第10章 組學研究技術課件

Chapter10

基因組學研究技術Capter1第10章組學研究技術物理圖譜基因轉(zhuǎn)錄圖譜基因組功能分析技術生物信息學技術主要內(nèi)容第10章組學研究技術物理圖譜第10章組學研究技術物理圖譜（physicalmap）測定DNA分子，繪制構成基因組的全部基因的排列和間距。

即直接將DNA分子標記、基因或克隆標定在基因組的實際位置。目的把基因的遺傳信息在染色體上的相對位置線性而系統(tǒng)地排列出來第10章組學研究技術染色體上每個DNA片段的順序以已知核苷酸序列的DNA片段（STS）為“路標”，以堿基對（bp，kb，Mb）作為基本測量單位（圖距）的基因組圖。

物理圖譜第10章組學研究技術物理圖的距離依作圖方法而異

★

輻射雜種作圖的計算單位為厘鐳(cR)

★

限制性片段作圖與克隆作圖圖距單位為堿基對(bp)?！綾R(厘鐳):在確定的輻射劑量下染色體斷裂的百分率?！康?0章組學研究技術物理圖譜要素

序列

位置長的序列中

▲物理圖：標明各個序列的路標

▲通過分子雜交的辦法利用DNA雙鏈互補特點一個DNA片段雜交在這個位置說明這個位置的結構與它相似~即這個位置的標記

以序列作為標記的位置第10章組學研究技術第10章組學研究技術物理作圖的方法

★限制酶作圖(RestrictionMapping)

★

基于克隆的基因組作圖(clone-basedmapping)

★熒光原位雜交

(Fish,Fluorescentinsituhybridization)

★

序標位作圖(STS，Sequencetagedsite)第10章組學研究技術物理圖譜的意義獲得分布于整個基因組的30000個序列標簽位點（sequencetaggedsite,STS），使基因組每隔100kb距離就有一個標記在此基礎上構建覆蓋每條染色體的大片段DNA克隆

如：第10章組學研究技術●酵母人工染色體

（yeastartificialchromosome,YAC）●細菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）●人工附加染色體

（humanartificialepisomalchromosome,HAEC）●人工噬菌體染色體

（P1bacteriophageartificialchromosome,PAC）等連續(xù)克隆(Contig)第10章組學研究技術限制酶作圖

DNA鏈的限制性酶切片段的排列順序即酶切片段在DNA鏈上的定位限制性內(nèi)切酶在DNA鏈上的切口是以特異序列為基礎的，核苷酸序列不同的DNA，經(jīng)酶切后就會產(chǎn)生不同長度的DNA片段，構成獨特的酶切圖譜(RestrictionMapping)。又稱DNA物理圖譜

DNA分子結構的特征之一

第10章組學研究技術DNA是很大的分子，限制酶產(chǎn)生用于測序反應的DNA片段只是其中的極小部分，這些片段在DNA鏈中所處的位置關系~即DNA物理圖譜解決的問題DNA物理圖譜是順序測定的基礎

指導DNA測序的藍圖

Why???第10章組學研究技術限制性作圖

▼將限制性酶切位點標定在DNA分子的相對位置只能應用于較小的DNA分子

▼上限取決于作圖分子中限制酶位點的頻率

▼采用6堿基對識別順序的限制酶適合﹤50KbDNA分子的精確作圖限制酶作圖

第10章組學研究技術基本原理

把龐大的DNA先“敲碎”，再拼接以Mb、kb、bp作為圖距以STS（sequencetagssite）探針序列為路標主要是把含有STS對應序列的DNA的克隆片段連接成相互重疊的“片段重疊群（contig）第10章組學研究技術第10章組學研究技術（1）完全降解

選擇合適的限制性內(nèi)切酶完全降解待測DNA鏈(同位素標記)

凝膠電泳分離→→自顯影→→獲得圖譜即組成該DNA鏈的酶切片段數(shù)目和大小基本步驟第10章組學研究技術同位素標記32P限制性內(nèi)切酶電泳第10章組學研究技術

末端標記待測DNA的一條鏈(同位素)

