發(fā)酵工藝學(xué)課件：第八章 微生物工程下游技術(shù)

第八章微生物工程下游技術(shù)原料液中目標(biāo)產(chǎn)物的濃度一般都很低，如L-異亮氨酸濃度為2.4％，青霉素為3.6％，慶大霉素為0.2％，胰島素僅為0.001％。原料液中成分復(fù)雜，常存在與目標(biāo)分子結(jié)構(gòu)極其相似的分子及異構(gòu)體。當(dāng)生物技術(shù)產(chǎn)品是食品或藥物時(shí)，溶劑的使用受到一定的限制，萃取、色譜等手段會(huì)受到一定的限制。發(fā)酵液成分一般不穩(wěn)定。原料液特點(diǎn)發(fā)酵液放罐后，應(yīng)及時(shí)快速操作，原因在于

1.菌體可能自溶

2.容易被雜菌污染

3.引起產(chǎn)物的破壞和降解。原料液中常存在降解目標(biāo)產(chǎn)物的雜質(zhì)，如可水解目標(biāo)蛋白質(zhì)的蛋白酶。下游技術(shù)可分為4個(gè)階段，即預(yù)處理、提取、精制、成品制作。下游技術(shù)一般工藝過(guò)程

預(yù)處理→細(xì)胞分離→細(xì)胞破壁(胞內(nèi)產(chǎn)物)加熱過(guò)濾勻漿法調(diào)pH離心研磨法絮凝膜分離酶解法碎片分離→提取→精制→成品制作離心沉淀(重)結(jié)晶濃縮雙水相吸附干燥膜分離萃取色譜分離無(wú)菌過(guò)濾超濾膜分離結(jié)晶原料液細(xì)胞分離(離心，過(guò)濾)細(xì)胞－胞內(nèi)產(chǎn)物路線一路線二細(xì)胞破碎碎片分離路線一A路線一B清液－胞外產(chǎn)物粗分離(鹽析、萃取、超濾等)純化(層析、電泳)脫鹽(凝膠過(guò)濾、超濾)濃縮(超濾)精制(結(jié)晶、干燥)包含體溶解(加鹽酸胍、脲)復(fù)性第一節(jié)發(fā)酵液預(yù)處理1、降低黏度加水稀釋?zhuān)汉?jiǎn)單，增體積、降低產(chǎn)物濃度。加熱升溫：檸檬酸發(fā)酵，90℃，蛋白質(zhì)變性凝固，利于過(guò)濾2、凝聚、絮凝改變粒子分散狀態(tài)，形成大顆粒，利過(guò)濾凝聚與絮凝凝聚與絮凝處理過(guò)程就是將化學(xué)藥劑預(yù)先投加到懸浮液中，改變細(xì)胞、菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，破壞其穩(wěn)定性，使它們聚集成可分離的絮凝體，再進(jìn)行分離。凝聚和絮凝凝聚：指在投加的化學(xué)物質(zhì)（鋁、鐵鹽類(lèi)）作用下，使膠體體系不穩(wěn)定并使粒子相互聚集成１mm大小塊狀凝聚體的過(guò)程。絮凝：指使用高分子絮凝劑將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)，形成10mm大小絮凝團(tuán)的過(guò)程。其中絮凝劑主要起架橋作用。常用絮凝劑聚丙烯酰胺類(lèi)：用量少，絮凝體粗大，分離效果好，絮凝速度快，適用范圍廣。無(wú)機(jī)高分子聚合物天然有機(jī)高分子絮凝劑，如殼聚糖和葡聚糖等聚糖類(lèi)，還有明膠、骨膠、海藻酸鈉等。微生物絮凝劑是近年來(lái)研究和開(kāi)發(fā)的新型絮凝劑，由微生物產(chǎn)生的具有絮凝細(xì)胞功能的物質(zhì)。主要成分是糖蛋白、粘多糖、纖維素及核酸等高分子物質(zhì)。微生物絮凝劑和天然絮凝劑與化學(xué)合成的絮凝劑相比，最大的優(yōu)點(diǎn)是安全，無(wú)毒和不污染環(huán)境。3、調(diào)整PH4、加入反應(yīng)劑環(huán)絲氨酸發(fā)酵液，氯化鈣、磷酸鹽生成沉淀。高價(jià)無(wú)機(jī)離子的去除Ca2+草酸Mg2+三聚磷酸鈉Fe3+黃血鹽（普魯士藍(lán)）蛋白質(zhì)去除加熱調(diào)pH(草酸，無(wú)機(jī)酸或堿)蛋白質(zhì)的變性最常用的使蛋白質(zhì)變性的方法是加熱。加熱還能使液體粘度降低，加快過(guò)濾速度。鏈霉素生產(chǎn)中，采用調(diào)pH至酸性（pH3.0），加熱至70℃，維持半個(gè)小時(shí)的方法來(lái)去除蛋白質(zhì)，能使過(guò)濾速度增大10-100倍，濾液粘度可降低1/6。第二節(jié)過(guò)濾、細(xì)胞破碎、結(jié)晶陶瓷濾膜一、過(guò)濾二、離心高速冷凍離心機(jī)旋轉(zhuǎn)過(guò)濾機(jī)滾筒式離心機(jī)4000細(xì)胞破碎（cellrupture）技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)含物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來(lái)的技術(shù)。細(xì)胞破碎技術(shù)是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型藥物成分的基礎(chǔ)。三、細(xì)胞破碎

