微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)大全

微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)黃文芳張松編著華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

第一部分基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)1培養(yǎng)基的配制

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：學(xué)習(xí)和掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。內(nèi)容：1．牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基的配制。2．高氏1號(hào)培養(yǎng)基的配制。3．馬丁氏培養(yǎng)基的配制。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉紅、鏈霉素、1mol/LNaOH、lmol/LHCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O。試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH試紙、棉花、牛皮紙、記號(hào)筆、線繩、紗布、漏斗、漏斗架、膠管、止水夾等。三、操作步驟（一）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，瓊脂15～20g，水1000mL，PH7.4～7.61．稱藥品按實(shí)際用量計(jì)算后，按配方稱取各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶解后倒入大燒杯；也可放在稱量紙上稱量，隨后放入熱水中，牛肉膏使與稱量紙分離，立即取出紙片。蛋白胨極易吸潮，故稱量時(shí)要迅速。2．加熱溶解在燒杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒攪拌，待藥品完全溶解后再補(bǔ)充水分至所需量。若配制固體培養(yǎng)基，則將稱好的瓊脂放入己溶解的藥品中，再加熱融化，此過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補(bǔ)足所失的水分。3．調(diào)pH檢測(cè)培養(yǎng)基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙檢測(cè)，直至達(dá)到所需pH范圍。若偏堿，則用lmol/LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。pH的調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前。應(yīng)注意pH值不要調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。4．過濾液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾，以利培養(yǎng)的觀察。但是供一般使用的培養(yǎng)基，這步可省略。5．分裝按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi)。分裝時(shí)可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的l/5，滅菌后制成斜面。分裝入三角瓶內(nèi)以不超過其容積的一半為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。6．加棉塞試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作的棉塞。棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用。要使棉塞總長約3/5塞入試管口或瓶口內(nèi)，以防棉塞脫落。有些微生物需要更好的通氣，則可用8層紗布制成通氣塞。有時(shí)也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。7．包扎加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報(bào)紙，以防滅菌時(shí)冷凝水沾濕棉塞。若培養(yǎng)基分裝于試管中，則應(yīng)以5支或7支在一起，再于棉塞外包一層牛皮紙，用繩扎好。然后用記號(hào)筆注明、培養(yǎng)基名稱、組別、日期。8．滅菌將上述培養(yǎng)基于121.3℃濕熱滅菌20min。如因特殊情況不能及時(shí)滅菌，則應(yīng)故人冰箱內(nèi)暫存。9．?dāng)[斜面滅菌后，如制斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長木條上，并調(diào)整斜度，便斜面的長度不超過試管總長的1/2。10．無菌檢查將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃溫箱中培養(yǎng)24～48h，無菌生長即可使用，或貯存于冰箱或清潔的櫥內(nèi)，備用。（二）高氏l號(hào)培養(yǎng)基的配制高氏1號(hào)培養(yǎng)基是用于分離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，瓊脂15～20g，水1000mL，pH7.4～7.6。l．稱量和溶解先計(jì)算后稱量，按用量先稱取可溶性淀粉，放入小燒杯中，并用少量冷水將其調(diào)成糊狀，再加至少于所需水量的水，繼續(xù)加熱，邊加熱邊攪拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。對(duì)微量成分FeSO4·7H2O可先配成高濃度的貯備液后再加入，方法是先在1000mL中加入1g的FeSO4·7H2O，配成濃度為0.01g/mL的貯備液，再在1000mL培養(yǎng)基中加入以上貯備液1mL即可。待所有藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。如要配制固體培養(yǎng)基，其瓊脂溶解過程同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。2．pH調(diào)節(jié)、分裝、包扎及無菌檢查同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。（三）馬丁氏培養(yǎng)基的配制馬丁氏培養(yǎng)基是用于分離真菌的選擇培養(yǎng)基。其配方如下：K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖l0g，瓊脂15～20g，水1000mL，自然pH。1．稱量和溶解先計(jì)算后稱量，按用量稱取各成分，并將其溶解在少于所需的水中。待各成分完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需體積。再將孟加拉紅配成1%的水溶液，在1000mL培養(yǎng)液中加入以上孟加拉紅溶液3.3mL，混勻后，加入瓊脂加熱融化，方法同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。2．分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同牛肉膏蛋白膝培養(yǎng)基配制。3．鏈霉素的加入鏈霉素受熱容易分解，所以臨用時(shí)，將培養(yǎng)基融化后待溫度降至45℃左右時(shí)才能加入?？上葘㈡溍顾嘏涑?%的溶液(配好的鏈霉素溶液保存于-20℃)，在100mL培養(yǎng)基中加1%鏈霉素0.3mL，使每毫升培養(yǎng)基中合鏈霉素30μg。四、注意事項(xiàng)稱藥品用的牛角匙不要混用，稱完藥品應(yīng)及時(shí)蓋緊瓶蓋。調(diào)pH時(shí)要小心操作，避免回調(diào)。不同培養(yǎng)基各有配制特點(diǎn)，要注意具體操作。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告記錄本實(shí)驗(yàn)配制培養(yǎng)基的名稱、數(shù)量，并圖解說明其配制過程，指明要點(diǎn)。六、問題和思考l．配制培養(yǎng)基有哪幾個(gè)步驟?在操作過程中應(yīng)注意些什么問題?為什么?2．培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌?若不能及時(shí)滅菌應(yīng)如何處理?已滅菌的培養(yǎng)基如何進(jìn)行無菌檢查?3．試設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)飲料進(jìn)行無菌檢查。

實(shí)驗(yàn)2消毒與滅菌

一、干熱滅菌（一）目的要求1．了解干熱滅菌的原理和應(yīng)用范圍。2．學(xué)習(xí)干熱滅菌的操作技術(shù)。（二）基本原理干熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白

圖2—2A臥式滅菌鍋

圖2—2B手提式滅菌鍋1.安全閥;2.壓力表;3.放氣閥;4.軟管;5.緊固螺栓;6.滅菌桶;7.篩架;8.水（三）器材牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿(6套一包)，手提式高壓蒸氣滅菌鍋等。（四）操作步驟1．首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。切勿忘記加水，同時(shí)水量不可過少，以防滅菌鍋燒干而引起炸裂事故。2．放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸氣流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與鍋壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。3．加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對(duì)稱的方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。4．用電爐或煤氣加熱，并同時(shí)打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸氣壓力增加到逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，控制熱源，維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)用0.1Mpa，121.5℃，20min滅菌。滅菌的主要因素是溫度而不是壓力。因此鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡后，才能關(guān)上排氣閥，維持所需壓力。5．滅菌所需時(shí)間到后，切斷電源或關(guān)閉煤氣，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至“0”時(shí)，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。壓力一定要降到“0”時(shí)，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染，甚至灼傷操作者。6．將取出的滅菌培養(yǎng)基，需擺斜面的則擺成斜面，然后放入37℃溫箱培養(yǎng)24h，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可待用。（五）實(shí)驗(yàn)報(bào)告l．結(jié)果檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底。2．思考題（1）高壓蒸氣滅菌開始之前，為什么要將鍋內(nèi)冷空氣排盡?滅菌完畢后，為什么待壓力降低“0”時(shí)才能打開排氣閥，開蓋取物？（2）在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時(shí)，怎樣杜絕一切不安全的因素?（3）滅菌在微生物實(shí)驗(yàn)操作中有何重要意義?（4）黑曲霉的孢子與芽孢桿菌的孢子對(duì)熱的抗性哪個(gè)最強(qiáng)?為什么?三、紫外線滅菌（一）目的要求了解紫外線滅菌的原理和方法（二）基本原理紫外線滅菌是用紫外線燈進(jìn)行的。波長為200~300nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260nm的殺菌力最強(qiáng)。在波長一定的條件下，紫外線的殺菌效率與強(qiáng)度和時(shí)間的乘積成正比。紫外線殺菌機(jī)理主要是因?yàn)樗T導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA鏈的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復(fù)制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成[O]，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成過氧化氫（H2O2）。O3和H2O2均有殺菌作用。紫外線穿透力不大，所以，只適用于無菌室，接種箱，手術(shù)室內(nèi)的空氣及物體表面的滅菌。紫外線燈距照射物以不超過1.2m為宜。此外，為了加強(qiáng)紫外線滅菌效果，在打開紫外燈以前；可在無菌室內(nèi)(或接種箱內(nèi))噴灑3%～5%石炭酸溶液，一方面使空氣中附著有微生物的塵埃降落，另一方面也可以殺死一部分細(xì)菌。無菌室內(nèi)的桌面、凳子可用2%～3%的來蘇爾擦洗，然后再開紫外燈照射，即可增強(qiáng)殺菌效果，達(dá)到滅菌目的。（三）器材1．培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨平板。2．溶液或試劑3%~5%石炭酸或2%~3%來蘇爾溶液。3．儀器或其他用具紫外線燈。（四）操作步驟l．單用紫外線照射（1）在無菌室內(nèi)或在接種箱內(nèi)打開紫外線燈開關(guān)，照射30min，將開關(guān)關(guān)閉。（2）將牛肉膏蛋白胨平板蓋打開15min，然后蓋上皿蓋。置37℃培養(yǎng)24h。共做三套。（3）檢查每個(gè)平板上生長的菌落數(shù)。如果不超過4個(gè)，說明滅菌效果良好，否則，需延長照射時(shí)間或同時(shí)加強(qiáng)其他措施。2．化學(xué)消毒劑與紫外線照射結(jié)合使用（1）在無菌室內(nèi)，先噴灑3%～5%的石炭酸溶液，再用紫外線燈照射15imn。（2）無菌室內(nèi)的桌面，凳子用2%～3%來蘇爾擦洗，再打開紫外線燈照射15min。（3）檢查滅菌效果[方法同“單用紫外線照射”(3)]。因紫外線對(duì)眼結(jié)膜及視神經(jīng)有損傷作用，對(duì)皮膚有刺激作用，故不能直視紫外線燈光下工作。（五）實(shí)驗(yàn)報(bào)告1．結(jié)果記錄兩種滅菌效果于下表中處理方法平板菌落數(shù)123滅菌效果比較紫外線照射3%～5%石炭酸+紫外線照射

