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第七章發(fā)酵工藝控制溫度、pH、氧氣、二氧化碳、泡沫發(fā)酵染菌的防治與處理發(fā)酵終點(diǎn)的判斷等發(fā)酵是一種很復(fù)雜的生產(chǎn)過(guò)程,其好壞涉及諸多因素,如菌種的生產(chǎn)性能、培養(yǎng)基的配比、原料質(zhì)量、滅菌條件、種子質(zhì)量、發(fā)酵條件和過(guò)程控制等。研究意義:1、不論是老或新品種,都必須經(jīng)過(guò)發(fā)酵研究這一階段,以考察其代謝規(guī)律、影響產(chǎn)物合成的因素,優(yōu)化發(fā)酵工藝條件。
2、高產(chǎn)菌種對(duì)工藝條件的波動(dòng)比低產(chǎn)菌種更敏感,故掌握生產(chǎn)菌種的代謝規(guī)律和發(fā)酵調(diào)控的基本知識(shí)對(duì)生產(chǎn)的穩(wěn)定和提高具有重要的意義。一、發(fā)酵條件的影響及其控制
微生物發(fā)酵的生產(chǎn)水平取決于生產(chǎn)菌種的特性和發(fā)酵條件的控制。了解發(fā)酵工藝條件對(duì)過(guò)程的影響和掌握反映菌的生理代謝和發(fā)酵過(guò)程變化的規(guī)律,可以幫助人們有效地控制微生物的生長(zhǎng)和生產(chǎn)。常規(guī)的發(fā)酵條件:罐溫、攪拌轉(zhuǎn)速、攪拌功率、空氣流量、罐壓、液位、補(bǔ)料、加糖、油或前體,通氨速率以及補(bǔ)水等。表征過(guò)程性質(zhì)的狀態(tài)參數(shù):pH、溶氧(DO)、溶解CO2、氧化還原電位、尾氣O2和CO2
含量、基質(zhì)或產(chǎn)物濃度、代謝中間物或前體濃度、菌濃等。間接狀態(tài)參數(shù):比生長(zhǎng)速率、攝氧率、釋放速率(CER)、呼吸商(RQ)、基質(zhì)消耗速率和產(chǎn)物合成速率等。1、溫度對(duì)發(fā)酵的影響和及其控制
微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成都是在各種酶催化下進(jìn)行的,溫度是保證酶活性的重要條件,因此在發(fā)酵系統(tǒng)中必須保證穩(wěn)定而合適的溫度環(huán)境。(1)溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響大多數(shù)微生物在20-40℃的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)。嗜冷菌在溫度低于20℃下生長(zhǎng)速率最大,嗜中溫菌在30-35℃左右生長(zhǎng),嗜熱菌在50℃以上生長(zhǎng)。(2)溫度對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響溫度對(duì)青霉菌生長(zhǎng)速率、呼吸強(qiáng)度和青霉素生產(chǎn)速率的影響如上圖所示。可以看出,溫度對(duì)參與生長(zhǎng)繁殖、呼吸和青霉素形成的各種酶的影響是不同的。(3)溫度對(duì)發(fā)酵液物理性質(zhì)的影響#影響氧在發(fā)酵液中的溶解度
溫度溶氧#影響基質(zhì)的分解速率
如菌體對(duì)硫酸鹽吸收在25℃時(shí)最小(4)溫度對(duì)生物合成方向的影響金色鏈絲菌
研究發(fā)現(xiàn),溫度與微生物的調(diào)節(jié)機(jī)制關(guān)系密切。例如,在20℃時(shí),氨基酸末端產(chǎn)物對(duì)其合成途徑的第一個(gè)酶的反饋抑制作用,比在其正常生長(zhǎng)溫度37℃時(shí)更大。(5)影響發(fā)酵溫度的因素發(fā)酵熱
發(fā)酵熱指的是發(fā)酵過(guò)程中釋放出來(lái)的凈熱量,以J/(m3·h)為單位表示。
