沈萍微生物學(xué)第七章

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第七章病毒非細(xì)胞微生物本節(jié)重點(diǎn)病毒的特征與定義病毒的噬菌斑法測定病毒的模式結(jié)構(gòu)病毒的三種基本對稱形式

第一節(jié)概述一.病毒的發(fā)現(xiàn)二.病毒的特點(diǎn)與定義特征：

1.超顯微，非細(xì)胞生物

2.DNA或RNA+蛋白質(zhì)

3.專性細(xì)胞內(nèi)寄生

4.以核酸復(fù)制，核蛋白裝配增殖

5.離體條件-大分子存在（保持侵染活力）

6.對干擾素敏感定義：

病毒是一類由核酸和蛋白質(zhì)等少數(shù)幾種成分組成的超顯微“非細(xì)胞生物”，其本質(zhì)是一種只含DNA或RNA的遺傳因子，它們能以感染態(tài)和非感染態(tài)兩種狀態(tài)存在。在宿主體內(nèi)具生命特征，在離體條件下以大分子狀態(tài)存在，保持侵染性－－－周德慶1999年報(bào)告了4000余種病毒真病毒至少含核酸和蛋白質(zhì)非細(xì)胞生物類病毒侵染性RNA

亞病毒衛(wèi)星病毒非侵染性RNA

朊病毒

蛋白質(zhì)二.病毒的宿主范圍原核生物--噬菌體真菌---真菌病毒植物------植物病毒動(dòng)物------動(dòng)物病毒三.病毒的分類

dsDNA，ssDNA，dsRNA，+ssRNA,-ssRNA，逆轉(zhuǎn)錄DNA或RNA，裸露的RNA病毒，亞病毒第二節(jié)病毒學(xué)研究的基本方法一.病毒的分離和純化1.病毒的分離（1）標(biāo)本的采集與處理加抗生素除菌離心、過濾破碎細(xì)胞－－低溫保存、運(yùn)輸；（2）標(biāo)本接種與感染表現(xiàn)接種細(xì)菌－－噬菌斑噬菌斑的概念接種單層細(xì)胞－－空斑或蝕斑接種植物葉片－－壞死斑或枯斑噬菌斑噬菌體標(biāo)本經(jīng)過適當(dāng)稀釋再接種細(xì)菌平板，經(jīng)過一定時(shí)間培養(yǎng)，在細(xì)菌菌苔上可形成圓形局部透明區(qū)域，為噬菌斑。

直徑1-3mm左右------負(fù)菌落噬菌體---原核生物的病毒

1987年電鏡觀察過2850種噬菌體,其中2700種有尾。包括蝌蚪狀（dsDNA）、球狀（ssDNA、ssRNA）、絲狀（ssDNA）。溫和噬菌體烈性噬菌體

空斑和病斑以單層動(dòng)物細(xì)胞受動(dòng)物病毒侵染產(chǎn)生的透明斑為空斑。腫瘤病毒感染單層動(dòng)物細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞劇增。稱為病斑枯斑植物病毒接種敏感植物葉片產(chǎn)生的壞死斑為枯斑2.病毒的純化（1）按照純化蛋白質(zhì)方法---鹽析，等電點(diǎn)沉淀有機(jī)溶劑沉淀、凝膠層析、離子交換等；（2）根據(jù)顆粒的大小，采用超速離心法10,000~100,000g的離心場中1～2小時(shí)沉降，二.病毒的測定1.用電鏡直接計(jì)數(shù)2.病毒的感染性測定－－效價(jià)測定（1）蝕（噬）斑測定（雙層平板法）一個(gè)病毒（噬菌體）產(chǎn)生一個(gè)噬（蝕）斑底層平板（~2%瓊脂培養(yǎng)基7-8ml)37℃計(jì)數(shù)雙層上層1%培養(yǎng)基3ml10余h噬菌斑平板法上層平板宿主菌懸液0.2ml混勻噬菌體試樣0.1ml（2）終點(diǎn)法半數(shù)效應(yīng)劑量半數(shù)致死劑量LD50半數(shù)感染劑量ID50三.病毒的鑒定1.根據(jù)病毒感染的宿主范圍及感染表現(xiàn)的鑒定2.病毒的理化性質(zhì)鑒定3.血細(xì)胞凝集性質(zhì)鑒定4.病毒的血清學(xué)鑒定5.病毒鑒定的分子生物學(xué)方法第三節(jié)毒粒性質(zhì)一.毒粒的形態(tài)結(jié)構(gòu)1．病毒的大?。?/p>