2%～3%來蘇爾+紫外線照射

2．思考題。（1）細(xì)菌營養(yǎng)體細(xì)胞和細(xì)菌芽孢對(duì)紫外線和的抵抗力會(huì)一樣嗎，為什么？（2）你知道紫外線燈管是用什么玻璃制作的？為什么不用普通燈用玻璃？（3）在紫外燈下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，為什么要隔一塊普通玻璃？四微孔濾膜過濾除菌（一）目的要求1．了解過濾除菌的原理。2．掌握微孔濾膜過濾除菌的方法。（二）基本原理過濾除菌是通過機(jī)械作用濾去液體或氣體中細(xì)菌的方法。根據(jù)不同的需要選用不同的濾器和濾板材料。微孔濾膜過濾器是由上下二個(gè)分別具有出口和入口連接裝置的塑料蓋盒組成，出口處可連接針頭，人口處可連接針筒，使用時(shí)將濾膜裝入兩塑料蓋盒之間，旋緊蓋盒，當(dāng)溶液從針筒注入濾器時(shí)，此濾器將各種微生物阻留在微孔濾膜上面，從而達(dá)到除菌的目的。根據(jù)待除菌溶液量的多少，可選用不同大小的濾器。此法除菌的最大優(yōu)點(diǎn)是可以不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學(xué)成分，但由于濾量有限，所以一般只適用于實(shí)驗(yàn)室中小量溶液的過濾除菌。（三）器材1．培養(yǎng)基2%的葡萄糖溶液，肉湯蛋白胨平板。2．儀器或其他用具注射器，微孔濾膜過濾器，0.22μm濾膜，無菌試管，鑷子，玻璃刮棒。（四）操作步驟l．組裝、滅菌將0.22μm孔徑的濾膜裝入清洗干凈的塑料濾器中，旋緊壓平，包裝滅菌后待用(0.lMPa，121.5℃滅菌20min)。2．連接將滅菌濾器的入口在無菌條件下，以無菌操作方式連接于裝有待濾溶液（2%葡萄糖溶液）的注射器上，將針頭與出口處連接并插入帶橡皮塞的無菌試管中。見圖2—3。3．壓濾將注射器中的待濾溶液加壓緩緩擠入過濾到無菌試管中，濾畢，將針頭撥出。壓濾時(shí)，用力要適當(dāng)，不可太猛太快，以免細(xì)菌被擠壓通過淀膠．4．無菌檢查無菌操作吸取除菌濾液0.1ml于肉湯蛋白胨平板上，涂布均勻，置37℃溫室中培養(yǎng)24h，檢查是否有菌生長。5．清洗棄去塑料濾器上的微孔濾膜，將塑料濾器清洗干凈，并換上一張新的微孔濾膜，組裝包扎，再經(jīng)無菌后使用。整個(gè)過程應(yīng)在無菌條件下嚴(yán)格無菌操作，以防污染，過濾時(shí)應(yīng)避免各連接處出現(xiàn)滲漏現(xiàn)象。（五）實(shí)驗(yàn)報(bào)告l．結(jié)果記錄無菌檢查結(jié)果2．思考題(1)你做的過濾除菌實(shí)驗(yàn)效果如何?如果經(jīng)培養(yǎng)檢查有雜菌生長，你認(rèn)為是什么原因造成的?(2)如果你需要配制一種含有某抗生素的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，其抗生素的終濃度(或工作濃度)為50μg/ml，你將如何操作?(3)過濾除菌應(yīng)注意哪些問題?

實(shí)驗(yàn)3土壤的稀釋分離、純化微生物及無菌操作技術(shù)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：學(xué)習(xí)從土壤中分離微生物的方法，學(xué)習(xí)無菌操作技術(shù)。內(nèi)容：l．用稀釋法分離細(xì)菌、放線菌和霉菌。2．用平板劃線方法分離微生物。3．學(xué)習(xí)斜面接種及穿刺接種等無菌操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和普通變形菌(Proteusvulgaris)斜面菌種。已滅菌的牛肉膏、高氏1號(hào)、土豆蔗糖固體培養(yǎng)基各1瓶，49.5mL無菌水(帶玻璃珠)1瓶，4.5mL無菌水6管，80%乳酸，10%酚液，95%乙醇。無菌培養(yǎng)皿12套，1mL無菌移液管10支，土壤樣品及天平、稱量紙、藥勺、試管架、玻璃鉛筆、橡皮頭(用75%乙醇浸泡)、玻璃刮。三、操作步驟(一)土壤稀釋分離1．取土壤取表層以下5—10cm處的土樣，放入無菌的袋中備用，或放在4℃冰箱中暫存。2．制備稀釋液(要無菌操作)(1)制備土壤懸液：稱土樣0.5g，迅速倒入帶玻璃珠的49.5mL無菌水瓶中(玻璃珠用量以充滿瓶底力最好)，振蕩5～10min，使土樣充分打散，即成為10-2的土壤懸液。(2)稀釋：用無菌移液管吸10-2的土壤懸液0.5mL，放入4.5mL無菌水中即為10-3稀釋液，如此重復(fù)，可依次制成10-3～10-8的稀釋液(圖3-1)。注意：操作時(shí)管尖不能接觸液面，每一個(gè)稀釋度換用一支移液管，每次吸入土液后，要將移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以減少稀釋中的誤差。

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圖3—1稀釋法分離土壤微生物操作過程圖解3.混菌法測(cè)定菌落數(shù)的方法(1)細(xì)菌：取10-7、10-6兩管稀釋液各1mL，分別接人相應(yīng)標(biāo)號(hào)的平皿中，每個(gè)稀釋度接兩個(gè)平皿。然后取冷卻至50℃的牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基，分別倒入以上培養(yǎng)皿中(裝量以鋪滿皿底高1.5～2mm為宜)，迅速輕輕搖動(dòng)平皿，使菌液與培養(yǎng)基充分混勻，但不沾濕皿的邊緣，待瓊脂凝固即成細(xì)菌平板。倒平板時(shí)要注意無菌操作，見圖3-2。

圖3—2倒平板的方法（2）放線菌：取10-5、10-4兩管稀釋液，在每管中加入10%酚液5～6滴，搖勻，靜置片刻，然后分別從兩管中吸出1mL加入相應(yīng)標(biāo)號(hào)的平皿中，選用高氏1號(hào)培養(yǎng)基，用與細(xì)菌相同的方法倒入平皿中，便可制成放線菌平板。（3）霉菌：取10-2、10-3兩管稀釋各1mL，分別接入相應(yīng)標(biāo)號(hào)的平皿中，每個(gè)稀釋度接兩個(gè)平皿。在融化的土豆蔗糖培養(yǎng)基中，每100mL加入滅菌的乳酸1mL，輕輕搖勻，然后用與細(xì)菌相同的方法倒入平皿中，便可制成霉菌的平板。4．培養(yǎng)將接種好的細(xì)菌、放線菌、霉菌平板倒置，即皿蓋朝下放置，于28～30℃中恒溫培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)1～2d，放線菌培養(yǎng)5～7d，霉菌培養(yǎng)3～5d。觀察生長的菌落，用于進(jìn)一步純化分離或直接轉(zhuǎn)接斜面。（二）平板制作及劃線分離方法。1．倒平板按無菌操作要求，在火焰旁操作（圖3—2），做法如3（1）。2．劃線分離使用接種環(huán)，從待純化的菌落或待分離的斜面菌種只沾取少量菌樣，在相應(yīng)培養(yǎng)基平板中劃線分離，劃線的方法多樣，目的是獲得單個(gè)菌落，主要方法參見圖3—3。

圖3—3平板劃線方法示意圖A.劃線分離操作;B.用于稀釋液中,可連接劃線;C.用于較濃的菌樣,分?jǐn)?shù)次劃線,每次劃線后要燒接種環(huán),然后再劃下一區(qū)。3．培養(yǎng)方法同“土壤稀釋分離”。（三）斜面接種和穿刺接種1．斜面接種（1）取新鮮固體斜面培養(yǎng)基，分別做好標(biāo)記（寫上菌名、接種日期、接種人等），然后用無菌操作方法，把待接菌種接入以上新鮮培養(yǎng)基斜面上。（2）接種的方法是，用接種環(huán)沾取少量待接菌種，然后在新鮮斜面上“之”字形劃線，方向是從下部開始，一直劃至上部（圖3—4A）。注意劃線要輕，不可把培養(yǎng)基劃破。