生物熱:生產(chǎn)菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的熱叫生物熱。營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)被菌體分解產(chǎn)生大量的熱能,部分用于合成高能化合物ATP,供給合成代謝所需要的能量,多余的熱量則以熱能的形式釋放出來(lái),形成生物熱。
攪拌熱:攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)引起的液體之間和液體與設(shè)備之間的摩擦所產(chǎn)生的熱能。
蒸發(fā)熱
:空氣進(jìn)入發(fā)酵罐與發(fā)酵液廣泛接觸后,進(jìn)行熱交換,必然引起水分的蒸發(fā),被空氣和蒸發(fā)水分帶走的熱量。Q蒸發(fā)
=G
(I出-I進(jìn))
輻射熱:由于罐外壁和大氣間的溫度差異而使發(fā)酵液中的部分熱能通過(guò)罐體向大氣輻射的熱量。發(fā)酵熱在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中是隨時(shí)間變化的。所以,為使發(fā)酵在一定溫度下進(jìn)行,必須采取措施——在夾套或蛇管內(nèi)通入冷水加以控制(小型的發(fā)酵罐,在冬季和發(fā)酵初期,散熱量大于產(chǎn)熱量則需用熱水保溫。)(6)
最適溫度的選擇
所謂最適溫度是指在該溫度下最適于菌的生長(zhǎng)或產(chǎn)物的合成。對(duì)不同的菌種、不同的培養(yǎng)條件、不同的酶反應(yīng)以及不同的生長(zhǎng)階段,最適溫度有所不同。
最適生長(zhǎng)溫度與最適生產(chǎn)溫度往往是不一致的。如乳酸發(fā)酵,乳鏈球菌最適生長(zhǎng)溫度是34
C,而產(chǎn)酸最多的溫度是30
C,但發(fā)酵速度最高的溫度達(dá)40
C。青霉素產(chǎn)生菌的最適生長(zhǎng)溫度為30℃,但產(chǎn)生青霉素的最適溫度是24.7℃。
★在不同的發(fā)酵階段選擇不同的溫度應(yīng)根據(jù)發(fā)酵的不同時(shí)期,選擇不同的培養(yǎng)溫度。生長(zhǎng)階段,選最適生長(zhǎng)溫度,在產(chǎn)物分泌階段,選最適生產(chǎn)生產(chǎn)溫度。即變溫控制。e.g
青霉素變溫發(fā)酵:起初5小時(shí),維持在30C,以后降到25C培養(yǎng)5小時(shí),再降到到20C培養(yǎng)28小時(shí),最后又提高到25C,培養(yǎng)40小時(shí),放罐。青霉素的產(chǎn)量比在25C恒溫發(fā)酵條件下提高14.7%?!锟紤]培養(yǎng)基成分和濃度例如,在使用較稀薄或較易利用的培養(yǎng)基時(shí),提高溫度則養(yǎng)分往往過(guò)早耗竭,導(dǎo)致菌絲過(guò)早自溶,產(chǎn)量降低?!飬⒖计渌l(fā)酵條件例如,通氣條件較差的情況下,可以適當(dāng)降低溫度,一方面增加溶解氧濃度,另一方面降低菌體的生長(zhǎng)速率,以彌補(bǔ)因通氣不足而造成的代謝異常。氧是一種難溶于水的氣體。在25℃,1×105Pa條件下,純氧在水中的溶解度為1.26mmol/L,在28℃氧在發(fā)酵液中的溶解度只有0.22mmol/L,而發(fā)酵液中的大量微生物耗氧迅速(耗氧速率大于25~100mmol/L.h。
在好氧深層培養(yǎng)中,氧氣的供應(yīng)往往是發(fā)酵能否成功的重要限制因素之一。2、溶氧對(duì)發(fā)酵的影響和及其控制
好氧微生物的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)都需要消耗氧氣,它們只有在氧分子存在的情況下才能完成生物氧化作用。液體中的微生物只能利用溶解氧,氣液界面處的微生物還能利用氣相中的氧。強(qiáng)化氣液界面也將有利于供氧。在微生物的培養(yǎng)過(guò)程中,應(yīng)保持供氧與耗氧的平衡,滿足微生物對(duì)氧的利用。(1)臨界氧