用nm

表示，大小差異較大小的病毒，植物的雙粒病毒直徑18--20nm

口蹄疫病毒21nm

菜豆畸矮病毒9--11nm大的病毒，痘病毒大小300～450nm×170～260nm最長病毒,

柑桔衰退病毒2000nm最細(xì)病毒,

大腸桿菌f1噬菌體5×800nm2、病毒的形態(tài)3、病毒的基本結(jié)構(gòu)無囊膜病毒模式結(jié)構(gòu)有囊膜病毒模式結(jié)構(gòu)衣殼衣殼粒核酸衣殼刺突病毒粒子核衣殼（基本結(jié)構(gòu)）囊膜有刺突（非基本結(jié)構(gòu)）芯髓（核酸）衣殼

DNA/RNA基因組：雙股/單股分段/不分段多肽（結(jié)構(gòu)亞單位）殼粒（形態(tài)亞單位）病毒粒子的組成及成分病毒的基本結(jié)構(gòu)表解（1）螺旋對稱殼體

煙草花葉病毒（TMV）病毒表面的衣殼粒有規(guī)律地螺旋排列，形成一中空柱，核酸（ssRNA）位于衣殼內(nèi)側(cè)螺旋狀溝內(nèi)。TMV給煙草帶來極大的危害病毒的結(jié)構(gòu)類型（２）二十面體對稱殼體

腺病毒腺病毒252個(gè)衣殼粒，排成二十面體結(jié)構(gòu)，核酸位于中心多瘤病毒72個(gè)衣殼粒；脊髓灰質(zhì)炎病毒32個(gè)衣殼粒。（3）雙對稱殼體

T4噬菌體蝌蚪形：頭部、頸部、尾部三部分頭部為20面體結(jié)構(gòu)尾部為螺旋對稱結(jié)構(gòu)病毒的殼體結(jié)構(gòu)類型表解螺旋對稱結(jié)構(gòu)二十面體對稱結(jié)構(gòu)復(fù)合對稱結(jié)構(gòu)

無囊膜桿狀：煙草花葉病毒等絲狀：大腸桿菌M13噬菌體等卷曲狀：流感病毒等彈狀：狂犬病毒等有囊膜無囊膜有囊膜：皰疹病毒小型：脊髓灰質(zhì)炎病毒大型：腺病毒有囊膜：痘病毒（磚塊狀）無囊膜：大腸桿菌T偶數(shù)噬菌體（蝌蚪狀）病毒結(jié)構(gòu)類型病毒殼體結(jié)構(gòu)類型圖示二.毒粒的化學(xué)組成1

、病毒的核酸：核酸是病毒的遺傳物質(zhì)，一種病毒只含有一種核酸。類型：+ssDNA,-ssDNA,dsDNA,dsRNA-ssRNA,+ssRNA動(dòng)物病毒-----有些是DNA，有些是RNA(ds

ss)

植物病毒--------大部分是RNA(ds

ss)

噬菌體----------大部分是DNA（ds

ss）藻類病毒-------雙鏈DNA結(jié)構(gòu)：逆轉(zhuǎn)病毒5-cap,3-polyA,分段基因組，黏性末端，循環(huán)排列，末端重復(fù)，含量：1%--50%