圖3—4斜面接種（A）及穿刺接種（B）示意圖（3）接種后30℃恒溫培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)48h，放線菌、霉菌培養(yǎng)至孢子成熟方可取出保存。2．穿刺接種（1）取兩支新鮮半固體牛肉膏蛋白胨柱狀培養(yǎng)基，做好標(biāo)記（寫上菌名）、接種日期，接種人等）。（2）接種的方法是，用接種針沾取少量待接菌種，然后從柱狀培養(yǎng)基的中心穿入其底部（但不要穿透），然后沿原刺入路線抽出接種針，注意接種針不要移動(dòng)。（3）接種后30℃恒溫培養(yǎng)，24h后觀察，比較兩種菌的生長結(jié)果。四、注意事項(xiàng)1．一般土壤中，細(xì)菌最多，放線菌及霉菌次之，而酵母菌主要見于果園及菜園土壤中，故從土壤中分離細(xì)菌時(shí)，要取較高的稀釋度，否則菌落連成一片不能計(jì)數(shù)。2．在土壤稀釋分離操作中，每稀釋10倍，最好更換一次移液管，使計(jì)數(shù)準(zhǔn)確。3．放線菌的培養(yǎng)時(shí)間較長，故制平板的培養(yǎng)基用量可適當(dāng)增多。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1．記錄土壤稀釋分離結(jié)果，并計(jì)算出每克土壤中的細(xì)菌、放線菌和霉菌的數(shù)量。計(jì)算方法：選擇長出菌落數(shù)30～300之間的培養(yǎng)皿進(jìn)行計(jì)數(shù)，按以下公式：總菌數(shù)/g=同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)2．分別記錄平板劃線、斜面接種的結(jié)果，并自我評(píng)價(jià)。3．比較兩種細(xì)菌穿刺接種的結(jié)果，并進(jìn)行分析。七、問題和思考1．在測(cè)定土壤微生物含量中，除混菌法外還可用什么方法?2．試設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，從土壤中分離出酵母菌，并進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)4微生物菌落的觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：識(shí)別細(xì)菌、酵母菌、放線菌和霉菌四大類微生物的菌落特征。內(nèi)容：1．觀察已知菌的菌落的形態(tài)、大小、色澤、透明度、致密度和邊緣等特征。2．根據(jù)菌落的形態(tài)特征判斷未知菌的類別。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粘紅酵母(Rhodotorulagracitis)、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)、細(xì)黃鏈霉菌(Streptomycesmicroflavus，又稱“5406”抗生菌)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)、球孢白伍菌(Beauveriabassiana)等細(xì)菌的斜面菌種。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基、高氏1號(hào)培養(yǎng)基、無菌水。接種環(huán)、接種針、酒精燈、無菌培養(yǎng)皿多套、電熱恒溫箱。三、操作步驟(一)制備已知菌的單菌落1．制備平板將已融化的無菌培養(yǎng)基待冷卻至50℃左右，分別制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基平板和高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板各一皿。2．制備菌懸液或孢子懸液在培養(yǎng)好的斜面菌種管內(nèi)加入5mL無菌水，制成菌懸液后備用。3．制備單菌落通過平板劃線法獲得細(xì)菌、酵母菌和放線菌的單菌落。用三點(diǎn)接種法獲得霉菌的單菌落。細(xì)菌于37℃恒溫培養(yǎng)24～48h，酵母菌于28℃培養(yǎng)2～3d，霉菌和放線菌置28℃培養(yǎng)5～7d，待長成菌落后，仔細(xì)觀察四大類微生物菌落的形態(tài)特征，并將觀察結(jié)果記錄于表4-1中。(二)制備未知菌落l．倒平板2．接種可用彈土法接種，其要點(diǎn)為：采集校園土壤，待風(fēng)干磨碎后，可將細(xì)土撒在無菌的硬板紙表面，先彈去紙面浮土，然后打開皿蓋，便含土的紙面對(duì)著平板培養(yǎng)基的表面，用手指在硬板紙背面輕輕一彈即可接種上各種微生物。3．培養(yǎng)將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)2～3d，將馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基倒置于28℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)3～5d，即可獲得未知菌的單菌落。4．編號(hào)從培養(yǎng)好的未知平板中，挑選8個(gè)不同的單菌落，逐個(gè)編號(hào)，根據(jù)菌落識(shí)別要點(diǎn)區(qū)分未知菌落類群，并將判斷結(jié)果填入表4～2中。(三)直接觀察菌落直接用實(shí)驗(yàn)3中的“土壤稀釋分離”獲得的單菌落進(jìn)行觀察識(shí)別，并將結(jié)果填入表4-2中。四、注意事項(xiàng)觀察菌落特點(diǎn)時(shí)，要選擇分離得很開的單個(gè)較大菌落；已知菌落和未知菌落要編好號(hào)，請(qǐng)勿隨意移動(dòng)開蓋，以免搞混菌號(hào)。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1．已知菌落的形態(tài)特征記錄于表4～1中。2．將未知菌落的辨別結(jié)果記錄于表4～2中。七、問題和思考1．試比較細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌菌落形態(tài)的差異?2．設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室空氣環(huán)境中的微生物類別?表4—1已知菌菌落的形態(tài)微類生物數(shù)菌名辯別要點(diǎn)菌落描述濕干表面邊緣隆起形狀顏色透明度厚薄大小松密大小正面反面水溶性色素細(xì)菌大腸桿菌

金黃色葡萄球菌

枯草桿菌

酵母菌釀酒酵母

粘紅酵母

熱帶假絲酵母

放線菌細(xì)黃鏈霉菌

灰色鏈霉菌

霉菌產(chǎn)黃青霉

黑曲霉

球孢白僵菌

表4—2未知菌菌落的形態(tài)菌落號(hào)濕干菌落描述判斷結(jié)果厚薄大小松密大小表面邊緣隆起形狀顏色正面反面水溶性色素透明度121

2

3

4

5

6

7

8

注：四大類微生物菌落的識(shí)別要點(diǎn)如下：

菌落濕潤：正反面顏色一致小大而扁平…………小而扁平……細(xì)菌大大而扁平……大而隆起……酵母菌

干燥，正反面，中央與邊緣顏色不一致小小而致密大大而致密……霉菌大而疏松……

實(shí)驗(yàn)5顯微鏡油浸系物鏡的使用

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：復(fù)習(xí)顯微鏡低倍鏡和高倍鏡的使用技術(shù)，了解油浸系物鏡的基本原理，掌握油浸系物鏡的使用方法。內(nèi)容：1．學(xué)習(xí)油浸系物鏡的使用方法。2．用油鏡觀察枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌染色裝片。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具枯草芽孢桿菌(Bacillussubitilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的染色裝片。香柏油、二甲苯、顯微鏡、擦鏡紙。三、操作步驟(一)觀察前的準(zhǔn)備1．將顯微鏡置于平穩(wěn)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，鏡座距實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊沿約為4cm。坐正，練習(xí)用左眼觀察。2．調(diào)節(jié)光源：將低倍物鏡轉(zhuǎn)到工作位置，把光圈完全打開，聚光器升至與載物臺(tái)相距約1mm左右。轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡采集光源，光線較強(qiáng)的天然光源宜用平面鏡，光線較弱的天然光源或人工光源宜用凹面鏡，對(duì)光至視野內(nèi)均勻明亮為止。觀察染色裝片時(shí)，光線宜強(qiáng)；觀察末染色裝片時(shí)，光線不宜太強(qiáng)。(二)低倍鏡觀察染色裝片首先上升鏡簡(jiǎn)，將枯草芽孢桿菌染色裝片置于載物臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，將觀察位置移至物鏡正下方，物鏡降至距裝片0.5cm處，適當(dāng)縮小光圈然后兩眼從目鏡觀察，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器使物鏡逐漸上升(或使鏡臺(tái)下降)至發(fā)現(xiàn)物像時(shí)，改用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物像清楚為止。移動(dòng)裝片，把合適的觀察部位移至視野中心。(三)高倍鏡觀察眼睛離開目鏡從側(cè)面觀察，旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換器，將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，注意避免鏡頭與玻片相懂。再由目鏡觀察，仔細(xì)調(diào)節(jié)光圈，使光線的明亮度適宜。用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距使物鏡清晰為止。將最適宜觀察部位移至視野中心，繪圖。不要移動(dòng)裝片位置，準(zhǔn)備用油鏡觀察。(四)油鏡觀察1．提起鏡筒約2cm，將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。在玻片標(biāo)本的鏡檢部位(鏡頭的正下方)滴一滴香柏油。2．從側(cè)面注視，小心慢慢降下鏡筒，使油鏡浸在油中至油圈不擴(kuò)大為止，鏡頭幾乎與裝片接觸，但不可壓及裝片，以免壓碎玻片，損壞鏡頭。3．將光線調(diào)亮，左眼從目鏡觀察，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升(切忌反方向旋轉(zhuǎn))，當(dāng)視野中有物像出現(xiàn)時(shí)，再用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距。如因鏡頭下降未到位或鏡頭上升太快末找到物像，必須再從側(cè)面觀察，將油鏡降下，重復(fù)操作直至物像看清為止。仔細(xì)觀察并繪圖。4．再次觀察提起鏡筒，換上金黃色葡萄球菌染色裝片，依次用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察，繪圖。重復(fù)觀察時(shí)可比第一次少加香柏油。(五)鏡檢完畢后的工作1．移開物鏡鏡頭。2．取出裝片。3．清潔油鏡，油鏡使用完畢后，須用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，再用擦鏡紙沾少許二甲苯擦掉殘留的香柏油，最后再用干凈的擦鏡紙擦干殘留的二甲苯。4．擦凈顯微鏡，將各部分還原。將接物鏡呈“八”字形降下，不可使其正對(duì)聚光器，同時(shí)降下聚光器，轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡使其鏡面垂直于鏡座。最后套上鏡罩，對(duì)號(hào)放入鏡箱中，置陰涼干燥處存放。四、注意事項(xiàng)1．使用油鏡必須按先用低倍鏡和高倍鏡觀察，再用油鏡觀察2．下降鏡頭時(shí)，一定要從側(cè)面注視，切忌用眼睛對(duì)著目鏡，邊觀察邊下降鏡頭的錯(cuò)誤操作，以免壓碎玻片而損壞鏡頭。3．使用二甲苯擦鏡頭時(shí)，注意二甲苯不能過多，以防溶解固定透鏡的樹脂。4．注意保持顯微鏡的潔凈，對(duì)金屬部分要用軟布擦拭，擦鏡頭必須用擦鏡紙，切勿用手或用普通布、紙等，以免損壞鏡頭。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告分別繪出在高倍鏡和油鏡下觀察到的枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌的形態(tài)，注明物鏡放大倍數(shù)和總放大率。六、問題和思考1．用油鏡便于觀察細(xì)菌的依據(jù)是什么？2．使用油鏡應(yīng)特別注意哪些問題？3．當(dāng)物鏡從低倍鏡轉(zhuǎn)到高倍鏡和油鏡時(shí)，對(duì)照明度有何要求？應(yīng)如何調(diào)節(jié)？油鏡的基本原理（一）油鏡頭的辨認(rèn)油鏡頭上常刻有OI(oilimmersion)或HI（homogeneneousimmersion）字樣，有的還刻有一圈紅線或黑線標(biāo)記，在低倍物鏡、高倍物鏡和油鏡3物鏡中，油鏡的放大倍數(shù)和數(shù)值孔徑（numericalaperture）最大，而工作距離最短（圖5—1）