發(fā)酵生產(chǎn)中用空氣飽和度百分?jǐn)?shù)來(lái)表示溶氧濃度。這只能在相似的條件下,在同樣的溫度、罐壓、通氣攪拌下進(jìn)行比較。這種方法能反映菌的生理代謝變化和對(duì)產(chǎn)物合成的影響。臨界氧:不影響呼吸所允許的最低溶氧濃度,如對(duì)產(chǎn)物而言,便是不影響產(chǎn)物合成所允許的最低濃度。
各種微生物的臨界氧值:細(xì)菌和酵母:3~10%放線菌:5~30%霉菌:10~15%注意:
●實(shí)際上,呼吸臨界氧值不一定與產(chǎn)物合成臨界氧值相同。
●生物合成臨界氧濃度并不等于其最適氧濃度。
●在培養(yǎng)過(guò)程中并不是維持溶氧越高越好。過(guò)高的溶氧對(duì)生長(zhǎng)可能不利。(2)溶氧作為發(fā)酵異常的指標(biāo)生長(zhǎng)過(guò)程從培養(yǎng)液中溶氧濃度的變化可以反映菌的生長(zhǎng)生理狀況。發(fā)酵溶氧變化異常,可及時(shí)預(yù)告生產(chǎn)可能出現(xiàn)的問(wèn)題。★操作故障或事故★中間補(bǔ)料是否得當(dāng)★污染雜菌:溶氧會(huì)反常地迅速(一般2~5h)跌到零,并長(zhǎng)時(shí)間不回升。這比無(wú)菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)染菌要提前幾個(gè)小時(shí)。但有時(shí)會(huì)出現(xiàn)染菌后溶氧反而升高的現(xiàn)象。
微生物的“需氧”可用耗氧速率或呼吸強(qiáng)度來(lái)表示:
耗氧速率(oxygenuptakerate):指單位體積的培養(yǎng)液在單位時(shí)間的耗氧量。單位為mmolO2/(L·
h),用r表示
呼吸強(qiáng)度(respiratorystrength):?jiǎn)挝毁|(zhì)量的細(xì)胞干重在單位時(shí)間的耗氧量。單位為mmolO2/(g·干細(xì)胞
·h),用Qo2表示兩者的關(guān)系:(3)溶氧的控制需氧方面式中,r——攝氧率,mmolO2/(L·h);
QO2——呼吸強(qiáng)度,mmolO2/(g菌·h);
X——菌濃,g/L。
在發(fā)酵過(guò)程中,影響耗氧的因素有以下幾方面:
★培養(yǎng)基成分和補(bǔ)料培養(yǎng)基的成分和濃度顯著影響耗氧;培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)豐富,菌體生長(zhǎng)快,耗氧量大;發(fā)酵濃度高,耗氧量大;發(fā)酵過(guò)程補(bǔ)料或補(bǔ)糖,微生物對(duì)氧的攝取量隨著增大。
★菌齡影響耗氧:呼吸旺盛,耗氧力強(qiáng),發(fā)酵后期菌體處于衰老狀態(tài),耗氧能力自然減弱。★發(fā)酵條件影響耗氧:在最適條件下發(fā)酵,耗氧量大。發(fā)酵過(guò)程中,排除有毒代謝產(chǎn)物如二氧化碳、揮發(fā)性的有機(jī)酸和過(guò)量的氨,也有利于提高菌體的攝氧量?!锟諝獾牧魉?/p>
KLa隨空氣流速的增加而增大,但空氣速度過(guò)大,則可使葉輪發(fā)生過(guò)載,即葉輪不能分散空氣,氣體不經(jīng)分散而沿?cái)嚢杵骶徛\(yùn)動(dòng)的中心迅速上升而逸出。★培養(yǎng)液的物理性質(zhì)發(fā)酵液的表面張力、粘度、離子濃度等都會(huì)影響氣體的溶解度,還影響液體的湍動(dòng)以及界面和液膜的阻力,因而影響傳遞效率。發(fā)酵液中菌絲濃度增大,表觀粘度增大,通氣效率下降。發(fā)酵過(guò)程中添加糖、花生餅粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、前體或無(wú)菌水、消泡劑等均可改變培養(yǎng)液的理化性質(zhì)。
