利瑪原甲藻毒性和毒素的多因子分析

利瑪原甲藻毒性和毒素的多因子分析

現(xiàn)在，感冒紅色潮已成為世界海洋環(huán)境的主題，主要影響人類健康、自然生態(tài)和海水養(yǎng)殖。其中,有毒藻形成的有害赤潮尤其令人關(guān)注。有毒赤潮藻能夠產(chǎn)生藻毒素,在貝類和魚(yú)類體內(nèi)累積,并沿食物鏈傳遞,危害高營(yíng)養(yǎng)級(jí)的海洋生物,甚至危及人類健康。常見(jiàn)的藻毒素包括麻痹性貝毒(ParalyticShellfishPoison),PSP)、腹瀉性貝毒(DiarrheticShellfishPoison,DSP)、神經(jīng)性貝毒(NeurotoxicShellfishPoison,NSP)、記憶缺失性貝毒(AmnesicShellfishPoison,ASP)和西加魚(yú)毒素(CiguateraFishPoison,CFP)等。其中,DSP毒素是近年來(lái)受到密切關(guān)注的一類藻毒素。在以往研究中,通常將DSP毒素分為三類:即酸性毒素大田軟海綿酸(Okadaicacid,OA)及其衍生物鰭藻毒素(Dinophysistoxins,DTXs),聚醚內(nèi)酯類毒素(Pectenotoxins,PTXs)和帶有硫酸基團(tuán)的聚醚類毒素(Yessotoxins,YTXs)。但是,后兩類毒素實(shí)際上不會(huì)導(dǎo)致腹瀉癥狀,而OA和DTX毒素能夠抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶PP1和PP2A,從而誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的超磷酸化,不僅會(huì)使中毒患者出現(xiàn)腹瀉等癥狀,而且會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,具有促進(jìn)腫瘤形成的長(zhǎng)期毒性效應(yīng)。因此,OA和DTX等DSP毒素是水產(chǎn)品質(zhì)量控制中需要密切關(guān)注的一類毒素,迫切需要開(kāi)展全面的檢測(cè)和分析工作。但是,DSP標(biāo)準(zhǔn)毒素價(jià)格昂貴,這在很大程度上制約著對(duì)DSP毒素檢測(cè)和分析工作的開(kāi)展。根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道,鰭藻屬(Dinophysis)和原甲藻屬(Prorocentrum)中的一些藻種能夠產(chǎn)生DSP毒素如Dinophysisfortii,D.acuminata,D.acuta,Dnorvegica,D.mitra,D.rotundata,D.tripos,D.caudata,D.hastate,D.sacculus和Prorocentrumlima、Pconcavum、P.redfieldi等。但鰭藻屬中藻種的培養(yǎng)非常困難,近年來(lái)雖然有所突破,但要依靠現(xiàn)有技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)鰭藻的大量連續(xù)培養(yǎng)仍然存在問(wèn)題。因此,從實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的利瑪原甲藻中分離純化DSP毒素是獲取DSP毒素的重要來(lái)源。在我國(guó),DSP毒素污染問(wèn)題比較突出。對(duì)我國(guó)沿海貝類中毒素污染情況進(jìn)行的調(diào)查顯示,遼東灣、膠州灣、萊州灣、秦皇島、福建等地沿海的貝類均有受到DSP毒素污染的報(bào)道。1998年9～10月渤海灣曾發(fā)生大面積赤潮,其原因種之一就是能夠產(chǎn)生DSP毒素的倒卵形鰭藻?？梢?jiàn),在我國(guó)開(kāi)展DSP毒素的研究非常重要。