圖5—1顯微鏡物鏡參數(shù)示意圖（二）顯微鏡的分辨率顯微鏡性能的優(yōu)劣不單是看它的總放大倍數(shù)，更重要的是看它分辯率的大小。分辨率是指顯微鏡能分辨出物體兩點(diǎn)間最小距離（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值與光線的波長（λ）成正比，與物鏡的數(shù)值孔徑（NA）成反比。

從上式可看出，縮短光波長和增大數(shù)值孔徑都可提高分辨率。數(shù)值孔徑指光線投射到物鏡上的最大角度（稱鏡口角，α）的一半正弦與介質(zhì)折射率（n）的乘積；

影響數(shù)值孔徑大小的因數(shù)，一是鏡口角，二是介質(zhì)的折射率。當(dāng)鏡與裝片之間的介質(zhì)為空氣時(shí)，由于空氣（n=1.52）的折射率不同，光線會(huì)發(fā)生折射，不僅使進(jìn)入物鏡的光線減少，降低了視野的照明度，而且會(huì)減少鏡口角（圖5—2A）。當(dāng)以香柏油（n=1.515）為介質(zhì)時(shí)，由于它的折射率與玻璃相近，光線經(jīng)過載玻片后可直接通過香柏油進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射（圖5—2B），不僅增加了視野的照明度，更重要的是通過增加數(shù)值孔徑達(dá)到提高分辨率的目的?？梢姽獾牟ㄩL平均為0.55μm。當(dāng)使用數(shù)值孔徑為0.65的高倍鏡時(shí)，它能辨別兩點(diǎn)之間的距離為0.42μm；而使用數(shù)值孔徑為1.25的油鏡時(shí)，能辨別兩點(diǎn)之間的距離則為0.22μm。

圖5—2介質(zhì)為空氣（A）與介質(zhì)為香柏油（B）時(shí)光線通過的比較

實(shí)驗(yàn)6細(xì)菌形態(tài)的觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：鞏固油鏡的使用；掌握細(xì)菌形態(tài)觀察的基本方法，了解細(xì)菌的基本形態(tài)。內(nèi)容：1．觀察細(xì)菌的基本形態(tài)染色裝片。2．觀察枯草芽孢桿菌活菌。3．觀察細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的染色裝片。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具溶血鏈球菌(Streptococcushaemolyticus)、棒桿菌(Corymebacterium)、螺菌(Spirillum)、浮游球衣菌(Sphaerotilusnatans)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、普通變形菌(Proteusvulgaris)、丙酮丁醇梭菌(Clostridumacetotylicum)、褐球固氮菌(Azotobacterchroococcum)等細(xì)菌的染色裝片，枯草芽泡桿菌(Bacillussubis)的斜面菌種。香柏油、二甲苯、無菌水；顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、蓋玻片、吸水紙、小滴管。三、操作步驟(一)觀察細(xì)菌的基本形態(tài)用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察溶血鏈球菌、棒桿菌、螺菌、浮游球衣菌的染色裝片，并分別在油鏡下繪圖。(二)觀察細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察巨大芽孢桿菌(示細(xì)胞壁)、巨大芽孢桿菌(示異染粒)、蘇云金芽孢桿菌(示伴胞晶體)、普通變形菌(示鞭毛)、丙酮丁醇梭菌(示芽孢)、褐球固氮菌(示莢膜)等細(xì)菌的染色裝片，并分別在油鏡下繪圖。(三)觀察枯草桿菌活菌，常用壓滴法觀察。1．將潔凈無油膩的載片放于自己右邊前方，在中央放一小滴無菌水。2．將酒精燈放于自己正前方，點(diǎn)燃。3．用無菌操作方法從枯草芽孢桿菌斜面中沾取少量菌體，與載片上的水滴充分混勻，把接種環(huán)上殘留的菌體殺滅后，放回試管架。4．用鑷子夾一潔凈的蓋玻片，使其一邊先接觸菌液，然后將整個(gè)蓋玻片慢慢放下，注意不要產(chǎn)生氣泡。如菌液過多，可用吸水紙適當(dāng)吸去一部分。5．先用低倍鏡然后轉(zhuǎn)用高倍鏡觀察，觀察時(shí)光線要適當(dāng)調(diào)暗些。四、注意事項(xiàng)1．注意擦鏡頭時(shí)，只能用擦鏡紙。2，觀察完畢，必須將鏡筒上升，才能取下裝片，放入另一裝片后，要按使用油鏡要求，重新操作，不能在油鏡下直接取下和替換裝片，切記！3．無菌操作過程中，接種環(huán)滅菌后不能觸及其他物品，挑菌不能過多。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告(一)繪圖l．給出你所觀察到的幾種細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)視野圖。2．給出你所觀察到的細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)視野圖，并注明各部分。(二)試指出在制備活菌裝片時(shí)，應(yīng)注意什么問題?七、問題和思考1．用明視野顯微鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)時(shí)，你認(rèn)為用染色裝片好，還是用非染色的活體裝片好，為什么?觀察活體裝片與染色裝片，光線調(diào)節(jié)各有什么不同?2．無菌操作過程中，可否將棉塞放在桌面上?為什么?3試設(shè)計(jì)一個(gè)準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)的工作方案。

實(shí)驗(yàn)7細(xì)菌單染色法及口腔微生物的觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：鞏固無菌操作技術(shù)，掌握細(xì)菌的涂片和單染色技術(shù)，了解口腔中的微生物及其觀察方法。內(nèi)容：1.學(xué)習(xí)細(xì)菌單染色操作技術(shù)。2.用單染色法或負(fù)染色法觀察口腔中的微生物。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylocosccusaureus)的斜面菌種。呂氏美藍(lán)染色液、石炭酸復(fù)紅染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、無菌水；顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、吸水紙、無菌牙簽。三、操作步驟(一)單染色法1．涂片在潔凈無脂的載玻片中央滴一小滴無菌水，用無菌操作方法從菌種斜面挑取少量菌體與水滴充分混勻，涂成薄膜，涂布面積約1～1.5cm2(圖7—1A、B)。2．干燥將涂片于室溫中自然干燥。3．固定手扶載片一端，使涂菌的一面向上，將載片通過微火2～3次。在火上固定時(shí)，用手摸涂片反面，以不燙手為宜。不能將載片在火上烤，否則細(xì)菌形態(tài)毀壞(圖7—1C)。4．染色將涂片置于水平位置，滴加染色液覆蓋于涂菌處，染色約2min（圖7—1D）5．水洗傾去染色液，斜置載片，用自來水的細(xì)水流由載片上端流下，不得直接沖在涂菌處，直洗至從載片上流下的水中無染色液的顏色為止（圖7—1E）。6．干燥自然晾干或用吸水紙輕輕地吸干，注意不要擦掉菌體（圖7—1F）。7．待標(biāo)本完全干燥后，先用低倍鏡和高倍鏡觀察，將典型部位移至視野中央，再用油鏡觀察。

圖7—1單染色的方法(二)口腔微生物的觀察1．單染色法(1)在潔凈無油膩的載片中央滴一小滴無菌水，用牙簽取牙垢少許與水滴充分混勻，涂成薄膜。(2)將涂片于室溫中自然干燥后，按上面單染色法的步驟，進(jìn)行固定、染色、水洗，干燥后鏡檢。2．負(fù)染色法(1)在潔凈無油膩的載片的一端滴一小滴無菌水，用牙簽取牙垢少許與水滴充分混勻，然后加少許黑色素溶液，充分混勻。(2)另取一載片將其邊緣放在含菌載片的一端，然后推向另一端，則含菌載片上的混合液被推成薄膜。(3)于室溫中自然干燥。(4)鏡檢：將光線調(diào)亮，先用低倍鏡觀察，再用高倍鏡觀察。四、注意事項(xiàng)載玻片要潔凈無脂，否則菌液涂不開。涂片時(shí)，滴水不要過多，挑菌量宜少，菌膜宜薄。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告(一)繪圖1．單染色后觀察到的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的形態(tài)圖。2．你所觀察到的口腔微生物的形態(tài)圖，并注明使用的染色方法，菌體和背景的顏色。(二)單染色法和負(fù)染色法操作要點(diǎn)。七、問題和思考1．涂片在染色前為什么要先進(jìn)行固定?固定時(shí)應(yīng)注意什么問題?2．制備染色裝片時(shí)應(yīng)注意哪些事項(xiàng)，為什么?制片為什么要完全干燥后才能用油鏡觀察?3．你知道口腔中通常存在哪些微生物嗎?如何進(jìn)行區(qū)分?