★空氣分布器對(duì)通氣效率的影響發(fā)酵罐中裝有多孔分布器和單孔分布器,在氣流速度很低時(shí),多孔分布器有較高的通氣效率。但兩者的區(qū)別隨著氣流速度的增加而逐漸減少??赡苁堑蜌饬鲿r(shí)多孔分布器可形成更大的傳遞面積,而當(dāng)通氣量增大時(shí),單孔分布器能更大的增加發(fā)酵液的湍動(dòng)程度。方法作用機(jī)理投資運(yùn)轉(zhuǎn)成本效果對(duì)生產(chǎn)作用氣體成分C*變化中到低高好好攪拌速度KLa變化高低好好擋板KLa變化中低好好通氣速率KLa變化低低中不定溫度C*、氧需求變化低低變化不定基質(zhì)濃度氧需求變化中低好不定罐壓C*變化中到高低中好電解生產(chǎn)氧C*變化中低高小規(guī)模傳氧中間介質(zhì)KLa變化中中好好各種溶氧控制方法的比較KL——氧傳質(zhì)系數(shù),m/h;a——比表面積(m2/m3)c*——氧在水中的飽和濃度,mmol/L;cL——發(fā)酵液中的溶氧濃度,mmol/L。
發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)液的pH值是微生物在一定環(huán)境條件下代謝活動(dòng)的綜合指標(biāo),是一項(xiàng)重要的發(fā)酵參數(shù),它對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)品的積累有很大的影響。3、pH對(duì)發(fā)酵的影響和及其控制(1)pH對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響pH影響菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成:(1)影響酶的活性,當(dāng)pH值抑制菌體中某些酶的活性時(shí),會(huì)阻礙菌體的新陳代謝;(2)細(xì)胞膜的電荷狀態(tài):引起膜滲透性的變化,從而影響菌對(duì)養(yǎng)分的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌(3)對(duì)某些生物合成途徑有顯著影響:pH值往往引起菌體代謝過(guò)程的不同,使代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和比例發(fā)生改變。微生物生長(zhǎng)和生物合成的最適pH微生物生長(zhǎng):細(xì)菌(6.3~7.5),霉菌和酵母菌(3~6),放線菌(7~8)
微生物生長(zhǎng)階段和產(chǎn)物合成階段的最適pH往往不一樣,這不僅與菌種的特性有關(guān),也取決于產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)。產(chǎn)品菌生長(zhǎng)最適pH范圍產(chǎn)物合成最適pH范圍青霉素6.5~7.26.2~6.8鏈霉素6.3~6.96.7~7.3四環(huán)素6.1~6.65.9~6.3土霉素6.0~6.65.8~6.1紅霉素6.6~7.06.8~7.3灰黃霉素6.4~7.06.2~6.5幾種抗生素發(fā)酵的最適pH范圍(2)發(fā)酵過(guò)程中pH的變化