一些蛋白質(zhì)在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)被宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，其后續(xù)分離和純化都相對(duì)簡(jiǎn)單。但由于一些重組DNA產(chǎn)品結(jié)構(gòu)復(fù)雜，必須在細(xì)胞內(nèi)組裝來(lái)獲得生物活性，如果在培養(yǎng)時(shí)被宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，其生物活性往往有所改變，此類(lèi)產(chǎn)品是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)品（非分泌型），需要應(yīng)用細(xì)胞破碎技術(shù)破碎細(xì)胞，使重組的藥物成分釋放出來(lái)，為后續(xù)的分離純化做好準(zhǔn)備工作。1.酶消化法

細(xì)胞懸浮液中加入酶能迅速和細(xì)胞壁反應(yīng)并破壞它們。酶選擇性的與細(xì)胞壁反應(yīng)，不破壞細(xì)胞內(nèi)的其它物質(zhì)。反應(yīng)條件溫和。此法的缺點(diǎn)在于酶的消耗限制了在大規(guī)模生產(chǎn)中的使用。

2.機(jī)械法

勻漿法研磨法超聲波法：利用頻率高、波長(zhǎng)短的超聲波進(jìn)行細(xì)胞破碎，效率更高高壓均質(zhì)法細(xì)胞破碎儀四、結(jié)晶

1.結(jié)晶的特點(diǎn)（1）只有同類(lèi)分子或離子才能排列成晶體，因此結(jié)晶過(guò)程有良好的選擇性。（2）通過(guò)結(jié)晶，溶液中大部分的雜質(zhì)會(huì)留在母液中，再通過(guò)過(guò)濾、洗滌，可以得到純度較高的晶體。（3）結(jié)晶過(guò)程具有成本低、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，廣泛應(yīng)用于氨基酸、有機(jī)酸、抗生素、維生素、核酸等產(chǎn)品的精制。2.結(jié)晶過(guò)程

(1)過(guò)飽和溶液的形成

(2)晶核生成

(3)晶體的生長(zhǎng)3.常用的工業(yè)起晶方法（1）自然起晶法：（2）晶種起晶法：5.重結(jié)晶

經(jīng)過(guò)一次粗結(jié)晶后，得到的晶體通常會(huì)含有一定量的雜質(zhì)。此時(shí)工業(yè)上常常需要采用重結(jié)晶的方式進(jìn)行精制。重結(jié)晶是利用雜質(zhì)和結(jié)晶物質(zhì)在不同溶劑和不同溫度下的溶解度不同，將晶體用合適的溶劑再次結(jié)晶，以獲得高純度的晶體。重結(jié)晶的操作過(guò)程