實(shí)驗(yàn)8細(xì)菌的革蘭氏染色

目的：初步掌握細(xì)菌涂片方法及革蘭氏染色法步驟。內(nèi)容：1．制作細(xì)菌染色裝片。2．進(jìn)行革蘭氏染色法操作。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具蘇云金桿菌或金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(E.coli)菌液，待測(cè)菌菌液1～2種。革蘭氏染色液(結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸復(fù)紅液等)、香柏油、二甲苯；顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、吸水紙、試管、小滴管、酒精燈。三、操作步驟(一)制片1．涂菌用無菌操作方法從試管中沾取菌液一環(huán)，用接種環(huán)在潔凈無脂的載玻片上做一薄而均勻、直徑約lcm的菌膜。涂菌后將接種環(huán)火焰滅菌。2．干燥于空氣中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加溫加速干燥(溫度不宜過高)。3．固定目的是殺死細(xì)菌并使細(xì)菌粘附在玻片上，便于染料著色，常用加熱法，即將細(xì)菌涂片膜向上，通過火焰3次，以熱而不燙為宜，防止菌體燒焦、變形。此制片可用于染色。(二)染色l．初染于制片上滴加結(jié)晶紫染液，染lmin后，用水洗去剩余染料。2．媒染滴加盧戈氏碘液，lmin后水洗。3．脫色滴加95%乙醇脫色，搖動(dòng)玻片至紫色不再為乙醇脫退為止(根據(jù)涂片之厚薄需時(shí)30s至lmin)，水洗。4．復(fù)染滴加石炭酸復(fù)紅液復(fù)染lmin，水洗。5．濾紙吸干，油鏡鏡檢。(三)結(jié)果革蘭氏陽性菌染成藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌染成淡紅色。(四)檢測(cè)未知菌用以上方法對(duì)未知菌進(jìn)行革蘭氏染色，并繪圖、記錄染色結(jié)果。四、注意事項(xiàng)1.涂片務(wù)求均勻，切忌過厚。2．在染色過程中，不可使染液干涸。3．脫色時(shí)間十分重要，過長，則脫色過度，會(huì)使陽性菌被染成陰性菌；脫色不夠，則會(huì)使陰性菌被染成陽性菌。4．老齡菌因體內(nèi)核酸減少，會(huì)便陽性菌被染成陰性菌，故不能選用。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)吉(一)繪圖1．大腸桿菌革蘭氏染色視野圖。2．金黃色葡萄球菌或蘇云金桿菌革蘭氏染色視野圖。(二)記錄革蘭氏染色法法步驟，并進(jìn)行結(jié)果分析。(三)未知菌的檢測(cè)結(jié)果。六、問題和思考1．涂片后為什么要進(jìn)行固定?固定時(shí)應(yīng)注意什么?2．什么是革蘭氏染色法?染色過程應(yīng)注意什么?3．試分析革蘭氏染色法在細(xì)菌分類中的意義。

實(shí)驗(yàn)9細(xì)菌鞭毛染色及其運(yùn)動(dòng)的觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：了解細(xì)菌鞭毛染色的原理，掌握鞭毛染色法；學(xué)習(xí)觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的方法。內(nèi)容：1.細(xì)菌的鞭毛染色法。2．用壓滴法觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)。3．用懸滴法觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具普通變形菌(Proteusvulgaris)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面、鞭毛染色液、0.01%美藍(lán)水溶液、香柏油、二甲苯、無菌水、凡士林；顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、凹載玻片、蓋玻片、鑷子、細(xì)玻棒、吸水紙。三、操作步驟(一)細(xì)菌鞭毛染色1．活化菌種將保存的變形菌在新制備的普通牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上連續(xù)移種2～3次，每次于30℃培養(yǎng)10～15h?；罨缶N備用。2．制片在干凈載玻片的一端滴一滴蒸餾水，用無菌操作法，以接種環(huán)從活化菌種中取少許菌苔(注意不要帶培養(yǎng)基)，在載玻片的水滴中輕沾幾下。將載玻片稍傾斜，使菌液隨水滴緩緩流到另一端，然后平放，于空氣中干燥。3．染色(1)滴加鞭毛染色液A液，染3～5min。(2)用蒸餾水充分洗凈A液，使背景清潔。(3)將殘水瀝干或用B液沖去殘水。(4)滴加B液，在微火上加熱使微冒蒸汽，并隨時(shí)補(bǔ)充染料以免干涸，染30～60S。(5)待冷卻后，用蒸餾水輕輕沖洗干凈，自然干燥或?yàn)V紙吸干。4．鏡檢先用低倍鏡和高倍鏡找到典型區(qū)域，然后用油鏡觀察。菌體為深褐色，鞭毛為褐色。注意觀察鞭毛著生位置(鏡檢時(shí)應(yīng)多找?guī)讉€(gè)視野，有時(shí)只在部分涂片上染出鞭毛)。(二)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的觀察1．壓滴法(1)制備菌液：從幼齡菌斜面上，挑數(shù)環(huán)菌放在裝有1～2mL無菌水的試管中，制成輕度混濁的菌懸液。(2)取2～3環(huán)稀釋菌液于潔凈載玻片中央，再加入一環(huán)0.01%的美藍(lán)水溶液，混勻。(3)用鑷子夾一潔凈的蓋玻片，先使其一邊接觸菌液，然后慢慢地放下蓋玻片，這樣可防止產(chǎn)生氣泡。(4)鏡檢：將光線適當(dāng)調(diào)暗，先用低倍鏡找到觀察部位，再用高倍鏡觀察。要區(qū)分細(xì)菌鞭毛運(yùn)動(dòng)和布朗運(yùn)動(dòng)，后者只是在原處左右擺動(dòng)，細(xì)菌細(xì)胞間有明顯位移者，才能判定為有運(yùn)動(dòng)性。2．懸滴法(1)取潔凈蓋玻片，在四周涂少許凡士林。(2)在蓋玻片中央滴一小滴菌液（圖9—1A）(3)將凹玻片的凹窩向下，使凹窩中心對(duì)準(zhǔn)蓋玻片中央的菌液(圖9-1B)，輕輕地蓋在蓋玻片上，便凹玻片與蓋玻片粘在一起(注意液滴不得與凹玻片接觸)。(4)小心將玻片翻轉(zhuǎn)過來，使菌液正好懸在窩的中央。再用火柴棒輕壓蓋玻片四周使封閉，以防菌液干燥。（5）鏡檢：將光線適當(dāng)調(diào)暗，先用低倍鏡找到懸滴的邊緣后(圖9—1D)，再將菌液移至視野中央，換用高倍鏡觀察，注意細(xì)菌是如何運(yùn)動(dòng)的，它與分子布朗運(yùn)動(dòng)的不同。

圖9—1懸滴標(biāo)本的制備

四、注意事項(xiàng)1．鞭毛染色液最好當(dāng)日配置當(dāng)日用，次日使用則鞭毛染色淺，觀察效果差。染色時(shí)一定要充分洗凈A液后再加B液，否則背景不清晰。2．觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)，載玻片和蓋玻片都要潔凈無油，否則會(huì)影響細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)。有些細(xì)菌，溫度太低時(shí)不能運(yùn)動(dòng)。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1．繪出你所觀察到的細(xì)菌的形態(tài)及鞭毛著生情況。2．試描述你所觀察的細(xì)菌有無運(yùn)動(dòng)性，是如何運(yùn)動(dòng)的?六、問題和思考1．鞭毛染色的菌種為什么要先連續(xù)傳幾代，并且要采用幼齡菌種?2．根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)體會(huì)，哪些因素影響鞭毛染色的效果?如何控制?3．試設(shè)計(jì)一實(shí)驗(yàn)，如何鑒別某種細(xì)菌是否能運(yùn)動(dòng)，是否有鞭毛，其鞭毛的著生位置。

實(shí)驗(yàn)10細(xì)菌芽孢、莢膜的染色及觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：掌握細(xì)菌的芽孢及莢膜染色方法。內(nèi)容：1．細(xì)菌的芽泡染色。2．細(xì)菌的莢膜染色。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具枯草芽孢桿菌、褐球固氮菌的斜面菌種。二甲苯、香柏油、蒸餾水、5%孔雀綠水溶液、0.5%沙黃水溶液(或0.05%堿性復(fù)紅)、繪圖墨水(用濾紙過濾后備用)、95%乙醇、石炭酸復(fù)紅染液；顯微鏡、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、蓋玻片、小試管(l×6.5cm)、燒杯(300mL)、滴管、試管夾、擦鏡紙、吸水紙。三、操作步驟(一)芽孢染色法1．方法1(1)取37℃培養(yǎng)18～24h的枯草芽孢桿菌作涂片，并干燥，固定(參見“細(xì)胞單染色法”)。(2)于涂片上滴人3～5滴5%孔雀綠水溶液。(3)用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時(shí)，開始計(jì)算時(shí)間約4～5min。加熱過程中切勿使染料蒸干，必要時(shí)可添加少許染料。(4)傾去染液，待玻片冷卻后，用自來水沖洗至孔雀綠不再褪色為止。(5)用0.5%沙黃水溶液(或0.05%堿性復(fù)紅)復(fù)染lmin，水洗。(6)制片干燥后用油鏡觀察。芽孢呈綠色，菌體紅色。2．方法2(1)加1～2滴自來水于小試管中，用接種環(huán)從斜面上挑取2～3環(huán)培養(yǎng)18～24h的枯草芽孢桿菌菌苔于試管中，并充分混勻打散，制成濃稠的菌液。(2)加5%孔雀綠水溶液2～3滴于小試管中，用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充分混合。(3)將此試管浸于沸水浴(燒杯)中，加熱15～20min。(4)用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌于潔凈的載玻片上，并涂成薄膜，將涂片通過微火3次固定。(5)水洗，至流出的水中無孔雀綠顏色為止。(6)加沙黃水溶液，染2～3min后，傾去染液，不用水洗，直接用吸水紙吸干。(7)干燥后用油鏡觀察。芽孢綠色，菌體紅色。(二)莢膜染色法1．石炭酸復(fù)紅染色（1）取培養(yǎng)了72h的褐球固氮菌制成涂片，自然干燥(不可用火焰烘干)。（2）滴入1～2滴95%乙醇固定(不可加熱固定)。（3）加石炭酸復(fù)紅染液染色1～2min，水洗，自然干燥。(4)在載玻片一端加一滴墨汁，另取一塊邊緣光滑的載玻片與墨汁接觸，再以勻速推向另一端，涂成均勻的一薄層，自然干燥。(5)干燥后用油鏡觀察。菌體紅色，莢膜無色，背景黑色。2．背景染色(1)先加1滴墨水于潔凈的玻片上，并挑少量褐球固氮菌與之充分混合均勻。(2)放一清潔蓋玻片于混合液上，然后在蓋玻片上放一張濾紙，向下輕壓，吸收多余的菌液。(3)干燥后用油鏡觀察。背景灰色，菌體較暗，在其周圍呈現(xiàn)一明亮的透明圈即莢膜。四、注意事項(xiàng)1．莢膜染色涂片不要用加熱固定，以免莢膜皺縮變形。2．供芽孢染色用的菌種應(yīng)控制菌齡，使大部分芽孢仍保留在菌體上為宜。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告(一)繪圖1．枯草芽孢桿菌及巨大芽孢桿菌的菌體及芽孢形態(tài)，芽孢的著生位置。2．褐球固氮菌菌體及莢膜的形態(tài)。(二)試制片，但不進(jìn)行染色，觀察是否能看到芽孢和莢膜?七、問題和思考1．為什么芽孢染色要加熱?為什么芽孢及營養(yǎng)體能染成不同的顏色?2．組成莢膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，為什么?3．試設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)如何鑒定某一產(chǎn)芽孢菌株的芽孢形態(tài)、著生位置及所屬分類地位。