發(fā)酵過(guò)程中,由于菌種在一定溫度及通氣條件下對(duì)培養(yǎng)基中碳、氮源等的利用,隨著有機(jī)酸或氨基氮的積累,會(huì)使pH產(chǎn)生一定的變化。這種變化的根源是培養(yǎng)基的成分和微生物的代謝特性。引起培養(yǎng)液的pH發(fā)生波動(dòng)的因素引起pH下降的因素:1)培養(yǎng)基中碳、氮比例不當(dāng),碳源過(guò)多,特別是葡萄糖過(guò)量,或者中間補(bǔ)糖過(guò)多加之溶解氧不足,致使有機(jī)酸大量積累2)消沫油加得過(guò)多3)生理酸性物質(zhì)的存在引起pH上升的因素:1)氮源過(guò)多2)生理堿性物質(zhì)存在3)中間補(bǔ)料中氨水或尿素等的堿性物質(zhì)加入過(guò)多(3)最適pH的選擇和調(diào)節(jié)選擇最適pH的原則:既有利于菌體的生長(zhǎng)繁殖,又要最大限度地使產(chǎn)物合成獲得高的產(chǎn)量。
考慮發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)配方,使之有適當(dāng)?shù)谋壤?,使發(fā)酵過(guò)程pH
的變化在適合的范圍內(nèi)。因?yàn)榕囵B(yǎng)基中含有代謝產(chǎn)酸[如葡萄糖產(chǎn)生酮酸、(NH4)2SO4]和產(chǎn)堿
[如NaNO3、尿素]的物質(zhì)以及緩沖劑[如CaCO3]等成分,它們?cè)诎l(fā)酵過(guò)程中要影響pH的變化,特別是CaCO3能與酮酸等反應(yīng),而起到緩沖作用,所以它的用量比較重要。在分批發(fā)酵中,常采用這種方法來(lái)控制pH的變化。控制pH的方法利用上述方法調(diào)節(jié)pH值的能力是有限的,如果達(dá)不到要求,可以用在發(fā)酵過(guò)程直接補(bǔ)加酸或堿和補(bǔ)枓的方式來(lái)控制,特別是補(bǔ)料的方式,效果比較明顯?,F(xiàn)在常用的是以生理酸性物質(zhì)(硫酸銨)和堿性物質(zhì)(氨水)來(lái)控制。它們不僅可以凋節(jié)pH值,還可以補(bǔ)充氮源。當(dāng)發(fā)酵的pH值和氨氮含量都低時(shí),補(bǔ)加氨水,就可以達(dá)到調(diào)節(jié)pH
和補(bǔ)充氨氮的目的。反之,pH值較高,氨氮含量又低時(shí),就補(bǔ)加硫酸銨。
目前,已比較成功地采用補(bǔ)料的方法來(lái)調(diào)節(jié)pH值,如氨基酸發(fā)酵采用流加尿素的方法,特別是次級(jí)代謝產(chǎn)物抗生素發(fā)酵,更常用此法。既可以達(dá)到穩(wěn)定pH值的目的,又可以不斷補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),特別是能產(chǎn)生阻遏作用的物質(zhì)。采用補(bǔ)料的方法,可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)、延長(zhǎng)發(fā)酵周期、調(diào)節(jié)pH值和培養(yǎng)液的特性(如菌濃等)等幾個(gè)目的。最成功的例子就是青霉素的補(bǔ)枓工藝,利用控制葡萄糖的補(bǔ)加速率來(lái)控制pH值的變化范圍(現(xiàn)已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化),其青霉素產(chǎn)量比用恒定的加糖速率和加酸或堿來(lái)控制pH值的產(chǎn)量高25%。4、二氧化碳對(duì)發(fā)酵的影響及其控制CO2的抑制作用
影響菌體生長(zhǎng)、形態(tài)及產(chǎn)物合成高濃度的CO2會(huì)影響產(chǎn)黃青霉的菌絲形態(tài)。大多數(shù)微生物適應(yīng)低CO2濃度(0.02~0.04%體積分?jǐn)?shù))。當(dāng)尾氣CO2濃度高于4%時(shí)微生物的糖代謝與呼吸速率下降。(1)CO2對(duì)細(xì)胞的作用機(jī)制:CO2——主要作用在細(xì)胞膜的脂肪酸核心部位