本文針對(duì)一株利瑪原甲藻(ProrocentrumlimaDodge),分析其毒素產(chǎn)生情況,并通過(guò)設(shè)計(jì)多因子實(shí)驗(yàn)探討了溫度、鹽度和光照強(qiáng)度等環(huán)境因子對(duì)利瑪原甲藻生長(zhǎng)的影響,以期獲得這株利瑪原甲藻的最適培養(yǎng)條件,為開(kāi)展DSP研究奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1中心和藻株利瑪原甲藻購(gòu)自美國(guó)Bigelow海洋科學(xué)實(shí)驗(yàn)室海洋浮游植物培養(yǎng)中心(Provasoli-GuillardNationalCenterforCultureofMarinePhytoplankton,CCMP),藻株編號(hào)CCMP1966。1.2天然海水的制備培養(yǎng)利瑪原甲藻所用的海水取自中國(guó)科學(xué)院海洋研究所水族樓,是經(jīng)沙濾處理后的青島匯泉灣天然海水,鹽度為31,pH為7.9±0.1,海水以0.45μm混合纖維濾膜過(guò)濾后,煮沸滅菌,并轉(zhuǎn)至高壓滅菌的錐形瓶?jī)?nèi),添加f/2-Si培養(yǎng)液后,接入利瑪原甲藻,在20oC,4800lx下培養(yǎng),光暗比為12h︰12h。1.3毒素成分分析利瑪原甲藻毒性的測(cè)試采用小鼠腹腔注射法,用于毒性測(cè)試的昆明系小白鼠(體重為20g±1g)購(gòu)自青島藥物研究所。取穩(wěn)定期的利瑪原甲藻培養(yǎng)液300mL,濾至玻璃纖維濾膜上,用剪刀剪碎后,加入甲醇/丙酮提取液(體積比40︰60,含0.3%乙酸)4mL,振蕩4min后,靜置提取過(guò)夜。提取液以8000r/min離心8min,取出上清液至10mL容量瓶中,重復(fù)提取一次,合并上清液,定容至10mL,置于-20oC保存。分別取0.9,3,5.1mL藻毒素提取液,氮?dú)獯蹈珊?加入3mL1%吐溫-60試劑溶解后,分別取1mL腹腔注射3只小白鼠。對(duì)照組直接注射1%吐溫-60試劑。觀察其存活狀況24h。采用液-質(zhì)聯(lián)用方法對(duì)利瑪原甲藻產(chǎn)生的毒素進(jìn)行分析。將培養(yǎng)的利瑪原甲藻藻液200mL過(guò)濾到玻璃纖維濾膜上,剪碎,置于7mL離心管中,加入3mL酸化甲醇水提取液(甲醇:0.05mol/L乙酸=9︰1),振蕩1min后,置于超聲水浴中超聲處理10min,于4℃下靜置提取過(guò)夜,提取液8000r/min離心10min后,取上清液以0.22uf06dm濾膜過(guò)濾,濾液用于分析DSP毒素成分。毒素分析采用美國(guó)熱電公司(ThermoFinnigan,SanJose,CA,USA)制造的LC-MS系統(tǒng),其中HPLC系統(tǒng)配備低壓混合四元泵和自動(dòng)進(jìn)樣器,質(zhì)譜檢測(cè)器為FinniganLCQTMDecaXPPlus離子阱檢測(cè)器,配備ESI離子化源。通過(guò)OA標(biāo)準(zhǔn)毒素的流動(dòng)注射分析,優(yōu)化質(zhì)譜檢測(cè)器參數(shù)為:毛細(xì)管溫度275oC,離子噴射電壓3.0kV,鞘氣流35arb毛細(xì)管電壓23V,入口透鏡電壓為-74V,透鏡電壓為-18V,電子管透鏡補(bǔ)償為25V,多孔補(bǔ)償電壓1為-4.5V,多孔補(bǔ)償電壓2為-9.5V,多孔射頻振幅為400Vp-p。采用選擇離子檢測(cè)(selectiveionmonitoring,SIM)方式,在陽(yáng)離子檢測(cè)模式下檢測(cè)OA和DTX1,每一毒素分別檢測(cè)三種陽(yáng)離子,質(zhì)荷比分別為[OA+H]+:805.0;[OA+NH4]+:822.0;[OA+Na]+827.0;[DTX1+H]+:819.0;[DTX1+NH4]+:836.0[DTX1+Na]+:841.0。用于分離OA和DTX毒素的色譜柱為PhenomenexLunaC18柱(150×2.0mm,3μm100?),配備C18保護(hù)柱套(PhenomenexATO-42874×3mm)。采用兩相洗脫液,洗脫液A為水溶液,含有2mmol/L甲酸和50mmol/L甲酸銨,洗脫液B為95%乙腈溶液,含有2mmol/L甲酸和50mmol/L甲酸銨。