實(shí)驗(yàn)11放線菌的形態(tài)觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：辨認(rèn)放線菌的營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲、孢子絲、孢子的形態(tài)；學(xué)習(xí)放線菌的觀察方法。內(nèi)容：用水封計(jì)法、玻璃紙法、印片法觀察放線菌的形態(tài)特征。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具細(xì)黃鏈霉菌(streptomycsmicuoflavus)又稱5406的培養(yǎng)平皿，棘孢小單孢菌(Micromonosporaechinospora)的玻璃紙培養(yǎng)平皿。0.1%美藍(lán)染色液、石炭酸復(fù)紅染色液；蓋玻片、載玻片、鑷子、接種環(huán)、顯微鏡、涂布器、玻璃紙、打孔器。三、操作步驟(一)觀察自然生長狀態(tài)的放線菌用鑷子小心取出用插片法培養(yǎng)的5406菌培養(yǎng)皿中的一張蓋玻片，將其背面附著的菌絲體擦凈。然后將長有菌的一面向上放在潔凈的載玻片上，用低倍鏡、高倍鏡觀察。找出3類菌絲及其分生孢子，并繪圖。注意放線菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲的粗細(xì)和色澤差異。(二)水封片觀察取一滴美藍(lán)染色液置于載玻片中央，將用搭片法培養(yǎng)棘孢小單孢菌培養(yǎng)皿中的蓋玻片取出，并將有菌面朝下，放在載玻片上，浸在染色液中，制成水封片，用高倍鏡觀察其單個(gè)分生孢子及其基內(nèi)菌絲，并繪圖。(三)玻璃紙法的鏡檢觀察l．直接玻璃紙觀察分別用5406和棘孢小單孢菌的玻璃紙制片觀察。制片時(shí)，于載玻片上放一小滴蒸餾水，將含菌玻璃紙片小心剪下一小塊，移至載玻片上，并使有菌面向上。在玻璃紙與載玻片間不能有氣泡，以免影響觀察。將制片于顯微鏡下觀察，先用低倍鏡觀察菌的立體生長狀況，再用高倍鏡仔細(xì)觀察。注意區(qū)分5406菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和彎曲狀或螺旋狀的孢子絲。觀察棘孢小單孢菌時(shí)注意把視野調(diào)暗，其基內(nèi)菌絲纖細(xì)發(fā)亮，其單個(gè)分生孢子發(fā)暗，直接生長在基內(nèi)菌絲長出的小梗上。繪圖。2．印片染色法觀察用鑷子取潔凈載玻片并微微加熱，然后用這微熱載玻片蓋在長有5406或棘孢小單孢菌的平皿上，輕輕壓一下，注意將載玻片垂直放下和取出，以防載玻片水平移動(dòng)而破壞放線菌的自然形態(tài)。反轉(zhuǎn)有印痕的載玻片微微加熱固定．用石炭酸復(fù)紅染色lmin，水洗，晾干。用油鏡觀察。繪圖。注意比較兩種菌的形態(tài)特征有何不同。四、注意事項(xiàng)1．培養(yǎng)放線菌中要注意，放線菌的生長速度較慢，培養(yǎng)期較長，在操作中應(yīng)特別注意無菌操作，嚴(yán)防雜菌污染。2．玻璃紙法培養(yǎng)接種時(shí)注意玻璃紙與平板瓊脂培養(yǎng)基間不宜有氣泡，以免影響其表面放線菌的生長，3．不同觀察方法中嚴(yán)格按要求進(jìn)行，注意菌體的上下位置。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1．繪圖玻璃紙法、水封片法、印片法及自然生長狀態(tài)下觀察的放線菌形態(tài)。2．試比較5406菌與棘孢小單孢菌特征的異同。六、問題和思考1．在高倍鏡或油鏡下如何區(qū)分放線菌的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲?2．用插片法和搭片法如何制備放線菌標(biāo)本，其主要優(yōu)點(diǎn)是什么?可否用此法觀察其他微生物?為什么?3．以玻璃紙覆蓋法培養(yǎng)和觀察放線菌有何優(yōu)點(diǎn)?試用此法設(shè)計(jì)一個(gè)觀察青霉菌形態(tài)的實(shí)驗(yàn)。注：(一)插片法和搭片法培養(yǎng)放線菌1．插片法(1)制平板、接種：用冷卻至約50℃的高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基倒平板(每皿約20mL)，可用兩種方法接菌：1、先接種后插片：冷凝后用接種環(huán)挑取少量斜面上的5406菌孢子，用平板培養(yǎng)基的一半面積作來回劃線接種(接種量可適當(dāng)加大)；2、先插片后接種：用平板培養(yǎng)基的另一半面積進(jìn)行。(2)插片及培養(yǎng)：用無菌鑷子取無菌蓋玻片，在已接種平板上以45°角斜插入培養(yǎng)基內(nèi)，插人深度約占蓋玻片1/2長度(圖11-1A)。同時(shí)，在另一半未經(jīng)接種的部位以同樣方式插入數(shù)塊蓋玻片，然后接種少量5406菌孢子至蓋玻片一側(cè)的基部，且僅接種于其中央位置約占蓋玻片長度的一半左右，以免菌絲蔓延至蓋玻片的另一側(cè)。將插片平板倒置于28℃，培養(yǎng)3～7d。2．搭片法(1)開槽及接種：用無菌打孔器在凝固后的平板培養(yǎng)基上打洞數(shù)個(gè)，并將棘孢小單孢菌孢子劃線接種至洞內(nèi)邊緣。(2)搭片及培養(yǎng)：在接種后的洞面上放一無菌蓋玻片，平板倒置于28℃，培養(yǎng)3～7d（圖11—1B）。(二)玻璃紙法固體培養(yǎng)5406菌和棘孢小單孢菌1．玻璃紙滅菌將玻璃紙剪成比培養(yǎng)皿直徑略小的片狀，將濾紙剪成培養(yǎng)皿大小的圓形紙片并稍潤濕，然后把濾紙和玻璃紙交互重疊地放在培養(yǎng)皿中，借濾紙將玻璃紙隔開。然后進(jìn)行濕熱滅菌，備用。

圖11—1放線菌的插片與搭片培養(yǎng)示意圖A.插片法；B.搭片法2．制平板及鋪玻璃紙取冷凝后的高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基，用無菌鑷子將預(yù)先滅菌的塊狀玻璃紙平鋪至平板培養(yǎng)表面，鋪玻璃紙時(shí)可用無菌涂布器將玻璃紙與培養(yǎng)基之間的氣泡除去。3．涂布菌液及培養(yǎng)取0.lmL的孢子懸液涂布在鋪有玻璃紙的平板培養(yǎng)基表面。接種平板倒置于28℃，培養(yǎng)5～7d。

實(shí)驗(yàn)12酵母菌的形態(tài)觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：了解自然存在的酵母菌及其形態(tài)結(jié)構(gòu)。了解酵母菌產(chǎn)生子囊孢子的條件及其形態(tài)。內(nèi)容：1．觀察酵母菌個(gè)體形態(tài)。2．觀察酵母菌的假菌絲和繁殖過程。3．觀察自然狀態(tài)的酵母菌。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具釀酒酵母(Saccharomyescerevisiae)、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)斜面菌種。PDA培養(yǎng)基、麥?zhǔn)?McCLary)培養(yǎng)基(醋酸鈉培養(yǎng)基)、0.05%美藍(lán)染色液(以pH6.0的0.02mol/L磷酸緩沖液配制)、碘液、0.04%的中性紅染色液%孔雀綠，0.5%沙黃液、95%乙醇；顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、蓋玻片、接種環(huán)、V形玻璃棒、放置一個(gè)三角形玻璃棒支架的培養(yǎng)皿。三、操作步驟(一)酵母菌形態(tài)觀察1．酵母菌的話體染色觀察及死亡率的測(cè)定(1)以無菌水洗下PDA斜面培養(yǎng)的釀酒酵母菌苔，制成菌懸液。(2)取0.05%美藍(lán)染色液1滴，置載玻片中央，并用接種環(huán)取酵母菌懸液與染色液混勻，染色2～3min，加蓋玻片，在高倍鏡下觀察酵母菌個(gè)體形態(tài)，區(qū)分其母細(xì)胞與芽體，區(qū)分死細(xì)胞(藍(lán)色)與活細(xì)胞(不著色)。(3)在一個(gè)視野里計(jì)數(shù)死細(xì)胞和活細(xì)胞，共計(jì)數(shù)5～6個(gè)視野。酵母菌死亡率一般用百分?jǐn)?shù)來表示，以下式來計(jì)算：