——影響磷脂的親水頭部帶電荷的表面及細(xì)胞膜表面上的蛋白質(zhì)當(dāng)細(xì)胞膜的脂質(zhì)相中CO2濃度達(dá)到一臨界值時(shí),膜的流動(dòng)性及表面電荷密度發(fā)生變化。這將導(dǎo)致膜對(duì)許多基質(zhì)的運(yùn)輸受阻,影響了細(xì)胞膜的運(yùn)輸效率,使細(xì)胞處于“麻醉”狀態(tài),生長(zhǎng)受抑制,形態(tài)發(fā)生變化。(2)呼吸商與發(fā)酵的關(guān)系呼吸商:RQ值可以反映菌體的代謝情況,例如酵母培養(yǎng)過(guò)程:
RQ=1糖代謝走有氧分解代謝途徑,僅供生長(zhǎng)、無(wú)產(chǎn)物形成;
RQ>1.1走EMP途徑,生成乙醇;
RQ=0.93生成檸檬酸;
RQ<0.7生成的乙醇被當(dāng)作基質(zhì)再利用。(3)二氧化碳濃度的控制
發(fā)酵液中CO2濃度受到許多因素的影響,如細(xì)胞的呼吸強(qiáng)度、發(fā)酵液的流變學(xué)特性、通氣攪拌程度、罐壓大小和設(shè)備規(guī)模等。值得注意的是,罐內(nèi)的CO2分壓是液體深度的函數(shù)。CO2濃度的控制:根據(jù)其對(duì)發(fā)酵的促進(jìn)或抑制作用,通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌速率,提高或降低其濃度。
(1)碳源的種類(lèi)和濃度的影響和控制碳源分為迅速利用的碳源和緩慢利用的碳源。迅速利用的碳源能較迅速地參與代謝、合成菌體和產(chǎn)生能量,并分解產(chǎn)物(如丙酮酸),有利于菌體的生長(zhǎng)。但有的分解代謝產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)物的合成可能產(chǎn)生阻遏作用。
五、基質(zhì)濃度對(duì)發(fā)酵的影響慢速利用的碳源為菌體緩慢利用,有利于延長(zhǎng)代謝產(chǎn)物的合成(如抗生素),許多藥物發(fā)酵采用。例如乳糖、蔗糖、麥芽糖、玉米油分別是青霉素、頭孢菌素C、鹽霉素、核黃素及生物堿發(fā)酵的最適碳源。因此選擇最適碳源對(duì)提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量是很重要的。
在工業(yè)上,發(fā)酵培養(yǎng)基中常采用迅速和緩慢利用的混合碳源,來(lái)控制菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。
(2)氮源的種類(lèi)和濃度的影響和控制氮源象碳源一樣,也有迅速利用的氮源和緩慢利用的氮源。
迅速利用的氮源有:氨基態(tài)氮的氨基酸、硫酸銨、玉米漿。慢速利用的氮源有:黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉等蛋白質(zhì)。
快速利用氮源容易被菌體所利用,促進(jìn)菌體生長(zhǎng),但對(duì)某些代謝產(chǎn)物的合成,特別是某些抗生素的合成產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用,影響產(chǎn)量。如鏈霉菌的竹桃霉素發(fā)酵中,采用促進(jìn)菌體生長(zhǎng)的銨鹽,能刺激菌絲生長(zhǎng),但抗生素產(chǎn)量下降。
緩慢利用的氮源對(duì)延長(zhǎng)次級(jí)代謝產(chǎn)物的分泌期,提高產(chǎn)物的產(chǎn)量是有好處的。但一次投入,也容易促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和養(yǎng)分過(guò)早耗盡,以致菌體過(guò)早衰老而自溶,從而縮短產(chǎn)物的分泌期,因而要選擇適當(dāng)?shù)牡春瓦m當(dāng)?shù)臐舛取?/p>
(3)磷酸鹽濃度的影響和控制