用30%洗脫液A和70%洗脫液B等梯度洗脫流速150uf06dL/min。樣品注射量10μL。用于對(duì)比的OA和DTX1標(biāo)準(zhǔn)毒素分別購(gòu)自加拿大國(guó)家科學(xué)院海洋生物學(xué)研究所和日本。1.4多因子影響實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)于中國(guó)科學(xué)院海洋研究所水族樓實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。選擇溫度、鹽度和光照三種環(huán)境因子,根據(jù)這株利瑪原甲藻分離地環(huán)境條件及實(shí)驗(yàn)室條件,對(duì)三種因子分別選取三個(gè)水平,其中溫度為18、21和24oC鹽度為28、32和36,光照強(qiáng)度為2500、5000和7500lx,進(jìn)行多因子影響實(shí)驗(yàn),總計(jì)27個(gè)處理組,每組設(shè)置三個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)在人工光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行,容器為100mL玻璃錐形瓶,事先經(jīng)高壓滅菌消毒。實(shí)驗(yàn)中所用的不同鹽度海水是通過(guò)以蒸餾水稀釋天然海水、或向天然海水中補(bǔ)加氯化鈉獲得。接種用的利瑪原甲藻為處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期的藻,其中,用于接種不同鹽度實(shí)驗(yàn)組的藻預(yù)先在各實(shí)驗(yàn)鹽度下進(jìn)行適應(yīng)培養(yǎng)后再用于接種。對(duì)各處理組中的利瑪原甲藻進(jìn)行觀察,并從培養(yǎng)當(dāng)天(0天)開(kāi)始取樣計(jì)數(shù),此后每隔2天取樣一次樣品以魯格試液(Lugol’ssolution)固定后,在顯微鏡下用浮游植物計(jì)數(shù)框計(jì)數(shù),記錄細(xì)胞密度,并計(jì)算細(xì)胞比增長(zhǎng)率μ:其中:Bt1和Bt2分別是培養(yǎng)t1和t2天后的細(xì)胞密度,t1和t2為培養(yǎng)天數(shù)。1.5利瑪原甲藻的生長(zhǎng)顯著性分析應(yīng)用多因素方差分析方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,通過(guò)F檢驗(yàn)分析各環(huán)境因子不同處理水平對(duì)利瑪原甲藻生長(zhǎng)影響的顯著性,按概率(P<0.05)設(shè)置顯著性檢驗(yàn)閾值。2結(jié)果分析2.1利瑪原甲藻的數(shù)字質(zhì)譜檢測(cè)通過(guò)小鼠生物測(cè)試法對(duì)培養(yǎng)利瑪原甲藻的DSP毒性進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果如表1所示,注射利瑪原甲藻提取液的實(shí)驗(yàn)組都有小鼠死亡現(xiàn)象出現(xiàn),而且,隨著毒素提取液注射量的增加,死亡小鼠比例增加。實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組小鼠未死亡?？梢钥闯?培養(yǎng)的利瑪原甲藻具有DSP毒性,可能產(chǎn)生DSP毒素。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,實(shí)驗(yàn)組2(注射1.0mL提取液)毒性最接近1個(gè)鼠單位,以此計(jì)算,每100mL培養(yǎng)液中利瑪原甲藻的毒性應(yīng)在3.3MU(mouseunit,鼠單位)左右。應(yīng)用液-質(zhì)聯(lián)用分析方法,通過(guò)與OA和DTX1標(biāo)準(zhǔn)毒素進(jìn)行對(duì)比,對(duì)利瑪原甲藻提取液中的OA和DTX1毒素進(jìn)行了分析,得到色譜圖如圖1所示?？