酶部分降解控制反應條件使DNA鏈上酶切口隨機斷裂避免所有切口斷裂的完全降解電泳分離→→自顯影比較自顯影圖譜根據(jù)片段大小及彼此間的差異排出酶切片段在DNA鏈上的位置（2）部分降解第10章組學研究技術12比較排出酶切片段第10章組學研究技術完整的物理圖譜應包括基因組的不同載體DNA克隆片段重疊群圖大片段限制性內(nèi)切酶切點圖

DNA片段或一特異DNA序列（STS）的路標圖基因組中廣泛存在的特征型序列等的標記圖（如CpG序列、Alu序列，isochore）

【具有mosaic結構,稱為isochore。即基因組是由一些較長的大片段（平均長度>>300Kb）組成,GC含量相對均勻,而在這些大片段的兩端GC含量是躍變的,而不是漸變的】

第10章組學研究技術第10章組學研究技術熒光原位雜交(Fish,Fluorescentinsituhybridization)將探針用熒光標記，與細胞分裂中期的染色體雜交，用熒光顯微鏡觀察信號所處的位置，將探針標定在連鎖圖上。第10章組學研究技術熒光原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）第10章組學研究技術熒光原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）第10章組學研究技術熒光原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）第10章組學研究技術熒光原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）第10章組學研究技術用DNA纖維分析水稻第4號染色體第10章組學研究技術基于克隆的基因組作圖

大片段DNA的克隆載體◆

YAC:酵母人工染色體230-1700Kb◆

BAC:細菌人工染色體300Kb◆PAC:P1人工染色體300Kb◆

Cosmids:30Kb

重疊群(Contig)

：相互重疊的DNA片段組成的物理圖

Contig組建方法:染色體步移指紋作圖第10章組學研究技術克隆作圖構建全基因組DNA基因文庫構建指定單一染色體的基因文庫PCR檢測STS分子標記根據(jù)重疊STS標記繪制克隆連鎖圖提取基因組DNA

流式細胞儀分離染色體打斷打斷第10章組學研究技術染色體步移原理第10章組學研究技術chromosomewalking酶切，插入A基因探針篩選亞克隆片段重新篩選亞克隆片段重新篩選λ亞克隆1相鄰λ亞克隆2第10章組學研究技術指紋：確定DNA樣品所具有的DNA片段一個克隆的指紋

即表示該克隆所具有的限定的順序特征克隆指紋分析原理

如果2個克隆彼此重疊它們一定含有相同的序列克隆指紋主要用于重疊群(Contig)的構建第10章組學研究技術指紋分析方法

限制性帶型(restrictionpatterns)指紋重復順序DNA指紋(repetitiveDNAfingerprints)STS目錄作圖(STS

contentmapping)

重復DNAPCR(repetitiveDNAPCR)

或分散重復順序PCR指紋

(interspersedrepeatelement

PCR,IRE-PCR)

第10章組學研究技術限制性片段指紋重疊順序DNA指紋STS指紋Contig第10章組學研究技術序標位(STS)作圖

長度:100-500bp

序列已知,可以設計PCR反應單拷貝,在染色體上的位置是唯一的

EST

(Expressedsequencetag)

可以作STS

STS：sequencetagsit第10章組學研究技術STS作圖原理成套片段2個標簽同時出現(xiàn)在6個大片段中只有2個大片段有2個標簽第10章組學研究技術染色體DNASTS作圖原理第10章組學研究技術尋找STS的方法

表達順序標簽(expressedsequencetag，EST)

從cDNA中找到的小段順序基因家族成員間共有的序列不能用于STSSSLP

（simplesequencelengthpolymorphisrns）隨機基因組順序第10章組學研究技術表達順序標簽EST

隨機挑選cDNA克隆進行單向、一步大規(guī)模測序所獲得的部分cDNA序列即EST

●

EST是一個cDNA克隆快速大規(guī)模測序后所獲得的３’端和５’端部分cDNA隨機片段●

每個EST長度約200～600bp

代表了一個單拷貝基因的部分cDNA表達序列第10章組學研究技術大多數(shù)EST的長度不足400bpWhy？？？一個基因轉(zhuǎn)錄本的cDNA序列可能包含多個序列重疊的EST一個基因mRNA剪接點不同可以獲得多個cDNA克隆那么，EST既可能對應于一個cDNA的某一部分又可能代表mRNA的不同剪接方式

第10章組學研究技術基因轉(zhuǎn)錄圖譜

（transcriptionmap）第10章組學研究技術轉(zhuǎn)錄圖譜(基因圖譜)