（1）選擇合適的溶劑；（2）將經(jīng)過(guò)粗結(jié)晶的物質(zhì)加入少量的熱溶劑中，并使之溶解；（3）冷卻使之再次結(jié)晶；（4）分離母液；（5）洗滌進(jìn)入生長(zhǎng)期的青蒿生長(zhǎng)旺期的青蒿收獲青蒿青蒿素分離精制方法

采用恒溫振蕩浸提法提取，活性炭脫色，75%(v/v)乙醇重結(jié)晶。提取的青蒿素精制的青蒿素分離實(shí)例——西地蘭毛花毛地黃干燥葉粉70%乙醇熱提三次醇提液減壓濃縮至含乙醇20%，放冷膠狀沉淀（葉綠素等雜質(zhì)）稀醇液減壓濃縮至無(wú)醇味濃水液氯仿洗滌氯仿液濃水液加乙醇至22%稀醇液水液氯仿液氯仿萃取三次氯仿液回收氯仿殘留物少量CH3OH與水混合苷結(jié)晶甲醇-氯仿-水分配氯仿層(主要是苷A、B)水層濃縮結(jié)晶(苷B、C)甲醇-氯仿-水分配水層氯仿層(苷B)水層濃縮，過(guò)濾結(jié)晶(苷C)溶于乙醇，加Ca(OH)2減壓濃縮，結(jié)晶結(jié)晶(苷C)甲醇重結(jié)晶西地蘭純品第三節(jié)膜分離Membraneseparation是利用特殊制造的、具有選擇透過(guò)性能的膜，在外力推動(dòng)下對(duì)混合物進(jìn)行分離、提純、濃縮的一種分離方法。

根據(jù)質(zhì)量、體積和幾何形態(tài)差異進(jìn)行分離。如過(guò)濾、微濾和超濾。3.1膜分離概述膜分離的特點(diǎn)①分離效能高。②膜分離過(guò)程都不發(fā)生相變，能耗低。③膜分離過(guò)程的工作溫度在室溫附近，膜分離設(shè)備本身沒(méi)有運(yùn)動(dòng)的部件，結(jié)構(gòu)緊湊、維修費(fèi)用低，易于自動(dòng)化。④設(shè)備體積小，占地少。⑤膜分離可直接插入已有的生產(chǎn)工藝流程。

膜分離存在的問(wèn)題①在操作中膜面會(huì)發(fā)生污染，使膜性能降低；②膜的耐壓性、耐熱性、耐溶劑是有限的，故應(yīng)用范圍受限制；③僅采用膜分離技術(shù)分離效果有限，往往需要與其他分離工藝組合起來(lái)使用。按膜孔徑大小分類(lèi)微濾膜0.02～10μm超濾膜0.001～0.02μm（1～20nm）反滲透膜0.0001～0.001μm（0.1～1nm）納米過(guò)濾膜平均直徑2nm。3.2膜原理0.5μm0.5μm3μm20μm膜的電鏡照片中空纖維超濾膜結(jié)構(gòu)單內(nèi)皮層雙皮層膜污染的處理與再生用物理方法清洗化學(xué)清洗方法①起溶解作用的物質(zhì)：酸、堿、酶（蛋白酶）、螯合劑、表面活性劑、分散劑。②起切斷離子結(jié)合作用的方法：改變離子強(qiáng)度、pH、電位。③起氧化作用的物質(zhì)：過(guò)氧化氫、次氯酸鹽。3.3膜組件的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)

管式膜組件tubularmembranemodule平板膜組件

平板膜組件結(jié)構(gòu)

parallel-platemembranemodule

螺旋卷式膜組件

螺旋卷式膜組件結(jié)構(gòu)

spiral-woundmembranemodule3.4膜分離在生物工程中的的應(yīng)用各種膜分離法的原理和應(yīng)用范圍膜分離法傳質(zhì)推動(dòng)力應(yīng)用舉例微濾