梢钥闯?在利瑪原甲藻提取液中存在OA和DTX1毒素。在針對(duì)每一毒素的三種陽(yáng)離子檢測(cè)結(jié)果中,質(zhì)荷比為827.0和841.0的陽(yáng)離子[OA+Na]+和[DTX1+Na]+信號(hào)最高,而另外兩種陽(yáng)離子的信號(hào)較弱。對(duì)比OA和DTX1標(biāo)準(zhǔn)毒素,計(jì)算得到每100mL培養(yǎng)的利瑪原甲藻中,OA和DTX1的含量分別為2.2鹽度和光照對(duì)利瑪原甲藻生長(zhǎng)的影響采用比增長(zhǎng)率作為指標(biāo),比較了不同水平的溫度、鹽度和光照強(qiáng)度等環(huán)境因子對(duì)利瑪原甲藻生長(zhǎng)的影響,結(jié)果如圖2所示。應(yīng)用多因素方差分析方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析(表2),可以看出,在三種環(huán)境因子中,只有不同水平的鹽度對(duì)利瑪原甲藻的生長(zhǎng)具有顯著影響(F值為5.45,大于F0.05(2,54)=3.16),對(duì)于不同水平的鹽度處理組,鹽度為28時(shí)利瑪原甲藻的比增長(zhǎng)率最高,達(dá)到0.18,而當(dāng)鹽度分別為32和36的時(shí)候,平均比增長(zhǎng)率為0.16。溫度和光照實(shí)驗(yàn)各水平對(duì)利瑪原甲藻生長(zhǎng)的影響沒(méi)有顯著差異(F值分別為1.74和1.69,小于F0.05(2,54)=3.16)但低溫(18oC)和高光照(7500lx)下,利瑪原甲藻表現(xiàn)出了較高的比增長(zhǎng)率,分別達(dá)到0.18和0.17。此外溫度和鹽度及溫度和光照強(qiáng)度之間的交互作用對(duì)利瑪原甲藻的生長(zhǎng)也有顯著影響,而鹽度和光照強(qiáng)度之間的交互作用沒(méi)有顯著影響,三者之間的交互作用對(duì)利瑪原甲藻的生長(zhǎng)也沒(méi)有顯著影響。3利瑪原甲藻的生長(zhǎng)和環(huán)境因子之間的關(guān)系利瑪原甲藻是一種重要的DSP產(chǎn)毒藻。但是,目前國(guó)內(nèi)對(duì)于利瑪原甲藻的研究開(kāi)展的并不多本實(shí)驗(yàn)初步分析了一株利瑪原甲藻的毒性情況,并研究了溫度、鹽度和光照強(qiáng)度等環(huán)境因子對(duì)利瑪原甲藻生長(zhǎng)的影響,以期建立最適培養(yǎng)條件,為利瑪原甲藻的培養(yǎng)和DSP毒素研究提供依據(jù)。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)小鼠生物測(cè)試法和液-質(zhì)聯(lián)用分析方法,確定了所培養(yǎng)的利瑪原甲藻具有腹瀉性貝毒毒性,并檢出了OA和DTX1兩種DSP毒素成分。對(duì)于其他可能存在的DSP毒素,由于缺少標(biāo)準(zhǔn)毒素在此未作分析。目前,DSP小鼠生物測(cè)試法還是一種半定量的毒性測(cè)試方法,無(wú)法給出準(zhǔn)確的毒性測(cè)試結(jié)果。但是,根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的毒素分析和毒性測(cè)試結(jié)果計(jì)算,每100mL培養(yǎng)的利瑪原甲藻中所含有的OA和DTX的量,其毒性約為2.8MU,與小鼠生物測(cè)試法所得到的結(jié)果大致相當(dāng),表明OA和DTX1應(yīng)當(dāng)是利瑪原甲藻所產(chǎn)生的主要毒素成分。由于利瑪原甲藻是一種底棲或附生性海洋甲藻極少形成高密度藻華,因此,對(duì)于其生長(zhǎng)及其與環(huán)境因子之間的關(guān)系研究不多。在野外調(diào)查中發(fā)現(xiàn),利瑪原甲藻的豐度表現(xiàn)出一定的區(qū)域和季節(jié)差異。