死亡率=死細(xì)胞總數(shù)÷死活細(xì)胞總數(shù)×100%

2．酵母菌液泡系的話體觀察于潔凈載玻片中央加一滴中性紅染色液，取少許上述酵母菌懸液與之混合，染色5min，加蓋玻片在顯微鏡下觀察。細(xì)胞無色，液泡呈紅色。3．酵母菌細(xì)胞中肝糖粒的觀察將1滴碘液置于載玻片中央，接人上述酵母菌懸液，混勻，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察，細(xì)胞內(nèi)的貯藏物質(zhì)肝糖顆粒呈深紅色。4．酵母菌子囊孢子的觀察(1)活化釀酒酵母：將釀酒酵母接種至新鮮的麥芽汁培養(yǎng)基上，置28C培養(yǎng)2～3d，然后再移植2～3次。(2)轉(zhuǎn)接產(chǎn)孢培養(yǎng)基：將活化的釀酒酵母轉(zhuǎn)接至醋酸鈉培養(yǎng)基上，置30℃恒溫培養(yǎng)14d。(3)觀察：挑取少許產(chǎn)孢菌苔于載玻片的水滴上，經(jīng)涂片、熱固定后，加數(shù)滴孔雀綠，lmin后水洗，加95%乙醇30S，水洗，最后用0.5%沙黃液復(fù)染30S，水洗去染色液，最后用吸水紙吸干。制片干燥后，鏡檢，子囊孢子呈綠色，子囊為粉紅色。注意觀察子囊孢子的數(shù)目、形狀和子囊的形成率。(4)計(jì)算子囊形成的百分率：計(jì)數(shù)時(shí)隨機(jī)取3個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)產(chǎn)子囊孢子的子囊數(shù)和不產(chǎn)孢子的細(xì)胞，然后按下列公式計(jì)算：

子囊形成率（%）=3個(gè)視野中形成子囊的總數(shù)÷3個(gè)視野中（形成子囊的總數(shù)+不產(chǎn)孢子細(xì)胞總數(shù)）×100%

5．酵母菌假菌絲的觀察取一無菌載玻片浸于溶化的PDA培養(yǎng)基中，取出放在溫室培養(yǎng)的支架上，待培養(yǎng)基凝固后，進(jìn)行酵母菌劃線接種，然后將無菌蓋玻片蓋在接菌線上(圖12—1)，28℃培養(yǎng)2～3d后，取出載玻片，擦去載玻片下面的培養(yǎng)基，在顯微鏡下直接觀察?？梢姷窖恐辰湍感纬傻呐汗?jié)狀假菌絲，裂殖酵母則形成竹節(jié)狀假菌絲(圖12—2)。

圖12—1酵母菌假菌絲的培養(yǎng)圖12—2酵母菌的假菌絲形態(tài)A.藕節(jié)狀假菌絲；B.竹節(jié)狀假菌絲6．自然狀態(tài)下的酵母菌觀察取一滴美藍(lán)染色液于載玻片中央，春夏秋季取醬油或淹菜上的白膜，冬季取腌酸菜湯上的白膜，將其置于載玻片染色液中，蓋上蓋玻片，顯微鏡下仔細(xì)觀察酵母菌形態(tài)，出芽生殖，假菌絲等。四、注意事項(xiàng)1．用于活化酵母菌的麥芽汁培養(yǎng)基要新鮮、表面濕潤。2．在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上加大移種量，可提高子囊形成率。3．通過微加熱增加酵母的死亡率，易于觀察死亡細(xì)胞。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告(一)繪圖1．?dāng)?shù)個(gè)酵母菌細(xì)胞，示觀察到的結(jié)構(gòu)。2．?dāng)?shù)個(gè)子囊及子囊孢子形態(tài)圖。(二)記錄并計(jì)數(shù)酵母菌的死亡率及子囊形成率(原始記錄及計(jì)算結(jié)果)。六、問題和思考1．酵母菌的假菌絲是怎樣形成的?與霉菌的真菌絲有何區(qū)別?2．如何區(qū)別營養(yǎng)細(xì)胞和釋放出的子囊孢子?3．試設(shè)計(jì)一個(gè)從子囊中分離子囊孢子的試驗(yàn)方案。

注：酵母菌的簡(jiǎn)易培養(yǎng)配2%葡萄糖水(或自糖水)，煮沸，裝入三角瓶中(液面高度2～2cm )，加HCl調(diào)至pH3～5放入幾塊葡萄皮（或其他糖分較高的果皮），置5～28℃溫箱中培養(yǎng)2～3d，聞到酒香味后，即可取培養(yǎng)液鏡檢。

實(shí)驗(yàn)13霉菌的形態(tài)觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：了解霉菌形態(tài)，掌握微生物載玻片濕室培養(yǎng)方法。內(nèi)容：1．霉菌載玻片濕室培養(yǎng)。2．曲霉、青霉、根霉、毛霉形態(tài)觀察。3．根霉假根的觀察。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具產(chǎn)黃青霉(Penicfilliumchrysogenum)、黑曲霉(Aspergillusniger)、黑根霉(Rhizopusnigrians)、總狀毛霉(Mucorracemosus)等斜面菌種。半固體PDA培養(yǎng)基、乳酸苯酚固定液、棉藍(lán)染色液、20%甘油;透明膠帶、剪刀、培養(yǎng)皿、載玻片、口形玻棒擱架、蓋玻片、圓形濾紙片、細(xì)口滴管、鑷子、顯微鏡、接種環(huán)。三、操作步驟(一)霉菌的載玻片濕室培養(yǎng)可4人合作，每人制作一霉菌的載玻片。1．準(zhǔn)備濕室在培養(yǎng)皿底鋪一張圓形濾紙片，其上放一“冂”形載玻片擱架，在擱梁上放一塊載玻片和兩塊蓋玻片，蓋上皿蓋，外用紙包扎，經(jīng)12lC濕熱滅菌30min后，置60℃烘箱中烘干，備用。2．接種用接種環(huán)挑取少量待觀察的霉菌孢子至濕室內(nèi)的載玻片上，每張載玻片可接同一菌種的孢子兩處。接種時(shí)只要將帶菌的接種環(huán)在載玻片上輕輕碰幾下即可(務(wù)必記住接種的位置)。3．加培養(yǎng)基用無菌細(xì)口滴管吸取少量融化約60℃的培養(yǎng)基，滴加到載玻片的接種處，培養(yǎng)基應(yīng)滴得圓而薄，其直徑約為0.5cm(滴加量一般以l/2小滴為宜)。4．加蓋玻片在培養(yǎng)基未徹底凝固前．用無菌鑷子將皿內(nèi)蓋玻片蓋在瓊脂塊薄層上，用鑷子輕壓，使蓋玻片和載玻片間的距離相當(dāng)接近，但不能壓扁，否則不透氣。5．倒保濕劑每皿倒大約3mL20%的無菌甘油，使皿內(nèi)的濾紙完全潤濕，以保持皿內(nèi)濕度，皿蓋上注明菌名、組別和接種日期。此為制成的載玻片濕室，置28℃恒溫培養(yǎng)3～5d。(二)黑根霉假根的培養(yǎng)將融化的PDA培養(yǎng)基，冷卻至50℃倒入無菌平皿，其量約為平皿高度的l/2。冷凝后，用接種環(huán)沾取根霉孢子，在平板表面劃線接種。然后將平皿倒置，在皿蓋內(nèi)放一無菌載玻片，于28℃培養(yǎng)2～3d后，可見根霉的氣生菌絲倒掛成胡須狀，有許多菌絲與載玻片接觸，并在載玻片上分化出假根和匍匐菌絲等結(jié)構(gòu)（圖13—1）。

圖13—1根霉假根的培養(yǎng)(三)鏡檢觀察1．濕室培養(yǎng)霉菌鏡檢載玻片從培養(yǎng)16～20h開始，通過連續(xù)觀察，可了解孢子的萌發(fā)、菌絲體的生長分化和子實(shí)體的形成過程。將濕室內(nèi)的載玻片取出，直接置于低倍鏡和高倍鏡下觀察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形態(tài)，重點(diǎn)觀察菌絲是否分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特點(diǎn)，曲霉的足細(xì)胞，根霉和毛霉的孢子囊和孢囊孢子。繪圖。2．粘片觀察取一滴棉藍(lán)染色液置于載玻片中央，取一段透明膠帶，打開霉菌平板培養(yǎng)物，粘取菌體，粘面朝下，放在染液上。鏡檢。3．假根觀察將培養(yǎng)根霉假根的平皿打開，取出皿蓋內(nèi)的載玻片標(biāo)本，在附著菌絲體的一面蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。只要用低倍鏡就能觀察到假根及從根節(jié)上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和兩個(gè)假根間的匍匐菌絲，觀察時(shí)注意調(diào)節(jié)焦距以看清各種構(gòu)造。4．制成永久裝片把觀察到霉菌形態(tài)較清晰，完整的片子，制成標(biāo)本作較長期保存。制備方法是，輕輕揭去蓋玻片，如果載玻片上有瓊脂，仔細(xì)挑去，然后滴加少量乳酸苯酚固定液，蓋上清潔蓋玻片，在蓋玻片四周滴加樹膠封固。四、注意事項(xiàng)載玻片濕室培養(yǎng)時(shí)，蓋玻片不能緊貼載玻片，要彼此有極小縫隙，一是為了通氣；二是使各部分結(jié)構(gòu)平行排列，易于觀察。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告(一)繪制鏡檢形態(tài)圖1．毛霉和根霉形態(tài)圖，示各部。2．青霉和曲霉形態(tài)圖，示各部（二）載玻片觀察記錄各菌種的載玻片標(biāo)本觀察結(jié)果：菌種菌絲體（氣生菌絲、營養(yǎng)菌絲的粗細(xì)、色澤、菌絲有隔或無隔等）無性孢子特征（孢子梗的分化特征，孢子著生特征等）其他特征結(jié)構(gòu)（有無假根、足細(xì)胞匍匐菌絲、囊軸等）

六、問題和思考1．什么叫載玻片濕室培養(yǎng)?它適用于觀察怎樣的微生物，有何優(yōu)點(diǎn)?2．濕室培養(yǎng)時(shí)為何用20%甘油作保濕劑?3．本實(shí)驗(yàn)中觀察假根的設(shè)計(jì)原理是什么?此設(shè)計(jì)還適合于培養(yǎng)哪類菌。