在識別基因組所包含的蛋白質(zhì)編碼序列的基礎上繪制的結合有關基因序列、位置及表達模式等信息的圖譜。即利用EST作為標記所構建的分子遺傳圖譜。（genemap）第10章組學研究技術Ortranscriptionmap:在人類基因組中鑒別出占2%至5%的全部基因的位置結構與功能?；驹恚旱鞍踪|(zhì)推測mRNA的序列，mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后利用其與所測序列進行雜交，鑒別出與轉(zhuǎn)錄有關的基因。第10章組學研究技術基本原理

生物性狀和疾病→→由結構或功能蛋白質(zhì)決定已知的蛋白質(zhì)→→由mRNA編碼

mRNA反轉(zhuǎn)錄→合成cDNA→

即EST的cDNA片段用這種穩(wěn)定的cDNA或EST→→作為“探針”進行分子雜交鑒別出與轉(zhuǎn)錄有關的基因第10章組學研究技術基本原理或用PolyA互補的寡聚T

或克隆載體的相關序列作為引物對mRNA雙端尾側的幾百個bp進行測序得到EST（表達序列標簽）第10章組學研究技術表達序列標簽（EST）克隆測序獲得EST第10章組學研究技術基本過程細胞/組織高質(zhì)量mRNA構建cDNA文庫克隆3‘和5’端探針估計全長和復雜性雜交陣列文庫克隆3‘和5’端全長候選基因純化克隆證實5’端第10章組學研究技術基因圖譜的意義1、能為估計人類基因的數(shù)目提供可靠的依據(jù)。2、提供不同組織、不同時期基因表達的信息（數(shù)目、種類及結構功能）。3、提供結構基因的標記，可以作為篩選基因的探針，有直接的經(jīng)濟價值。4、鑒定病態(tài)基因（如癌基因）的變異位置。第10章組學研究技術

單核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotidePolymorphisms，SNPs）

人類是一個具有多態(tài)性的群體。不同的群體和個體在生物學性狀（對疾病的易感性／抗性）上的差別，是進化過程中基因組與環(huán)境相互作用的結果第10章組學研究技術

不同個體間在基因水平上的單核苷酸變異，平均每1000對堿基出現(xiàn)一個SNP,2個無關個體間有300萬SNPs.第10章組學研究技術SNP作圖的一般步驟包括：

①獲取DNA序列；

②

從DNA序列確定序列標簽位點（sequencetaggedsites，STSs）；

③掃描STSs或ESTs確定候選SNPs；

④

確定SNPs；

⑤將SNPs定位于染色體特定位置。第10章組學研究技術特異雜交第10章組學研究技術SNP不同于罕見的單堿基突變（Mutation）

◆

SNP等位位點出現(xiàn)的頻率≧1％

◆

位于基因的編碼序列中的SNP稱為cSNP

如果cSNP引起蛋白質(zhì)重要部位AA變異導致其功能發(fā)生改變

◆

位于基因調(diào)控序列中的SNP影響基因的表達調(diào)控

◆

SNP因連鎖不平衡所形成的單倍型用于關聯(lián)研究（Associationstudies）確定與之聯(lián)鎖的生物學性狀相關序列第10章組學研究技術

連鎖分析與基因定位疾病的關聯(lián)研究多基因疾病的基因定位個體識別和親子鑒定發(fā)病機理的研究個體用藥生物進化和生物間相互關系SNP應用第10章組學研究技術【例1】

鐮刀型貧血癥（sickle-cellanemia）血紅蛋白的β珠蛋白基因

17位的A突變?yōu)門

導致Val變Glu

血紅蛋白構型改變攜氧能力大大降低，引發(fā)嚴重貧血SNP與臨床直接導致遺傳病第10章組學研究技術【例2】靜脈血栓（venousthrombosis）凝血因子5（factorV）基因

1691位的G突變?yōu)锳

導致Arg變?yōu)镚lu

封閉了抗凝血因子APC(activatedProteinC)

對factorV的切割位點促使血栓形成第10章組學研究技術關聯(lián)分析（Associationstudies）

：如果某一因素可增加某種疾病的發(fā)生風險即與正常對照人群相比該因素在疾病人群中的頻率較高

那么，該因素與疾病相關聯(lián)如非遺傳因素吸煙與肺癌相關遺傳因素中，APOE4與Alzheimer`s相關SNP與遺傳標記研究復雜性狀與疾病的遺傳，以及群體的基因識別