Carlson和Tindall在VirginIslands的調(diào)查發(fā)現(xiàn),利瑪原甲藻豐度的變化和溫度有正相關(guān)性。Morton等對(duì)從美國(guó)佛羅里達(dá)州采集的利瑪原甲藻進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)利瑪原甲藻的最適溫度是27oC,最適鹽度為30,最適光照強(qiáng)度為10%全日光,有關(guān)最適溫度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本文有明顯不同。本實(shí)驗(yàn)中利瑪原甲藻(CCMP1996株)的最適溫度為18oC,最佳生長(zhǎng)鹽度為28,而光照強(qiáng)度為7500lx。但是,在各因子的實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),不同水平的溫度和光照對(duì)于利瑪原甲藻的生長(zhǎng)并沒(méi)有顯著影響。由于本實(shí)驗(yàn)所用的利瑪原甲藻采自緬因?yàn)澈Ｓ?水溫偏低,因此,實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異可能是藻株對(duì)其生長(zhǎng)環(huán)境長(zhǎng)期適應(yīng)的結(jié)果。利瑪原甲藻是底棲性或附生性甲藻,盡管在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)過(guò)程中,有一部分藻細(xì)胞處于浮游狀態(tài),但仍有相當(dāng)一部分藻細(xì)胞結(jié)合在一起,呈絮狀或網(wǎng)狀附著在錐形瓶底,給實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的取樣和計(jì)數(shù)帶來(lái)了很大的困難。以往文獻(xiàn)曾報(bào)道有多種能夠反映藻類生長(zhǎng)的指標(biāo),如細(xì)胞顯微計(jì)數(shù)、葉綠素a分析、分光光度法(比濁法)、庫(kù)爾特計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)等,但這些指標(biāo)在應(yīng)用于利瑪原甲藻生物量測(cè)定時(shí)都存在一定的問(wèn)題,葉綠素a含量測(cè)定耗時(shí)長(zhǎng),不利于連續(xù)測(cè)定;而分光光度法和其他幾種計(jì)數(shù)方法都會(huì)不同程度地受到絮狀結(jié)塊的利瑪原甲藻細(xì)胞影響,降低測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。為盡可能準(zhǔn)確反映利瑪原甲藻生長(zhǎng)的情況,我們選擇了傳統(tǒng)的顯微計(jì)數(shù)方法,同時(shí)在取樣時(shí)振搖錐形瓶,并用原培養(yǎng)液沖洗幾次培養(yǎng)瓶,增加對(duì)每組實(shí)驗(yàn)的計(jì)數(shù),以盡量降低取樣和計(jì)數(shù)誤差。此外,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),在藻細(xì)胞培養(yǎng)初期,培養(yǎng)液中藻細(xì)胞密度相對(duì)較低計(jì)數(shù)結(jié)果受誤差影響較大,重現(xiàn)性低。進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,隨著藻細(xì)胞密度的逐漸增加,取樣和計(jì)數(shù)誤差對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果的影響有所降低。因此,為盡可能降低取樣和計(jì)數(shù)誤差的影響,比增長(zhǎng)率的計(jì)算都選在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期進(jìn)行,也就是從接種后一周左右開(kāi)始計(jì)算此后10天