壓差0.05～0.5MPa除菌，回收菌超濾

壓差0.1～1.0MPa蛋白質(zhì)、多糖的回收和濃縮反滲透

壓差1.0～10MPa鹽、氨基酸、糖的濃縮濃縮大分子純化去雜質(zhì)（植物成分）去熱原過(guò)濾除菌小分子產(chǎn)物的回收氨基酸、抗生素、有機(jī)酸和動(dòng)物疫苗等發(fā)酵產(chǎn)品的相對(duì)分子質(zhì)量在2000以下，用超濾法可從發(fā)酵液中回收這些小分子產(chǎn)物，然后利用反滲透法進(jìn)行濃縮和除去更小的雜質(zhì)。除內(nèi)毒素內(nèi)毒素是細(xì)菌新陳代謝和細(xì)菌死后分解的產(chǎn)物，主要成分是脂多糖、脂蛋白等。在靜脈注射藥液時(shí)，如果將其帶進(jìn)血液，會(huì)對(duì)人體造成相當(dāng)大的危害。傳統(tǒng)的針劑用水除內(nèi)毒素的方法是過(guò)濾加活性炭吸附，此法并不可靠。在醫(yī)藥工業(yè)上用超濾法制造無(wú)菌水。蛋白質(zhì)的回收與脫鹽根據(jù)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，選擇適當(dāng)?shù)某瑸V膜，可進(jìn)行蛋白質(zhì)的濃縮和脫鹽。藥酒和中藥制劑的澄清滲透蒸發(fā)

是液體混合物在膜的一側(cè)與膜接觸，其中易滲透組分較多地溶解在膜上，并擴(kuò)散通過(guò)膜，在膜的另一側(cè)氣化而被抽出，從而得到分離的過(guò)程。滲透蒸發(fā)的過(guò)程原理第四節(jié)其他常用操作技術(shù)一、濃縮加熱、真空抽出料液中的水中藥濃縮罐。除去一些水。不同顏色管道不同功能。黑紅色為蒸汽，藍(lán)色為料液。二、凍干三、噴霧干燥多級(jí)萃取多級(jí)錯(cuò)流萃取流程

多級(jí)逆流萃取流程

1.1％葡聚糖水溶液與等體積0.36％甲基纖維素鈉水溶液相混合并靜置后，可得到兩個(gè)粘稠液層。

4.2雙水相萃取

利用親水性高分子聚合物的水溶液可形成雙水相的性質(zhì)，開(kāi)發(fā)了雙水相萃取法(twoaqueousphaseextraction)廣泛應(yīng)用的雙水相體系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dex)體系。聚合物與無(wú)機(jī)鹽的混合溶液，例如，PEG/磷酸鉀、PEG/磷酸銨、PEG/硫酸鈉等常用于生物產(chǎn)物的雙水相萃取。雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用

雙水相萃取技術(shù)目前較多地應(yīng)用于胞內(nèi)酶的提取和精制上。用雙水相萃取技術(shù)處理細(xì)胞勻漿液，既可方便地除去細(xì)胞碎片，還可使酶得到精制。在雙水相體系中，通常將目的蛋白質(zhì)分配在上相(PEG)，而細(xì)胞碎片分配在下相(鹽)。1.過(guò)濾設(shè)備的分類(lèi)

根據(jù)推動(dòng)力的不同可分為四類(lèi)（a）重力過(guò)濾 自然過(guò)濾（b）加壓過(guò)濾 板框過(guò)濾（c）真空過(guò)濾 真空過(guò)濾器（d）離心過(guò)濾 離心過(guò)濾器2.過(guò)濾介質(zhì)1、無(wú)定形顆粒：活性炭顆粒、沙、無(wú)煙煤2、成形顆粒：燒結(jié)金屬、燒結(jié)塑料3、非金屬織物：尼龍、玻璃纖維4、金屬織物：不銹鋼絲網(wǎng)5、無(wú)紡品：紙、石棉板框壓濾機(jī)板框壓濾機(jī)優(yōu)點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、過(guò)濾面積大、操作壓力高、適用廣缺點(diǎn)：設(shè)備笨重、間歇操作、勞動(dòng)強(qiáng)度大、輔助時(shí)間長(zhǎng)對(duì)于一些固體顆粒小、溶液粘度大的體系，過(guò)濾實(shí)際上是很難進(jìn)行的，必須采用離心技術(shù)方能達(dá)到目的。二、離心操作方式：間歇式、連續(xù)式型式：管式、套筒離心沉降利用懸浮液或乳濁液中密度不同的組分在離心力場(chǎng)中迅速沉降分層，實(shí)現(xiàn)固液分離溶液中的溶質(zhì)在一定條件下，因分子有規(guī)則的排列而結(jié)合成晶體，晶體的化學(xué)成分均一，其特征為離子和分子在空間晶格的結(jié)點(diǎn)上呈規(guī)則的排列.四、結(jié)晶