流感V1%TMV5%T2噬菌體50%2.病毒蛋白質(zhì)功能1.主要是構(gòu)成病毒粒子的外殼，保護(hù)病毒核酸；2.決定病毒感染的特異性，與宿主特異親和；3.具有抗原性，能刺激集體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。種類：1.結(jié)構(gòu)蛋白：有感染性的病毒所必需----------殼體蛋白，包膜蛋白2.非結(jié)構(gòu)蛋白：病毒復(fù)制所需的蛋白－－-----毒粒酶一些簡單病毒僅由一種或幾種蛋白質(zhì)構(gòu)成，一些復(fù)雜的可多達(dá)20余種。３．其他成分病毒的脂類：存在于包膜中，來源于宿主細(xì)胞，50-60%為磷脂，余下為膽固醇，構(gòu)成脂雙層結(jié)構(gòu)病毒的糖類：糖蛋白，粘多糖，糖脂形式與宿主有關(guān)噬菌體種類T2，T4λT3，T7M13?X174?6dsDNAssDNAssRNAMs2dsRNA思考題真病毒與亞病毒，噬菌斑與枯斑，繪制病毒模式結(jié)構(gòu)繪制大腸桿菌T4噬菌體結(jié)構(gòu)病毒區(qū)別其他生物的特征第七章病毒

（續(xù)）本節(jié)重點(diǎn)病毒的一步生長曲線病毒增殖的五個(gè)階段各類亞病毒的特征第四節(jié)病毒的復(fù)制一.病毒的復(fù)制周期

1.一步生長曲線吸附期隱蔽期潛伏期裂解量相對病毒濃度/感染單位時(shí)間潛伏期：從病毒核酸侵入到開始釋放子代病毒粒子的時(shí)間。大腸桿菌約25min隱蔽期：從從病毒核酸侵入到細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)新的感染性病毒的時(shí)間。裂解量：每個(gè)受染細(xì)胞所釋放產(chǎn)生的子代病毒數(shù)目，幾十到上千個(gè)。

裂解量=

平穩(wěn)期的平均噬菌斑數(shù)/潛伏期的平均噬菌斑數(shù)2.病毒的復(fù)制周期

吸附釋放侵入（脫殼）

裝配病毒大分子合成

二.感染的過程1.吸附病毒-----吸附蛋白寄主-----細(xì)胞受體不同噬菌體吸附的位點(diǎn)不同，如脂多糖、脂蛋白、磷壁酸、鞭毛等，吸附可以受外界條件的影響，如陽離子、輔助因子、pH、溫度等。感染復(fù)數(shù)（m.o.i）－－－每一個(gè)敏感細(xì)胞所能吸附的相應(yīng)噬菌體的數(shù)量稱之．

m.o.i一般可達(dá)到250-360，超大m.o.i可引起自外裂解2.侵入噬菌體

尾部水解酶水解CW為一孔注入核酸留殼于外T4噬菌體從吸附到侵入只需15秒，吸附引起構(gòu)象變化，將核酸注入宿主細(xì)胞內(nèi)，而蛋白質(zhì)外殼留在細(xì)胞外，如果兩種以上侵入，只有一種得以增殖。1、吸附2、侵入動(dòng)物病毒

移位內(nèi)吞融合

脫殼----脫殼酶植物病毒

傷口進(jìn)入（人為，機(jī)械，自然）昆蟲口器嫁接3.病毒大分子合成病毒核酸復(fù)制病毒核酸轉(zhuǎn)錄病毒蛋白質(zhì)翻譯T4噬菌體的dsDNA，

早期轉(zhuǎn)錄------早期蛋白酶次早期轉(zhuǎn)錄-----次早期蛋白酶晚期轉(zhuǎn)錄------晚期蛋白（結(jié)構(gòu)蛋白等）4.成熟裝配噬菌體頭加尾鞘尾絲V粒子TMV17衣殼粒20S加RNA螺旋動(dòng)物病毒殼體核殼V粒子核酸包膜5.釋放