[老年癡呆/阿爾海默癥]第10章組學研究技術遺傳標記用于遺傳分析或關聯(lián)分析的特征核酸位點SNP數(shù)量多，分布廣泛SNP適于快速、規(guī)?；Y查SNP等位基因頻率的容易估計易于基因分型第10章組學研究技術同樣藥物的劑量對病人甲有效對病人乙不起作用對病人丙則可能有副作用藥物的療效與副作用方面，病人的反應差異很大

Why？？？病人遺傳學上存在差異（單核苷酸多態(tài)性SNP）導致對藥物產(chǎn)生不同的反應SNP與個體用藥第10章組學研究技術【例

】細胞色素P450酶與大約25%廣泛使用的藥物的代謝有關如果病人該酶的基因發(fā)生突變就會對降壓藥異喹胍產(chǎn)生明顯的副作用

那么，查明病人的SNP圖譜檢測病人是那一個或多個基因發(fā)生突變對癥下藥→→→個體醫(yī)療。第10章組學研究技術美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)提供（NationalInstitutesofHealth）★與癌癥和腫瘤相關的候選SNP數(shù)據(jù)庫：

★適于生物醫(yī)學研究的dbSNP多態(tài)數(shù)據(jù)庫：

SNP公用數(shù)據(jù)庫第10章組學研究技術基因組功能分析技術第10章組學研究技術基因分離技術

差異基因分離技術

SAGE

(SerialAnalysisofGeneExpression)

基因芯片技術遺傳連鎖分析位點關聯(lián)分析；第10章組學研究技術

雙雜交技術蛋白組學基因封閉技術（反義核酸、核酶、RNAi、基因剔除）

基因替代技術（基因轉(zhuǎn)移、可控性基因表達）

蛋白修飾技術生物信息學分析技術基因功能研究技術第10章組學研究技術◆

變性高壓液相色譜(DHPLC)(denaturinghigh-performanceliquidchromatography)◆

基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)(Matrix-assistedlaserdesorption/ionization-timeofflight)◆

DNAChip◆

SSCP(單鏈構像多肽性)◆

動態(tài)特異等位基因雜交

（dynamicallele-specifichybridization）SNP大規(guī)模分離檢測技術第10章組學研究技術新基因功能研究策略第10章組學研究技術基因表達系列分析SAGE

（serialsanalysisofgeneexpression）

1995Velculescu及其同事年創(chuàng)立第10章組學研究技術原理來自轉(zhuǎn)錄物內(nèi)特定位置的一小段寡核苷酸序列（9~11bp）含有鑒定一個轉(zhuǎn)錄物特異性的足夠信息，可作為區(qū)別轉(zhuǎn)錄物的標簽（tag）；通過簡單的方法將這些標簽串聯(lián)在一起，形成大量多聯(lián)體（concatemer），對每個克隆到載體的多聯(lián)體進行測序，并應用SAGE軟件分析，可確定表達的基因種類，并可根據(jù)標簽出現(xiàn)的頻率確定基因的表達豐度（abundance）。第10章組學研究技術1.將5μg含有oligodT（引物）的磁珠與RNA混合。2.合成雙鏈cDNA。

3.用NlaⅢ酶消化形成一條鏈末端有標簽的產(chǎn)物。

4.將樣品分成兩份，連接成含有識別序列的產(chǎn)物，以備用BsmF1消化。5.用MmeI切割每一個樣品形成約60bp的標簽。SAGE步驟磁珠磁珠磁珠磁珠磁珠磁珠識別序列識別序列標簽第10章組學研究技術6.延伸5秒，連接成約130bp的雙鏈標簽。

7.PCR擴增。8.用NlaⅢ酶切130bp產(chǎn)物釋放34bp雙鏈標簽。9.連接片斷形成串聯(lián)體。

10.克隆到pZErO-1+里，并測序。

連接擴增第10章組學研究技術SAGE實例第10章組學研究技術錨定酶辟分AE一半結合結頭B一半結合結頭A標簽酶辟分TE標簽酶辟分TE連接、用引物A、