磷是微生物生長(zhǎng)繁殖所必需的成分,也是合成代謝產(chǎn)物所必需的。微生物生長(zhǎng)良好所允許的磷酸鹽濃度為0.32-300mmol,但對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成良好所允許的最高平均濃度僅為1.0mmol,提高到10mmol,就明顯影響其合成。
磷酸鹽濃度在初級(jí)代謝中的要求不如次級(jí)代謝嚴(yán)格。
對(duì)抗生素來(lái)說(shuō),常常是采用生長(zhǎng)亞適量(對(duì)菌體生長(zhǎng)不是最適合但又不影響生長(zhǎng)的量)磷酸鹽濃度,其最適濃度取決于菌種特征、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基的組成和來(lái)源等因素。6、泡沫對(duì)發(fā)酵的影響及控制(1)由外界引進(jìn)的氣流被機(jī)械地分散形成(2)由發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的氣體聚結(jié)生成的發(fā)酵泡沫(3)發(fā)酵液中糖、蛋白質(zhì)和代謝物等的存在起到加強(qiáng)或穩(wěn)定泡沫的作用泡沫產(chǎn)生的原因(1)通氣、攪拌的劇烈程度(2)培養(yǎng)基所用原材料性質(zhì):蛋白質(zhì)原料如蛋白胨、玉米漿、花生餅粉、黃豆餅干粉、酵母粉和糖蜜等是主要的發(fā)泡物質(zhì)。培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量越多,發(fā)酵液的粘度也越大,越容易起泡,泡沫多而且持久穩(wěn)定。另外,培養(yǎng)基的滅菌方法、滅菌溫度和時(shí)間也會(huì)影響到培養(yǎng)基成分的變化,從而影響培養(yǎng)基的起泡能力。泡沫消長(zhǎng)的影響因素:泡沫對(duì)發(fā)酵的危害(1)使發(fā)酵罐的裝填系數(shù)減少(2)造成大量逃液,導(dǎo)致產(chǎn)物損失(3)增加了染菌的機(jī)會(huì)(4)增加了菌群的非均一性(5)消泡劑的加入給提取工序帶來(lái)困難發(fā)酵過(guò)程中泡沫的控制★機(jī)械消沫★化學(xué)消沫(消沫劑消沫)(1)機(jī)械消沫原理:利用物理作用,靠機(jī)械的強(qiáng)烈振動(dòng)或壓力的變化促使泡沫破碎。優(yōu)點(diǎn):節(jié)省原材料,不會(huì)增加下游工段的負(fù)擔(dān),減少染雜菌。缺點(diǎn):效率不高(作為消沫的輔助方法),不能從根本上消除泡沫成因。例如:耙式消泡槳裝在發(fā)酵罐的攪拌軸上,槳上的齒面略高于液面,靠軸的旋轉(zhuǎn)帶動(dòng)來(lái)打碎泡沫,起到消泡的作用。罐內(nèi)機(jī)械消沫
通過(guò)噴頭將含氣泡的培養(yǎng)液噴向轉(zhuǎn)向板,使其破裂,然后再流回發(fā)酵罐。罐外機(jī)械消沫(2)化學(xué)消沫★化學(xué)消沫的機(jī)理:化學(xué)消沫劑是表面活性劑。一般好的消沫劑應(yīng)同時(shí)具備降低液膜的機(jī)械強(qiáng)度和表面粘度這兩種性能。★常用的消沫劑(溶解度較小、分散性較差的高分子化合物):a)天然油脂類(lèi):玉米油、豆油、菜油及豬油等b)高級(jí)醇類(lèi):十八醇、聚二醇等c)聚醚類(lèi):聚氧丙烯甘油(GP)、聚氧乙烯氧丙烯甘油(“泡敵”)(GPE)等P187d)硅酮類(lèi):聚二甲基硅氧烷及其衍生物e)氟化烷烴
消泡劑多數(shù)是溶解度小、分散性不十分好的高分子化合物,所以在使用時(shí),要考慮如何降低它的黏度和提高它的分散性,來(lái)增強(qiáng)它們的消泡效果。使用的增效方法有:
a機(jī)械分散、或借助分散劑
b與載體一起使用
c多種消沫劑并用
d利用乳化劑增強(qiáng)消沫劑的消沫作用