T4---溶菌

M13---通過CW分泌

動(dòng)物V---芽出植物V---胞間連絲擴(kuò)散釋放量大腸桿菌T系列15---25min

T2為150個(gè)，T4為100個(gè)思考題1、一步生長曲線2、以噬菌體為例，敘述病毒增殖各個(gè)階段的主要過程。第七章病毒

（續(xù)）本章重點(diǎn)缺損病毒與整合感染溫和噬菌體各類亞病毒因子的特征第五節(jié)病毒的非增殖性感染一.非增殖性感染的類型1.流產(chǎn)感染2.限制性感染二.缺損病毒1.干擾缺損顆粒2.衛(wèi)星病毒3.條件缺損病毒4.整合的病毒基因組烈性噬菌體概念動(dòng)物病毒整合感染逆轉(zhuǎn)錄V

（1）.溫和噬菌體和溶源菌整合在宿主染色體上的噬菌體DNA

為前噬菌體，或原噬菌體原噬菌體一旦脫離宿主DNA就開始復(fù)制，引起宿主裂解（10-5）。自發(fā)裂解誘發(fā)裂解溫和噬菌體與溶原性（lysogeny）

某些噬菌體侵染細(xì)菌后，將自身基因組整合到細(xì)菌細(xì)胞染色體上，隨寄主細(xì)胞分裂而同步復(fù)制，并不引起細(xì)菌裂解釋放噬菌體，因而被稱作溫和噬菌體（temperatephage）。

溫和性噬菌體的三種狀態(tài)：游離態(tài)、原噬菌體態(tài)、營養(yǎng)期噬菌體這種噬菌體與細(xì)菌共存的特性稱為溶原性（lysogeny），被侵染的細(xì)胞被稱作溶原性細(xì)胞或溶原菌（lysogen），

整合到細(xì)菌細(xì)胞染色體上的病毒被稱作前病毒或前噬菌體（prophage）。細(xì)胞反復(fù)分裂溶原途徑裂解途徑λ噬菌體的裂解和溶原途徑誘導(dǎo)常見的溫和性噬菌體

大腸桿菌λ噬菌體

,Mu-1噬菌體P1、P2噬菌體

其中大腸桿菌λ噬菌體研究最清楚，

E.coliK12（λ）表示

cos位點(diǎn)------12個(gè)堿基對構(gòu)成的粘性末端第六節(jié)病毒與宿主的相互作用一、噬菌體感染對原核細(xì)胞的影響1、抑制宿主細(xì)胞大分子合成2、宿主限制系統(tǒng)的改變3、噬菌體釋放對細(xì)胞的影響4、溶源性感染對細(xì)胞的影響

（1）免疫性----原噬菌體阻遏蛋白作用（2）溶源轉(zhuǎn)變----噬菌體基因的作用二、病毒感染對真核細(xì)胞的影響1、致細(xì)胞病變效應(yīng)2、對宿主大分子合成的影響3、對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響三、機(jī)體的病毒感染1、機(jī)體病毒感染的類型2、構(gòu)成機(jī)體感染的因素病毒的群體特征

1．包涵體

某些病毒感染宿主細(xì)胞后，在宿主細(xì)胞中出現(xiàn)的顯微鏡可見的小體。有的的細(xì)胞質(zhì)（狂犬病毒）有的在細(xì)胞核（皰疹病毒）有的在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)都有（麻疹病毒）第七節(jié)亞病毒因子一.衛(wèi)星病毒

包裹在真病毒顆粒內(nèi)有缺陷的類病毒能編碼自身的殼體蛋白

侵染植物病毒（衛(wèi)星煙草花葉病毒）侵染動(dòng)物病毒（乙肝病毒）：丁型肝炎病毒二、衛(wèi)星RNA——包在輔助病毒殼體中不具編碼殼體蛋白的能力表7-4DI顆粒、衛(wèi)星病毒、衛(wèi)星RNA、類病毒性質(zhì)的比較性質(zhì)DI顆粒衛(wèi)星病毒衛(wèi)星RNA類病毒依賴輔助病毒復(fù)制是是是否特異性外殼殼體化否是否否輔助病毒外殼殼體化是否是否抑制輔助病毒復(fù)制是是是-與輔助病毒序列同源性是否否-在體內(nèi)和體外RNA的穩(wěn)定性低低高高二.朊病毒