1.結(jié)晶的特點(diǎn)（1）只有同類(lèi)分子或離子才能排列成晶體，因此結(jié)晶過(guò)程有良好的選擇性。（2）通過(guò)結(jié)晶，溶液中大部分的雜質(zhì)會(huì)留在母液中，再通過(guò)過(guò)濾、洗滌，可以得到純度較高的晶體。（3）結(jié)晶過(guò)程具有成本低、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，廣泛應(yīng)用于氨基酸、有機(jī)酸、抗生素、維生素、核酸等產(chǎn)品的精制。2.結(jié)晶過(guò)程

(1)過(guò)飽和溶液的形成

(2)晶核生成

(3)晶體的生長(zhǎng)

過(guò)飽和溶液的形成方法(1)冷卻(2)溶劑蒸發(fā)(3)改變?nèi)軇┬再|(zhì)3.晶體的生長(zhǎng)

在過(guò)飽和溶液中已有晶核形成或加入晶種后，以過(guò)飽和度為推動(dòng)力，晶核或晶種將長(zhǎng)大，這種現(xiàn)象稱(chēng)為晶體生長(zhǎng)。提高晶體質(zhì)量的方法

（1）晶體質(zhì)量包括三個(gè)方面的內(nèi)容：晶體大小、形狀、純度（2）影響晶體純度的因素：母液中的雜質(zhì)、結(jié)晶速度、晶體粒度及粒度分布

4.常用的工業(yè)起晶方法（1）自然起晶法：（2）晶種起晶法：5.重結(jié)晶

經(jīng)過(guò)一次粗結(jié)晶后，得到的晶體通常會(huì)含有一定量的雜質(zhì)。此時(shí)工業(yè)上常常需要采用重結(jié)晶的方式進(jìn)行精制。重結(jié)晶是利用雜質(zhì)和結(jié)晶物質(zhì)在不同溶劑和不同溫度下的溶解度不同，將晶體用合適的溶劑再次結(jié)晶，以獲得高純度的晶體。重結(jié)晶的操作過(guò)程

（1）選擇合適的溶劑；（2）將經(jīng)過(guò)粗結(jié)晶的物質(zhì)加入少量的熱溶劑中，并使之溶解；（3）冷卻使之再次結(jié)晶；（4）分離母液；（5）洗滌3.1膜分離概述膜的定義：在一種流體相間有一薄層凝聚相物質(zhì)，把流體相分隔開(kāi)來(lái)成為兩部分，這一薄層物質(zhì)稱(chēng)為膜膜還必須具有高度的滲透選擇性膜的性能參數(shù)

孔道特征包括孔徑（poresize）、孔徑分布和孔隙度?？讖椒植迹╬oresizedistribution）是指膜中一定大小的孔的體積占整個(gè)孔體積的百分?jǐn)?shù)?？紫抖龋╡ffectivenumberofpores）是指整個(gè)膜中孔所占的體積百分?jǐn)?shù)。水通量：水通量為每單位時(shí)間內(nèi)通過(guò)單位膜面積的水體積流量，也叫透水率，即水透過(guò)膜的速率。單內(nèi)皮層中空纖維超濾膜結(jié)構(gòu)菌體分離對(duì)于發(fā)酵的胞外產(chǎn)物，首先要除去懸浮的微生物、離子與膠體。目前，較好的固液分離方法是過(guò)濾或離心。采用超濾法去除谷氨酸發(fā)酵液中的菌體，不僅可以將發(fā)酵原液中固形物含量濃縮10倍，為菌體的再利用創(chuàng)造了條件；而且超濾透過(guò)液中谷氨酸含量、pH等理化指標(biāo)與發(fā)酵液相同，但不含菌體，且蛋白含量很低