實(shí)驗(yàn)14細(xì)菌大小的測(cè)定

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：學(xué)會(huì)測(cè)微尺的使用和計(jì)算方法及對(duì)球菌和桿菌的測(cè)量。內(nèi)容：1.認(rèn)識(shí)測(cè)微尺，學(xué)習(xí)目鏡測(cè)微尺的標(biāo)定。2．測(cè)定金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌體的大小。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的玻片標(biāo)本。香柏油、二甲苯；顯微鏡、目鏡測(cè)微尺、鏡臺(tái)測(cè)微尺、擦鏡紙。三、操作步驟l．測(cè)微尺的構(gòu)造顯微鏡測(cè)微尺是由目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)接物測(cè)微尺組成，目鏡測(cè)微尺是一塊圓形玻璃片，其中有精確的等分刻度，在5mm刻尺上分50份(圖14一lC)。目鏡測(cè)微尺每格實(shí)際代表的長度隨使用接目鏡和接物鏡的放大倍數(shù)而改變，因此在使用前必須用鏡臺(tái)測(cè)微尺進(jìn)行標(biāo)定。鏡臺(tái)測(cè)微尺為一專用中央有精確等分線的載玻片(圖14—1A)，一般將長為1mm的直線等分成100個(gè)小格，每格長0.0lmm即10μm，是專用于校正目鏡測(cè)微尺每格長度的。2．目鏡測(cè)微尺的標(biāo)定把目鏡的上透鏡旋開，將目鏡測(cè)微尺輕輕放在目鏡的隔板上，使有刻度的一面朝下。將鏡臺(tái)測(cè)微尺放在顯微鏡的載物臺(tái)上，使有刻度的一面朝上。先用低倍鏡觀察，調(diào)焦距，待看清鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測(cè)微尺的刻度與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度相平行，并使兩尺左邊的一條線重合，向右尋找另外一條兩尺相重合的直線(圖15—lB)。3．計(jì)算方法標(biāo)定公式：

目鏡測(cè)微尺每格長度（μm）=兩條重合線間鏡臺(tái)測(cè)微尺的格數(shù)×10÷兩條重合線間目鏡測(cè)微尺的格數(shù)

例如，目鏡測(cè)微尺20個(gè)小格等于鏡臺(tái)測(cè)微尺3小格，已知鏡臺(tái)測(cè)微尺每格為10μm，則3小格的長度為3×10=30μm，那么相應(yīng)地在目鏡測(cè)微尺上每小格長度為3×10÷20=1.5μm。用以上計(jì)算方法分別校正低倍鏡、高倍鏡及油鏡下目鏡測(cè)微尺每格實(shí)際長度。4．菌體大小的測(cè)定將鏡臺(tái)測(cè)微尺取下，分別換上大腸桿菌及金黃色葡萄球菌玻片標(biāo)本，先在低倍鏡和高倍鏡下找到目的物，然后在油鏡下用目鏡測(cè)微尺測(cè)量菌體的大小。先量出菌體的長和寬占目鏡測(cè)微尺的格數(shù)，再以目鏡測(cè)微尺每格的長度計(jì)算出菌體的長和寬。并詳細(xì)記錄于表15—1中。例如，目鏡測(cè)微尺在這架顯微鏡下，每格相當(dāng)于1.5μm，測(cè)量的結(jié)果，若菌體的平均長度相當(dāng)于目鏡測(cè)微尺的2格，則菌體長應(yīng)為3×1.5μm=3.0μm。一般測(cè)量菌體的大小，應(yīng)測(cè)定10～20個(gè)菌體，求出平均值，才能代表該菌的大小。四、注意事項(xiàng)1．鏡臺(tái)測(cè)微尺的玻片很薄，在標(biāo)定油鏡頭時(shí)，要格外注意，以免壓碎鏡臺(tái)測(cè)微尺或損壞鏡頭。2．標(biāo)定目鏡測(cè)微尺時(shí)要注意準(zhǔn)確對(duì)正目鏡測(cè)微尺與鏡臺(tái)測(cè)微尺的重合線。五、演示1．目鏡測(cè)微尺、鏡臺(tái)測(cè)微尺的顯微鏡下示教。2．標(biāo)定及測(cè)量方法示范。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1．目鏡測(cè)微尺標(biāo)定結(jié)果：低倍鏡下倍目鏡測(cè)微尺每格長度是μm。高倍鏡下倍目鏡測(cè)微尺每格長度是μm。油鏡下倍目鏡測(cè)微尺每格長度是μm。2．菌體大小測(cè)定結(jié)果：菌號(hào)大腸桿菌測(cè)定結(jié)果金黃色葡萄球菌的直徑大小測(cè)定結(jié)果目鏡測(cè)微尺格數(shù)實(shí)際長度目鏡測(cè)微尺格數(shù)實(shí)際直徑/μm寬長寬長1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

均值

試與己知的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的大小作一比較是否一致？為何？七、問題和思考1．為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡和物鏡時(shí)必須重新用鏡臺(tái)測(cè)微尺對(duì)目鏡微尺進(jìn)行標(biāo)定？2．若目鏡不變，目鏡測(cè)微尺也不變，只改變物鏡，那么目鏡測(cè)微尺每格所測(cè)量的鏡臺(tái)上的菌體細(xì)胞的實(shí)際長度（或?qū)挾龋┦欠裣嗤?？為什么?/p>

實(shí)驗(yàn)15微生物數(shù)量的測(cè)定

細(xì)菌群體生長表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目的增加或細(xì)胞物質(zhì)的增加。測(cè)定細(xì)胞數(shù)目的方法有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法(directmicroscopiccount)、平板菌落計(jì)數(shù)法(platecount)、光電比油法(turbidityestimationbyspectrophotometer)、最大或然數(shù)法(mostprobablenumberMPN)以及膜過濾法(membranefiltration)等。測(cè)定細(xì)胞物質(zhì)的方法有細(xì)胞干重的測(cè)定，細(xì)胞某種成分如氮的含量、RNA和DNA的含量測(cè)定，代謝產(chǎn)物的測(cè)定等。總之，測(cè)定微生物生長量的方法很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，工作中應(yīng)根據(jù)具體情況要求加以選擇。本實(shí)驗(yàn)主要介紹生產(chǎn)、科研工作中比較常用的顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、平板菌落計(jì)數(shù)法和光電比濁計(jì)數(shù)法。一顯微鏡直接計(jì)數(shù)法（一）目的要求1．明確血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的原理。2．掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。（二）基本原理顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計(jì)菌器)，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡(jiǎn)便、快速、直觀的方法。目前國內(nèi)外常用的計(jì)菌器有：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、Peteroff-Hauser計(jì)菌器以及Hawksley計(jì)菌器等，它們都可用于酵母、細(xì)菌、霉菌孢子等懸液的計(jì)數(shù)，基本原理相同。后兩種計(jì)菌器由于蓋上蓋玻片后，總?cè)莘e為0.02mm3，而且蓋玻片和載波片之間的距離只有0.02mm，因此可用油浸物鏡對(duì)細(xì)菌等較小的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。除了用這些計(jì)菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細(xì)菌學(xué)檢查。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速、操作簡(jiǎn)單。但此法的缺點(diǎn)是所測(cè)得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點(diǎn)，如結(jié)合活菌染色微室培養(yǎng)（短時(shí)間）以及加細(xì)胞分裂抑制劑等方法來達(dá)到只計(jì)數(shù)活菌體的目的。本實(shí)驗(yàn)以血球計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行顯微鏡直接計(jì)數(shù)。另外兩種計(jì)菌器的使用方法可參看各廠商的說明書。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。該計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)；中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各列有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造如圖l5-1。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格(圖15—2)；另一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格，但無論是哪一種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格都是400個(gè)。每一個(gè)大方格邊長為lmm，則每一個(gè)大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.lmm3(萬分之一毫升)。

圖15—1血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造（一）圖15—2血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造（二）A.正面圖；B.縱切面圖；放大后的方格網(wǎng)，中間大方格為計(jì)數(shù)室1.血細(xì)胞計(jì)數(shù)板；2.蓋玻片；3.計(jì)數(shù)室

計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)五個(gè)中方格的總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成lml菌液中的總菌數(shù)。設(shè)五個(gè)中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，則1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×25×104×B=50000A·B（個(gè)）同理，如果是16個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×16×104×B=32000A·B（個(gè)）（三）器材1．菌種釀酒酵母2．儀器或其他用具血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細(xì)滴管。（四）操作步驟l．菌懸液制備以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙骸?．鏡檢計(jì)數(shù)室在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。3．加樣品將清潔干燥的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細(xì)滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動(dòng)進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。取樣時(shí)先要搖勻菌液；加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。4．顯微鏡計(jì)數(shù)加樣后靜止5min，然后將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強(qiáng)弱適當(dāng)，對(duì)于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易舌清楚計(jì)數(shù)室方格線，或只見豎線或只見橫線。在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5~10個(gè)菌體為宜。每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格(可選4個(gè)角和中央的一個(gè)中格)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均數(shù)值來計(jì)算樣品的含菌量。5．清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板使用完畢后，將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。（五）實(shí)驗(yàn)報(bào)告l．結(jié)果將結(jié)果記錄于下表中。A表示五個(gè)中方格中的總菌數(shù)；B表示菌液稀釋倍數(shù)。

各中格中菌數(shù)AB二室平均值菌數(shù)/ml12345第一室

第二室

2．思考題(1)根據(jù)你的體會(huì)，說明用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的誤差主要來自哪些方面?應(yīng)如何盡量減少誤差．力求準(zhǔn)確?(2)某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)1～2種可行的檢測(cè)方法。二平板菌落計(jì)數(shù)法（一）目的要求學(xué)習(xí)平板菌落計(jì)數(shù)的基本原理和方法。（二）、基本原理平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。但是，由于待測(cè)樣品往往不易完全分散成單個(gè)細(xì)胞，所以，長成的一個(gè)單菌落也可來自樣品中的2～3或更多個(gè)細(xì)胞。因此平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位(colony-formingunits，cfu)而不以絕對(duì)菌落數(shù)來表示樣品的活菌含量。平板菌落計(jì)數(shù)法雖然操作較繁，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時(shí)間才能取得，而且測(cè)定結(jié)果易受多種因素的影響，但是，由于該計(jì)數(shù)方法的