100—200年前羊瘙癢病

70年代克--雅氏病

90年代瘋牛病

1.概念：一類能侵染動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)而復(fù)制的小分子蛋白質(zhì)。瘋牛病、羊瘙癢病、早老性癡呆的病源。

有極強(qiáng)的抗逆性。是正常細(xì)胞蛋白的改造物。借食物進(jìn)入消化道，再經(jīng)淋巴系統(tǒng)進(jìn)入大腦病羊神經(jīng)組織的海綿狀損傷蛋白質(zhì)感染因子的增殖方式有兩種解釋1、重折疊模型（refoldingmodel），認(rèn)為PrPSc分子起分子伴侶（molecularchaperone）的作用，能與PrPc分子相結(jié)合，誘使PrPc轉(zhuǎn)變成PrPSc，從而形成了PrPSc二聚體，2、晶種模型（Seedingmodel），認(rèn)為PrPc分子本身有向PrPSc轉(zhuǎn)變的傾向（一種平衡反應(yīng)），PrPSc能像晶種一樣，穩(wěn)定PrPc的構(gòu)象，形成淀粉樣蛋白沉淀，然后碎裂后又變成新的晶種。

Prion的結(jié)構(gòu)模型，左PrPc，右PrPSc

2.機(jī)制

PrPsc+PrPc2PrPsc

三.類病毒

概念－－只含環(huán)狀ssRNA專性細(xì)胞寄生的分子病原體目前已發(fā)現(xiàn)多種。侵染植物馬鈴薯紡錘形塊莖病病原體是359個(gè)核苷酸的單鏈環(huán)狀RNA分子組成，鏈內(nèi)有一些互補(bǔ)序列。分子長約40~50nm，不能制造衣殼蛋白。

第八節(jié)病毒舉例一、人免疫缺損病毒－HIV

1、概述：發(fā)現(xiàn)，分布傳染途徑性傳播為主血液制品母子2.HIV形態(tài)結(jié)構(gòu)外膜外殼核酸3、HIV基因組特點(diǎn)2條ssRNA5/－capm7G5/GmpNp3/－poly(A)兩端有LTR基因編碼重疊tat,rev基因有內(nèi)含子

HIV編碼蛋白的功能－－4、HIV的復(fù)制吸附侵入生物合成組裝裂解釋放RNAssDNA

dsDNA

整合宿主染體

原病毒宿主轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)長期潛伏

mRNA

HIV蛋白質(zhì)5、HIV致病機(jī)理、治療與預(yù)防

2－4周出現(xiàn)急性感染癥狀

5－6周進(jìn)入無癥狀潛伏期再次發(fā)作，HIV重新大量復(fù)制造成免疫系統(tǒng)損傷全身性淋巴腺病艾滋病相關(guān)綜合癥艾滋病治療劑核酸型反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑非核酸型反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑蛋白酶抑制劑預(yù)防－－疫苗致病機(jī)理二、SARS冠狀病毒1、病毒基因組正鏈RNA，27—29Kb，5/－cap、3/－poly(A)、7—10個(gè)基因2、病毒的復(fù)制+RNA-RNA+RNAmRNAPr病毒3、癥狀：4、傳播：三、乙型肝炎病毒－HBV1.HBV基因組結(jié)構(gòu)部分單鏈區(qū)的環(huán)狀dsDNA分子L鏈3.2Kb負(fù)鏈S鏈正鏈為負(fù)鏈的50－80％非常密集，高度壓縮，重復(fù)利用全為蛋白編碼區(qū)2、編碼區(qū)及產(chǎn)物

S編碼區(qū)乙肝表面抗原蛋白