染菌是發(fā)酵生產(chǎn)中的一個(gè)致命弱點(diǎn),輕者影響了生產(chǎn)產(chǎn)品的收率和產(chǎn)品質(zhì)量,重者會(huì)導(dǎo)致“倒罐”,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前:提高生產(chǎn)技術(shù)水平,盡可能防止發(fā)酵染菌的發(fā)生,而且一旦發(fā)生染菌,要能盡快找出其污染的原因,并采取相應(yīng)的有效措施,把發(fā)酵染菌造成的損失降低到最小。三、發(fā)酵染菌的防治及處理1、染菌的途徑分析●種子包括進(jìn)罐前菌種室階段出問(wèn)題●培養(yǎng)基的配制和滅菌不徹底●設(shè)備上特別是空氣除菌不徹底和過(guò)程控制操作上的疏漏●連續(xù)攪拌●供給無(wú)菌空氣、排放多余空氣●多次添加消沫劑、補(bǔ)充培養(yǎng)基●定時(shí)取樣分析2、染菌的判斷和防治◆鏡檢◆無(wú)菌試驗(yàn)◆一些狀態(tài)參數(shù),如溶氧變化、排氣中的CO2含量等◆異?,F(xiàn)象,如菌體生長(zhǎng)不良、耗糖慢、pH值異常變化、發(fā)酵過(guò)程中泡沫的異常增多、發(fā)酵液的顏色異常變化、代謝產(chǎn)物含量的異常下跌、發(fā)酵周期的異常延長(zhǎng)、發(fā)酵液的粘度異常增加等?!斐砂l(fā)酵染菌的原因有很多,且常因工廠不同而有所不同,但設(shè)備滲漏、空氣中有雜菌、種子帶菌、滅菌不徹底和技術(shù)管理不善等是造成各廠污染雜菌的普遍原因?!话?,從染菌的種類(lèi)可大致判斷其來(lái)源
從發(fā)酵染菌的規(guī)模分析不同染菌時(shí)間分析▲對(duì)抗生素發(fā)酵染菌:前期——原則上可適當(dāng)改變生長(zhǎng)參數(shù),使有利于生產(chǎn)菌而不利于雜菌的生長(zhǎng),或加入某些抑制雜菌的化合物。中后期——除非是噬菌體通常后果不會(huì)那么嚴(yán)重。3、染菌的挽救或處理(1)種子培養(yǎng)期染菌的處理種子受到雜菌污染后,應(yīng)經(jīng)滅菌后棄之,并對(duì)種子罐、管道等進(jìn)行仔細(xì)檢查和徹底滅菌。同時(shí)采用備用種子。(2)發(fā)酵前期染菌的處理如培養(yǎng)基中的碳、氮源含量還比較高時(shí),終止發(fā)酵,將培養(yǎng)基重新進(jìn)行滅菌處理后再用;否則,補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基,再進(jìn)行滅菌處理。也可采取降溫培養(yǎng)、調(diào)節(jié)pH值、調(diào)整補(bǔ)料量、補(bǔ)加培養(yǎng)基等措施。(3)發(fā)酵中、后期染菌的處理加入適當(dāng)?shù)臍⒕鷦┗蚩股兀砸种齐s菌的生長(zhǎng),也可采取降低培養(yǎng)溫度、降低通風(fēng)量、停止攪拌、少量補(bǔ)糖等其他措施。若產(chǎn)物含量已達(dá)一定值,也可放罐。廢液應(yīng)加熱滅菌后才能排放。(4)染菌后對(duì)設(shè)備的處理徹底清洗發(fā)酵罐,并加熱滅菌后才能使用。也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12h以上等方法進(jìn)行處理。4、噬菌體污染及其防治
利用細(xì)菌或放線菌進(jìn)行的發(fā)酵容易受噬菌體的污染,由于噬菌體的感染力非常強(qiáng),傳播蔓延迅速,且較難防治,對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)有很大的威脅。噬菌體是一種感染細(xì)菌或放線菌的病毒。噬菌體有兩類(lèi):烈性噬菌體:感染宿主細(xì)胞后,立即引起細(xì)胞裂解
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