣本量不斷增加但是這兩個指數(shù)值基本保持不變,而且多態(tài)位點百分率(PPF)始終為100%。初步選取并調(diào)查中華蚊母樹湖北省境內(nèi)的4個自然居群和1個遷地居群的大小為58～65株,每個居群隨機采集8～10株(取樣比例為13.33%～17.24%),采用SRAP分子標記技術進行遺傳多樣性分析。結果表明,在中華蚊母樹種內(nèi)居群水平上,與同科近緣屬楓香樹屬廣布種楓香的自然居群遺傳多樣性(PPF=59.11%;Hp=0.2514;I=0.3660)比較,中華蚊母樹自然居群的平均遺傳多樣性(PPF=55.98%;Hp=0.1708;I=0.2614)略低,但與特有種的平均居群多態(tài)性指數(shù)(0.2630)持平,高于特有種的平均居群雜合度(0.0630),可見中華蚊母樹種內(nèi)自然居群遺傳多樣性仍維持在較高水平。其中以巴東沿渡河居群的遺傳多樣性最高(PPF=84.78%;Ae=1.40;Hp=0.2451;I=0.3801),可能與當?shù)貫┒?生境復雜有關,較易與臨近的其它居群進行基因交流,特別是與庫區(qū)上游生境復雜的巫山大寧河區(qū)域的中華蚊母樹居群進行交流;而樂天溪居群生境相對簡單,此段為庫區(qū)江面較寬處,與其他居群的交流受到一定的阻礙,因而該居群的遺傳多樣性最低。遷地保護居群三峽植物園的遺傳多樣性水平(PPF=89.13%;Ae=1.48;Hp=0.2838;I=0.4322)與其它自然居群相比,居群預期雜合度較高,居群保留的有效等位基因較多,這表明遷地居群遺傳變異豐富,保持了其自然居群狀態(tài)的遺傳多樣性水平。其中遷地居群和沿渡河居群聚為一類,遺傳親緣關系較大,這證實以前采取的遷地保護策略確是以沿渡河居群的樣本為主,輔以其它居群的少量個體。同時,弄清楚物種的遺傳結構也有利于制定出切實可行的遷地保護策略。一般來講,居群的遺傳分化程度越高,納入取樣范圍的居群數(shù)應越多。根據(jù)95%的保護標準,利用Andrew等的計算方法1-(Gst)n=95%(n為取樣居群數(shù)目)可以估計保護需要取樣的居群數(shù)目。例如在實際取樣時,對于一個基因流比較小,Gst值為0.60的物種,至少要取6個居群才能保存其95%的遺傳多樣性,而對于Gst值為0.20的物種而言,要達到同樣的效果則只需取樣2個居群就足夠。本研究結果發(fā)現(xiàn)中華蚊母樹Gst=0.1161,Nm=3.8072,居群間基因交流比較頻繁,居群遺傳分化比較低,遺傳變異的88.39%存在于居群內(nèi),表明只要對1個居群取樣就可保存物種95%的遺傳變異。因此結合前面的分析,進一步說明了對中華蚊母樹初步保護的取樣策略有一定的合理性。但由于本研究取樣點較少,取樣數(shù)還不夠多,有可能導致中華蚊母樹遺傳多樣性較高,因此下一步的研究需加大研究范圍,增加自然居群數(shù)取樣的研究,為進一步完善保護和重建策略提供更加科學的依據(jù)。同時根據(jù)我們對中華蚊母樹野生居群的調(diào)查發(fā)現(xiàn),中華蚊母樹主要分布在烏江和長江流域的江(河)兩岸,由于水電工程的大量興建,使其原生居群被淹沒;分布于支流河谷兩岸的中華蚊母樹,由于其可作為盆景觀賞園林綠化植物而被大量采挖,幼苗有被啃食、埋沒、毀壞的現(xiàn)象,使居群所處的生境遭到不同程度的破壞,以致很難發(fā)現(xiàn)大量分布的野生居群。因此,作者的保護策略建議是:由于居群內(nèi)88.39%變異存在于居群內(nèi),僅有11.61%存在于居群間,即遺傳變異主要存在于居群內(nèi),居群間又有一定的分化,再結合繁育特性,建議在中華蚊母樹的保護保育策略上,除了現(xiàn)已主要保護的巴東沿渡河居群外,還應增加其它高遺傳多樣性居群(如香溪、高家堰及樂天溪等)的取樣。取樣應實行植株遷移和收集種子進行繁育相結合,遷移保護地點除現(xiàn)有保護基地外,可以考慮在庫區(qū)支流的上游尋找適宜的河岸河灘作為保護保育基地,水電工程建成后,新消落帶重新形成,需重返新消落帶恢復重建自然居群。3.3遺傳聚類分析本研究采用SRAP標記對中華蚊母樹進行了遺傳多樣性分析,表明中華蚊母樹具有較高的遺傳多樣性(PPF=100.00%;Hp=0.2159;I=0.3509),與ISSR標記的分析結果(PPF=100.00%;Hp=0.2379;I=0.3808)基本一致,但兩種標記聚類結果有一定差異,ISSR標記的聚類結果顯示高家堰居群單獨聚為一類,另一類是樂天溪居群先與香溪居群聚為一小類,然后再與沿渡河和三峽植物園居群聚為一大類,而本研究SRAP聚類的結果是樂天溪居群先與香溪居群聚為一小類,后與高家堰居群聚為一大類,沿渡河和三峽植物園居群聚為另一大類。SRAP聚類結果表明地里距離比較近的樂天溪、香溪及高家堰居群